－种从金边蚂蟥中制取蛋白肽的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种从金边蚂蟥中制取蛋白肽的方法。
【背景技术】
[0002] 水蛭又名蚂蟥，属环节动物蛭纲，体表无刚毛，前后端均有吸盘，体肌发达，体腔较 小，属高度特化的环节动物。据报道，世界上的蚂蟥超过500种，按食性分为吸血和非吸血 两大类，蚂蟥绝大部分生活在淡水中，咸水和咸淡水交汇处也有发现，也有少数生活在陆 上，如吸血的山蚂蟥就生活在山区的潮湿灌木林和草丛中，在国内，个体较大的是宽体金 线蛭，体长达30cm，重达40g，但最近在云南的瑞丽山区发现一种外表似金边蚂蟥，体重达 150g，个体最小是寡輕只有0. lg。
[0003] 水蛭依据其食性不同，可分为非吸血水蛭和吸血水蛭两大类：
[0004] 非吸血水蛭，它主要以田螺、福寿螺、河蚌等软体动物的汁液为食，不吸血，主产 于长江沿岸省份（如湖北、江苏等）的河流、湖泊。常见的是宽体金线蛭（Whitmanpigra Whitman)，它是我国药材市场上的主流品种，其体内含有目前尚未清楚的某些活血化瘀成 分，但不含水蛭素。
[0005] 吸血水蛭，主要分布在我国华南的广东、广西等省区，生活在稻田、水沟、 江河、池塘和湖泊中，以吸食人和脊椎动物血液为生，其中较为常见的是菲牛蛭 (PoecilobdellaManillensis Lesson，俗称金边蚂蟥，它已被广西壮族自治区食品药品监 督管理局收录入《广西壮族自治区壮药质量标准》第二卷（2011年版）。科学研究表明，由 吸血水輕的唾液腺及其所分泌的唾液中含有丰富的水輕素 hirudin、透明质酸酶Orgelase 以及血管扩张剂Vasolilator和麻醉剂Anaesthetic等多种生物活性物质，其中水輕素是 这些活性物质中数量最多、活性最显著并且研究得最多、最深入、最有药用价值和最具发展 潜力的一种活性物质。
[0006] 天然水蛭素自分离出纯品后，于20世纪70-80年代，便对其理化性质和化学结构 进行了深入研究，研究结果表明，水蛭素是由65-66个氨基酸残基组成的多肽物，分子量为 7000Da ·Ν端有3个二硫桥，由6个半胱氨组成，使N端肽链绕迭成环肽结构，C端富含酸性 氨基酸残基，具亲水性，游离于分子表面，肽链中部还有一个由Pro-Lys47-Pr 〇 (脯氨酸-赖 氨酸）组成的特殊序列，在C端最后9个氨基酸残基中有5个是酸性氨基酸，故又称酸性多 肽，此外居于63位的酪氨酸被硫酸化了。天然水蛭素的成份和结构序列弄清楚后，便开始 对人工重组水蛭素进行近10年的研究，得到产品与天然水蛭素极其相似，仅居于序列中63 位的酪氨酸未能硫酸化，产品应用时其抑制凝血酶的活性较低和引起出血的及单靶点等缺 陷，使用范围窄、副作用大、成本高等，因而应用受到极大限制。
[0007] 有研究表明，水蛭素主要存在于吸血蚂蟥的唾液腺和唾液中，不吸血的蚂蟥唾液 腺和唾液中均检不出水蛭素成份。在吸血的蚂蟥中不同的品种，不同地区，个体大小，野生 和养殖蚂蟥的采收期等因素均对水蛭素含量产生影响。目前，发现产于广东、广西、海南、云 南等省的北炜线21-23° -个狭长地带的野生金边蚂蟥（俗称牛蚂蟥）的水蛭素含量较高， 越冬后捕捉的最高含量达到1200ATU/g (整条干燥品的干基计），2015年5月底在广西北部 湾捕捉的水蛭素含量亦达到1020ATU/g。
[0008] 常规提取水蛭素的方法是将活吸血水蛭或冰鲜蛭解冻后，剪下头部或全体磨浆， 用乙醇分级沉析或用丙酮做萃取剂，获得水蛭素粗制品溶液，然后采用层析法、等电聚焦等 工序纯化，得到水蛭素。这些工艺方法均未涉及提取水蛭素后，大量蛋白质的利用，且常规 方法，使用大量溶剂，其污染性和安全性的控制存在一定风险。
[0009] 公开于该【背景技术】部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应 当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
【发明内容】
[0010] 为了克服现有技术的不足，本发明提供了一种从金边蚂蟥中制取蛋白肽的方法。
[0011] 为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
[0012] 一种从金边蚂蟥中制取蛋白多肽的方法，包括如下步骤：
[0013] (1)先用清水冲洗鲜蚂蟥或解冻蚂蟥体表的污染物，然后移入浓度为3%。高锰酸 钾溶液中，搅拌浸泡l〇_15min ;捞起后用清水洗掉高锰酸钾溶液，再将其移入浓度为5%氯 化钠溶液中搅拌浸泡lOmin，捞起后用清水洗去其体表的盐份，再用去离子水冲洗1次，沥 去水分，置于容器内；
[0014] (2)将蚂蟥体表消毒灭菌后，按蚂蟥重量计算，加入3%。亚硫酸氢钠，1 %。抗坏血酸 和3倍去离子水拌匀，投入胶体磨中研磨，研磨温度控制在小于50°C，得到蚂蟥浆液；
[0015] (3)将步骤（2)所得的蚂蟥浆液进行2次粗滤，合并2次粗滤的滤渣和滤液；
[0016] (4)将步骤（3)所得滤液用可拦截分子量30000Da的30000膜进行微滤，收集微滤 透过液；
[0017] (5)将微滤透过液进行2次超滤，第1次超滤选用10000膜；浓缩液加入上述粗滤 渣中，透过液进行第2次超滤，选用5000膜；透过溶液并入前述之滤渣中，所得浓液即为富 集含水蛭素溶液；
[0018] (6)把粗滤渣和微滤浓缩液及超滤1浓液、超滤2之透液，调pH值为9,投入有搅 拌装置，功率2-10KW的微波罐中，用2KW功率微波升温，控控温小于60°C，微波20min，在 55-60°C保温20min，排出冷却；
[0019] (7)将步骤（6)排出的溶液冷至45°C，用200目滤布三足离心机过滤，积累于滤布 的滤渣用无离子水适量喷淋，所得滤液即为蚂蟥蛋白溶液；
[0020] (8)将步骤（7)所得蚂蟥蛋白溶液，先用稀盐酸调pH值至6,然后再用10%冰醋 酸溶解2%的壳聚糖溶液调pH值至5,将蛋白沉析出来，静置1-2h，待溶液分层后弃去上 层液再用400目滤布离心过滤，得湿蛋白，加入2-3倍于湿蛋白量0. 75 %高锰酸钾溶液在 35-45Γ温度下浸泡I. 5-2h，然后用400目尼龙滤布脱去高锰酸钾并用清水冲洗1次，用 2-3倍于湿渣的0. 75%草酸溶液浸泡2-3h，观察蛋白颜色为白色时，即开始收集脱色蛋白；
[0021] (9)将脱色的湿蛋白用无离子水稀释，待蛋白质浓度达到7%时，调pH值为9,加入 底物质量3%的碱性酶搅拌均匀，置于带搅拌装置功率2-10KW微波罐中，启动2KW功率，当 酶解液升温到45°C时检测酶解液pH值，当pH值下降至7. 5以上8以下时，补碱调至8. 5， 酶解液升温至55°C再检1次pH值，当pH下降不到7. 8以下不再补碱，下降至7. 8以下时 补碱调至8,酶解液温度达到55°C时停止微波保留搅拌，待温度下降低于50°C后再启动2KW 功率微波待酶解液升温至55°C，关掉微波保留搅拌，待酶解液温度下降至45°C以下时检测 酶解液PH值，当pH低于8时补碱调至8,添加底物质量2. 5%的胰酶，启动2KW微波，酶解 液升温至50°C时，检查酶解液pH值，当pH下降低于或接近7时，补碱调至7. 8,继续微波升 温至55°C关掉微波，再检测pH，当pH下降至7. 3以下补碱调至7. 5,启动搅拌，待酶解液温 度下降至45°C再启动微功率2KW，酶解液升温至55°C，保温5分钟后，启动功率IOKW升温至 85-90°C，保温10分钟灭酶活；
[0022] (10)将灭酶活后的酶解液排出，冷却至40°C，在搅拌状态下，缓慢添加用含20% 冰醋酸溶解1. 5%的壳聚糖溶液，使pH值调至5,沉析未酶解的蛋白及其他大分子杂质等， 沉析液静置2小时，用400目滤布离心除去的沉析物即为蚂蟥蛋白，离心时先过滤上层液后 过滤浓液；
[0023] (11)将400目过滤所得的滤液，再用30000膜进行微滤；浓液合并入上述400目 粗滤渣中；
[0024] (12)步骤（11)所得微滤透过液进行2次超滤，第1次超滤用10000膜，第2次超 滤用5000膜，两次超滤的浓缩液合并进粗滤渣中；
[0025] (13)将步骤（12)中超滤2所得透过液进行钠滤；
[0026] (14)将步骤（13)中纳滤所得浓缩液，选用喷雾干燥法干燥，获得多肽；将步骤 (10)的滤渣，步骤（11)微滤之浓液、步骤（12)超滤之浓液合并选用喷雾干燥法干燥，获得 蚂蟥蛋白粉。
[0027] 本发明的技术方案中，步骤（2)中所得蚂蟥浆液的细度为18-20目。
[0028] 本发明的技术方案中，步骤（3)中所述的2次粗滤的具体操作为：第1次粗滤用 60-80目滤布在三足离心机过滤，积累于滤布的滤渣用适量无离子水喷淋1-2次；第2次粗 滤用200目在三足离机过滤，积累于滤布的滤渣用适