一种制备鱼皮胶原蛋白及ace抑制肽的方法
【专利摘要】一种制备鱼皮胶原蛋白及ACE抑制肽的方法，具体步骤：（1）将鱼皮经过去杂清洗，在-15~-8℃下冷冻3~5小时，然后放入行星磨中磨成颗粒度为150~200微米的粉末；（2）采用金属肽酶ProteaseA对鱼皮粉末进行酶解、灭酶，将酶解液过滤得到上清液和滤渣，上清液经浓缩、干燥得到鱼皮胶原蛋白；（3）采用A.S.1398酶对步骤（2）得到的胶原蛋白进行酶解、灭酶，冷却离心取上清液，经减压浓缩后冷冻干燥。本方法的原料来源广泛，工艺简单，可以提高鱼皮胶原蛋白及ACE抑制肽提取率和质量品质，提高其使用率和经济效益。
【专利说明】一种制备鱼皮胶原蛋白及ACE抑制肽的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及胶原蛋白提取【技术领域】，尤其是涉及一种从鱼皮中提取胶原蛋白的方法。
【背景技术】
[0002]我国水域广阔，水产品资源丰富，有大量水产品加工下脚料，其中的胶原蛋白含量丰富，但我国对此的开发利用程度较低。胶原蛋白是动物结缔组织的重要结构蛋白质，是动物体内含量最多的蛋白质，具有生物相容性好、生物降解性、免疫学性质，在食品工业及生物医学原料中都有广泛的应用。由胶原水解得到的胶原肽有许多生理活性功能，例如ACE抑制肽、抗肿瘤肽以及抗氧化肽等，从大量水产品加工下脚料制备胶原蛋白及ACE抑制肽不仅充分利用了资源，保护生态环境，提高了鱼类产品的附加值，且会带来巨大的社会效益和经济效益，所以以水产品为加工原料制备胶原蛋白及ACE抑制肽有广阔的前景。
[0003]目前，国内外胶原蛋白提取方法主要有碱法、酸法、酶法等。这些方法可能会造成胶原蛋白变性，甚至导致胶原蛋白的大量流失。尽管碱法生产的质量较高，但其存在生产周期长的缺陷，且生产效率低。酸碱法虽然简单，但都有不足之处，易对环境造成污染。因此，研究一种酶法制备鱼皮胶原蛋白的新方法一直受到人们的关注。
[0004]国内外制备ACE抑制肽的方法主要有化学降解法和酶降解法。化学法是用酸、碱等化学试剂在一定条件下促使蛋白质分子的肽链断裂形成小分子物质。酸法多采用盐酸、硫酸等强酸在高温下反应.反应强烈，设备腐蚀严重，水解彻底，多生成氨基酸混合物，但是这种方式下色氨酸等会被破坏，目前已渐被淘汰；碱法水解使氨基酸大多消旋，如使L-氨基酸形成D-氨基酸，还能形成有毒物质，无生物利用价值，因此不宜采用。
[0005]到了 20世纪80年代.随着酶制剂工业的迅速发展，人们发现酶法水解比传统的酸法、碱法提取更加温和、安全、专一性强，降解时间短，无环境污染，而且产品营养价值高，产物以多肽和L型游离氨基酸为主，易于人体消化吸收。在酶解法中酶水解条件温和对蛋白质的营养价值破坏小，蛋白质的水解过程易控制，而且酶可以对蛋白质进行定位水解进而产生人们所需要的特定肽类，酶解法的这些特点使得越来越多的人开始了酶解法制备ACE抑制肽的研究。因此，研究一种酶法制备鱼皮胶原蛋白ACE抑制肽的方法一直受到人们的关注。
【发明内容】
[0006]针对现有技术存在的上述问题，本 申请人:提供了一种制备鱼皮胶原蛋白及ACE抑制肽的方法。本方法的原料来源广泛，工艺简单，可以提高鱼皮胶原蛋白及ACE抑制肽提取率和质量品质，提高其使用率和经济效益。
[0007]本发明的技术方案如下:
一种制备鱼皮胶原蛋白及ACE抑制肽的方法，具体步骤如下:
(1)将鱼皮经过去杂，清洗，在_15'8°C下冷冻3飞小时，然后放入行星磨中磨成颗粒度为150-200微米的粉末；
(2)采用金属肽酶ProteaseA对鱼皮粉末进行酶解、灭酶，酶解条件为:鱼皮粉末浓度8~12%，酶解温度28~32°C，酶的添加量0.2~0.4%，酶解时间3~7h，酶解pH值为6~8，80~95°C灭酶5~15min，将酶解液过滤得到上清液和滤渣，上清液经浓缩、干燥得到鱼皮胶原蛋白；
(3)采用A.S.1398酶对步骤(2)得到的胶原蛋白进行酶解、灭酶，酶解条件为:酶解温度为40~55--C，鱼皮胶原蛋白浓度为3~7%，pH为6~8 ;水解反应结束后，用沸水浴灭酶l(T20min，然后冷却离心取上清液，经减压浓缩后冷冻干燥。步骤(3)中在冷却后离心20~40mino
[0008]所述行星磨为行星式球磨机。
[0009]本发明有益的技术效果在于:
1、鱼皮属于水产行业的下脚料，虽然鱼皮的蛋白质含量丰富，并且含有多种微量元素，但是由于鱼皮还含有大量的蛋白多糖及糖蛋白，通常胶原蛋白中的糖类并不是游离的，而是与羟赖氨酸的羟基以糖苷键紧密结合，阻碍胶原蛋白的提取，假如不经过预处理，酶解的效率就会大大降低。普通的预处理方法无法克服鱼皮组织之间的粘粘，而冷冻鱼皮则可以使之变脆，使后续的研磨变容易。
[0010]冷冻的温度不能太高，否则一来冷冻时间就要相应延长，降低了生产效率，二来无法将粘胶质彻底冻结，不便于后续的研磨；另一方面，冷冻的温度也不能太低，否则会使鱼皮中的胶原蛋白分子变脆 ，容易在后续的研磨中断裂。且冷冻时间需要控制好，即能够保证不影响研磨，又要防止鱼皮中的有用分子变脆断裂。
[0011]2、鱼皮除了含有大量粘胶质外，还含有脂肪，脂肪不溶于水，在后续的酶解中会变成悬浊液混在酶解液中，影响酶解效率，同时使提取的胶原蛋白纯度降低。
[0012]因此采用行星磨，不仅是因为行星磨的研磨效率非常高，而且在行星式球磨过程中，罐体内的球不仅随着球磨罐围绕主轴发生公转,球体本身还发生自转,类似于行星的运动，而且不仅如此，由于存在很多球体，还会同时伴随着球与球之间以及球与罐内壁之间的反复碰撞，因此球体会对物料发生多种作用力，包括碰撞力、摩擦力、冲击力、剪切力等,这些力从多角度、多方位粉碎冷冻的鱼皮，即可以保护胶原蛋白分子不被破坏，又可以将脂肪的分子间、以及脂肪与胶原蛋白之间的连接力降低，从而提高后续酶解的效率，并且提高在水中的溶解度。
[0013]3、冷冻后的鱼皮的研磨粒度为150-200微米，颗粒度过小虽然可以提高酶解效率，但是浪费时间，提高成本；颗粒度过大会影响酶解速度，因此150-200微米的颗粒度是酶解效率和生产时间的最佳综合参数。
[0014]4、本发明采用酶代浸灰法制备鱼皮胶原蛋白。酶代浸灰法是用酶液代替酸法或碱法中的酸或碱溶液处理原料，其他工序与碱法制胶相同，它对交联度高的胶原的处理效果更好。
[0015]5、本发明所采用的酶法不同于酸碱法制备鱼皮胶原蛋白及化学法制备ACE抑制肽，不仅提高了胶原蛋白和ACE抑制肽的提取率，且能有效地解决传统工艺带来的环境污染和安全隐患。
[0016]6、相较于哺乳动物胶原蛋白，鱼类胶原蛋白天然、纯净、无污染，不含脂肪，分子量较低，易吸收，在很多方面都是具有优势的，有广阔的应用前景。采用本发明所述工艺生产鱼皮胶原蛋白和ACE抑制肽能有效利用水产品下脚料，提高水产品附加值和资源利用率的同时，减轻对环境的压力，带来生态利益和经济利益。
[0017]7、本发明的技术生产工艺简单，生产周期短，生产用料来源丰富，且成本低廉，产品安全，无毒副作用，采用本发明提供的方法提取胶原蛋白和ACE抑制肽，品质优良，ACE抑制肽具有显著的降血压效果，而且提取率高，工艺简单，可产业化制造，节约了成本，在提高鱼类产品附加值的同时，也提高了生产企业的经济效益，另外该法对环境也不会造成污染。
【具体实施方式】
[0018]实施例1~3中所用的Protease A酶的生产厂家为日本天野酶制品株式会社(Amano Enzyme Inc.) ；A.S.1398中性蛋白酶的生产厂家为无锡杰能科酶制剂公司。
[0019]实施例1
本制备鱼皮胶原蛋白及ACE抑制肽的方法为:
(O将鱼皮经过去杂，清洗，在_15°C下冷冻3小时,然后放入行星磨中磨成颗粒度为200微米的粉末； (2)采用金属肽酶ProteaseA对鱼皮粉末进行酶解、灭酶，酶解条件为:鱼皮粉末浓度8%，酶解温度32°C，酶的添加量0.4%，酶解时间7h，酶解pH值为7.5，95°C灭酶5min，将酶解液过滤得到上清液和滤渣，上清液经浓缩、干燥得到鱼皮胶原蛋白，提取率为57.48% ；
(3)采用A.S.1398中性蛋白酶对步骤(2)得到的胶原蛋白进行酶解、灭酶，酶解条件为:酶解温度为55--C，鱼皮胶原蛋白浓度为3%，pH为7.5 ;水解反应结束后，用沸水浴灭酶20min，然后冷却离心40min，取上清液，经减压浓缩后冷冻干燥，肽得率为92.23%。
[0020]实施例2
本制备鱼皮胶原蛋白及ACE抑制肽的方法为:
(1)将鱼皮经过去杂，清洗，在_8°C下冷冻5小时,然后放入行星磨中磨成颗粒度为150微米的粉末；
(2)采用金属肽酶ProteaseA对鱼皮粉末进行酶解、灭酶，酶解条件为:鱼皮粉末浓度12%，酶解温度28°C，酶的添加量0.2%，酶解时间3h，酶解pH值为6.5，80°C灭酶15min，将酶解液过滤得到上清液和滤渣，上清液经浓缩、干燥得到鱼皮胶原蛋白，提取率为55.32% ；
(3)采用A.S.1398中性蛋白酶对步骤(2)得到的胶原蛋白进行酶解、灭酶，酶解条件为:酶解温度为50--C，鱼皮胶原蛋白浓度为5%，pH为7 ;水解反应结束后，用沸水浴灭酶15min，然后冷却离心30min，取上清液，经减压浓缩后冷冻干燥，肽得率为91.07%。
[0021]实施例3
本制备鱼皮胶原蛋白及ACE抑制肽的方法为:
(O将鱼皮经过去杂，清洗，在-10°C下冷冻4小时,然后放入行星磨中磨成颗粒度为180微米的粉末；
(2)采用金属肽酶ProteaseA对鱼皮粉末进行酶解、灭酶，酶解条件为:鱼皮粉末浓度5%，酶解温度30°C，酶的添加量0.3%，酶解时间5h，酶解pH值为7，90°C灭酶lOmin，将酶解液过滤得到上清液和滤渣，上清液经浓缩、干燥得到鱼皮胶原蛋白，提取率为55.39% ；
(3)采用A.S.1398中性蛋白酶对步骤(2)得到的胶原蛋白进行酶解、灭酶，酶解条件为:酶解温度为55--C，鱼皮胶原蛋白浓度为3%，pH为6.5 ;水解反应结束后，用沸水浴灭酶lOmin，然后冷却离心20min，取上清液，经减压浓缩后冷冻干燥，肽得率为90.45%。
[0022]实施例广3中，胶原蛋白的提取率可通过下式计算: k= (W2Zw1) X 100%
式中:k一胶原蛋白提取率，％;
W1—鱼皮中轻脯氨酸的含量，mg/g; w2—提取液中经脯氨酸的含量，mg/g。
[0023]肽得率的计算:
肽得率(％)=(酶解液中 的肽含量/鱼皮中总的蛋白含量)X100%。
【权利要求】
1.一种制备鱼皮胶原蛋白及ACE抑制肽的方法，其特征在于具体步骤如下: (1)将鱼皮经过去杂，清洗，在_15'8°C下冷冻3~5小时，然后放入行星磨中磨成颗粒度为150-200微米的粉末； (2)采用金属肽酶ProteaseA对鱼皮粉末进行酶解、灭酶，酶解条件为:鱼皮粉末浓度8~12%，酶解温度28~32°C，酶的添加量0.2~0.4%，酶解时间3~7h，酶解pH值为6~8，80~95°C灭酶5~15min，将酶解液过滤得到上清液和滤渣，上清液经浓缩、干燥得到鱼皮胶原蛋白； (3)采用A.S.1398酶对步骤(2)得到的胶原蛋白进行酶解、灭酶，酶解条件为:酶解温度为40~55--C，鱼皮胶原蛋白浓度为3~7%, pH为6~8 ;水解反应结束后，用沸水浴灭酶l(T20min，然后冷却离心取上清液，经减压浓缩后冷冻干燥。
2.根据权利要求1所述的制备鱼皮胶原蛋白及ACE抑制肽的方法，其特征在于，步骤(3)中在冷却后离心20~40min。
【文档编号】A61P3/06GK103923963SQ201410142466
【公开日】2014年7月16日 申请日期:2014年4月10日 优先权日:2014年4月10日
【发明者】唐亚丽, 卢立新, 雷亚君 申请人:江南大学