溶液，使pH值调至5,沉析未酶解的蛋白及其他大分子杂质等， 沉析液静置2小时，用400目滤布离心除去的沉析物即为蚂蟥蛋白，离心时先过滤上层液后 过滤浓液；
[0086] (11)将400目过滤所得的滤液，再用30000膜进行微滤；浓液合并入上述400目粗 滤渣中；微滤的操作参数为：压栗0. 2Mpa、pH值6. 5、温度45°C、膜面流速3M/S、浓缩比3. 5 倍；
[0087] (12)步骤（11)所得微滤透过液进行2次超滤，第1次超滤用10000膜，第2次超 滤用5000膜，两次超滤的浓缩液合并进粗滤渣中；第1次超滤和第2次超滤的操作参数为： 压栗0. 3Mpa、pH值5. 5、温度45°C、膜面流速2M/S、浓缩比5. 5倍；
[0088] (13)将步骤（12)中超滤2所得透过液进行钠滤；所述钠滤的操作参数为：压力 0. 8Mpa，循环流量2. 0m3/h，浓缩倍数8。
[0089] (14)将步骤（13)中纳滤所得浓缩液，选用喷雾干燥法干燥，获得多肽；将步骤 (10)的滤渣，步骤（11)微滤之浓液、步骤（12)超滤之浓液合并选用喷雾干燥法干燥，获得 蚂蟥蛋白粉。
[0090] 表1本发明从金边蚂蟥中制取蛋白多肽的方法的效果
[0092] 从表1可以看出，本发明从金边蚂蟥中制取蛋白多肽的方法得到蚂蟥多肽纯度均 在65 %以上，蚂蟥蛋白的酶解率均在39 %以上。
[0093] 前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述 并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变 和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应 用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及 各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。
【主权项】
1. 一种从金边蚂蟥中制取蛋白多肽的方法，其特征在于，包括如下步骤： (1) 先用清水冲洗鲜蚂蟥或解冻蚂蟥体表的污染物，然后移入浓度为3%。高锰酸钾溶 液中，搅拌浸泡l〇-15min;捞起后用清水洗掉高锰酸钾溶液，再将其移入浓度为5%氯化钠 溶液中搅拌浸泡lOmin，捞起后用清水洗去其体表的盐份，再用去离子水冲洗1次，沥去水 分，置于容器内； (2) 将蚂蟥体表消毒灭菌后，按蚂蟥重量计算，加入3%。亚硫酸氢钠，1%。抗坏血酸和3 倍去离子水拌匀，投入胶体磨中研磨，研磨温度控制在小于50°C，得到蚂蟥浆液； (3) 将步骤（2)所得的蚂蟥浆液进行2次粗滤，合并2次粗滤的滤渣和滤液； (4) 将步骤（3)所得滤液用可拦截分子量30000Da的30000膜进行微滤，收集微滤透过 液； (5) 将微滤透过液进行2次超滤，第1次超滤选用10000膜；浓缩液加入上述粗滤渣中， 透过液进行第2次超滤，选用5000膜；透过溶液并入前述之滤渣中，所得浓液即为富集含水 蛭素溶液； (6) 把粗滤渣和微滤浓缩液及超滤1浓液、超滤2之透液，调pH值为9,投入有搅拌 装置，功率2-10KW的微波罐中，用2KW功率微波升温，控控温小于60°C，微波20min，在 55-60°C保温20min，排出冷却； (7) 将步骤（6)排出的溶液冷至45°C，用200目滤布三足离心机过滤，积累于滤布的滤 渣用无离子水适量喷淋，所得滤液即为蚂蟥蛋白溶液； (8) 将步骤（7)所得蚂蟥蛋白溶液，先用稀盐酸调pH值至6,然后再用10%冰醋酸溶解 2%的壳聚糖溶液调pH值至5,将蛋白沉析出来，静置l-2h，待溶液分层后弃去上层液再用 400目滤布离心过滤，得湿蛋白，加入2-3倍于湿蛋白量0. 75%高锰酸钾溶液在35-45°C温 度下浸泡1. 5-2h，然后用400目尼龙滤布脱去高锰酸钾并用清水冲洗1次，用2-3倍于湿渣 的0. 75%草酸溶液浸泡2-3h，观察蛋白为白色时，即开始收集脱色蛋白； (9) 将脱色的湿蛋白用无离子水稀释，待蛋白质浓度达到7%时，调pH值为9,加入底 物质量3%的碱性酶搅拌均匀，置于带搅拌装置功率2-10KW微波罐中，启动2KW功率，当酶 解液升温到45°C时检测酶解液pH值，当pH值下降至7. 5以上8以下时，补碱调至8. 5,酶 解液升温至55°C再检1次pH值，当pH下降不到7. 8以下不再补碱，下降至7. 8以下时补碱 调至8,酶解液温度达到55°C时停止微波保留搅拌，待温度下降低于50°C后再启动2KW功 率微波待酶解液升温至55°C，关掉微波保留搅拌，待酶解液温度下降至45°C以下时检测酶 解液pH值，当pH低于8时补碱调至8,添加底物质量2. 5 %的胰酶，启动2KW微波，酶解液 升温至50°C时，检查酶解液pH值，当pH下降低于或接近7时，补碱调至7. 8,继续微波升温 至55°C关掉微波，再检测pH，当pH下降至7. 3以下补碱调至7. 5,启动搅拌，待酶解液温度 下降至45°C再启动微功率2KW，酶解液升温至55°C，保温5分钟后，启动功率10KW升温至 85-90°C，保温10分钟灭酶活； (10) 将灭酶活后的酶解液排出，冷却至40°C，在搅拌状态下，缓慢添加用含20%冰醋 酸溶解1. 5%的壳聚糖溶液，使pH值调至5,沉析未酶解的蛋白及其他大分子杂质等，沉析 液静置2小时，用400目滤布离心除去的沉析物即为蚂蟥蛋白，离心时先过滤上层液后过滤 浓液； (11) 将400目过滤所得的滤液，再用30000膜进行微滤；浓液合并入上述400目粗滤 渣中； (12) 步骤（11)所得微滤透过液进行2次超滤，第1次超滤用10000膜，第2次超滤用 5000膜，两次超滤的浓缩液合并进粗滤渣中； (13) 将步骤（12)中超滤2所得透过液进行钠滤； (14) 将步骤（13)中纳滤所得浓缩液，选用喷雾干燥法干燥，获得多肽；将步骤（10)的 滤渣，步骤（11)微滤之浓液、步骤（12)超滤之浓液合并选用喷雾干燥法干燥，获得蚂蟥蛋 白粉。2. 根据权利要求1所述的从金边蚂蟥中制取蛋白多肽的方法，其特征在于，步骤⑵中 所得蚂蟥浆液的细度为18-20目。3. 根据权利要求1所述的从金边蚂蟥中制取蛋白多肽的方法，其特征在于，步骤⑶中 所述的2次粗滤的具体操作为：第1次粗滤用60-80目滤布在三足离心机过滤，积累于滤布 的滤渣用适量无离子水喷淋1-2次；第2次粗滤用200目在三足离机过滤，积累于滤布的滤 渣用适量无离子水喷淋1-2次。4. 根据权利要求1所述的从金边蚂蟥中制取蛋白多肽的方法，其特征在于，步骤⑷中 微滤的操作参数为：压栗〇. 05-0. 3Mpa、pH值6-7、温度40-50°C、膜面流量1-4M/S、浓缩比 3-4 倍。5. 根据权利要求1所述的从金边蚂蟥中制取蛋白多肽的方法，其特征在于，步骤（5) 中所述的第1次超滤的操作参数为：压栗〇. 1-0. 43Mpa、pH值5-6、温度40-50°C、膜面流 速1-3M/S、浓缩比4-5倍；第2次超滤的操作参数为：压栗0. 3-0. 6Mpa、pH值为5-6、温度 40-50°C、膜面流量1-3M/S、浓缩比6-7倍。6. 根据权利要求1所述的从金边蚂蟥中制取蛋白多肽的方法，其特征在于，步骤（9)中 所述的碱性酶的酶活为10万u/g;胰酶的酶活>4000u/g。7. 根据权利要求1所述的从金边蚂蟥中制取蛋白多肽的方法，其特征在于，步骤（11) 中微滤的操作参数为：压栗〇. 05-0. 3Mpa、pH值6-7、温度40-50°C、膜面流速1-4M/S、浓缩 比3-4 {首。8. 根据权利要求1所述的从金边蚂蟥中制取蛋白多肽的方法，其特征在于，步骤（12) 中第1次超滤和第2次超滤的操作参数为：压栗0. 2-0. 4Mpa、pH值5-6、温度40-50°C、膜面 流速1-3M/S、浓缩比5-6倍。9. 根据权利要求1所述的从金边蚂蟥中制取蛋白多肽的方法，其特征在于，步骤（13) 中所述钠滤的操作参数为：压力〇. 7-0. 9Mpa，循环流量1. 5-2. 5m3/h，浓缩倍数7-9。
【专利摘要】本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种从金边蚂蟥中制取蛋白多肽的方法。一种从金边蚂蟥中制取蛋白多肽的方法，包括以下步骤：消毒、磨浆、粗滤、微滤、超滤、碱溶、微波处理、离心、沉析、脱色、酶解、沉析、微滤、超滤、纳滤、浓缩和喷雾干燥。本发明提供用物理方法替代化学法分离酸性多肽，获得酸性多肽粗品，可作复配含酸性多肽的中成药或作纯化酸性多肽的前提物，分离率高，能很好保护其活性，无污染产生，达到清洁生产。
【IPC分类】C12P21/06, C07K1/36, C07K1/30, C07K1/34
【公开号】CN105385739
【申请号】CN201510908591
【发明人】梁尚文, 梁满水, 林栋才, 曾志亮
【申请人】梁尚文, 梁满水
【公开日】2016年3月9日
【申请日】2015年12月9日