一种金乌贼蛋白抗氧化肽及其制备方法和用途
【专利摘要】本发明公开了一种金乌贼蛋白抗氧化肽及其制备方法和用途，该抗氧化肽的氨基酸序列为Ala-Pro-Pro-Glu-Asn-Gly-Met-Ala-Gln-Met（APPENGMAQM），分子量为1045.21Da。本发明制备工艺科学合理，酶解过程易监控，制得的抗氧化肽具有抗氧化活性强和易于消化吸收等优点，可以作为药品、保健食品和食品添加剂等应用。
【专利说明】一种金乌贼蛋白抗氧化肽及其制备方法和用途
【技术领域】
[0001]本发明属于工程【技术领域】，具体涉及功能性食品加工技术或生物制药技术，尤其是一种酶解金乌贼蛋白制备抗氧化肽的方法。
【背景技术】 [0002]人体代谢和食品氧化变质过程中产生的自由基会对细胞和组织造成严重的氧化损伤，从而导致心血管疾病、动脉硬化、癌症和身体衰老等疾病。以丁基羟基茴香醚(BHA)、二丁基羟基甲苯(BHT)和特丁基对苯二酚(TBHQ)为代表的化学合成抗氧化剂由于抗氧化活性好、价格便宜被广泛地应用到食品工业中。但是，化学合成抗氧化剂的毒副作用引起了广泛关注，部分国家已限量或禁止使用。因此，天然抗氧化剂成为开发热点。
[0003]蛋白质优良的乳化特性使其能在油水界面发挥介导作用，从而能在生物体内清除过量自由基，抑制膜脂质过氧化。近年来人们发现，介于蛋白质和氨基酸间的肽类由于结构特点，抗氧化活性往往更为显著。玉米抗氧化肽Leu-Asp-Tyr-Gln、Tyr-Ala和 His-Cys-Met-Leu,大豆抗氧化妝 Leu-Val-Asn-Pro-His-Asp-His-Gln-His-Gln-Asn、 Leu-Leu-Pro_His_His_AIa-Asp-AIa-Asp-AIa-Asp-Tyr、 Leu-Leu-Pro-His_His、Val-Asn-Pro-His-Asp-His-Gln-Asn,对虫下抗氧化妝 Ile-Lys-Lys、Phe-Lys-Lys 和Phe-1le-Lys-Lys,阿拉斯加青鲜鱼抗氧化肽Leu-Pro-His-Ser-Gly-Tyr等均显示了显著的生物活性，具有较大的应用前景。
[0004]金乌贼McWmia)，又名墨鱼、乌鱼，属软体动物门、头足纲、乌贼目、乌贼科，分布在我国沿海，以黄、渤海产量较多。金乌贼肉营养丰富，蛋白质含量高，并富含钙、磷、铁等元素。目前，金乌贼主要鲜用、加工成罐头食品或干制品。但是， 申请人:发现，以金乌贼蛋白为原料，利用酶解、超滤和色谱等技术制备高活性抗氧化肽及其应用未见报道。
【发明内容】
[0005]本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的现状提供一种能够抑制脂质过氧化和清除自由基作用的金乌贼蛋白抗氧化肽，其可作为药品、保健食品和食品添加剂。
[0006]本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种金乌贼蛋白抗氧化肽的制备方法。
[0007]本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为:该金乌贼蛋白抗氧化肽，其特征在于该抗氧化肽为十肽化合物，氨基酸序列为AEH-P3:Ala-Pro-Pro-Glu-Asn-Gly-Met-Ala-Gln-Met (APPENGMAQM)，分子量为 1045.21 Da。
[0008]上述金乌贼蛋白抗氧化肽的制备方法，其特征在于包括下述步骤:
1)将洗净、去内壳的金乌贼肉用高速组织捣碎机匀浆，按照料液比Ig:3飞mL加入异丙醇，于35~40°C中脱脂18~24 h，然后于4000~5000 rpm离心l(Tl5min除去异丙醇，收集脱脂金乌贼肉固形物；
2)按固液比lg:f3mL向步骤I)所得脱脂金乌贼肉固形物中加入0.2 mol/L磷酸盐缓冲液，调节PH为6.5~7.5，得到混合液；3)将上述混合液温度升至5(T60°C搅拌预热1(T15min,以脱脂金乌贼肉固形物的质量为基准加入0.8~1.2%的木瓜蛋白酶，在5(T60°C酶解4~6h，得到酶解产物；
4)将上述酶解产物升温至9(T95°C并恒温保持l(Tl5min后，冷却至室温，然后于4000^5000 rpm离心l(Tl5min，得到酶解液，冻干得酶解物干粉；再将酶解物干粉依次经超滤和层析处理，得到抗氧化肽。
[0009]作为改进，所述步骤4)的超滤和层析的具体过程为:
超滤:将酶解物干粉溶于PH 6.5~7.5的磷酸盐缓冲液配成10-15 mg/mL的溶液，于0.1~0.15 MPa的工作压力和20~25 °C的温度下采用3 kDa超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于3 kDa部分，得超滤酶解液，冻干得超滤酶解物干粉；
层析:将上述超滤酶解物干粉用PH 6.5~7.5的磷酸盐缓冲液配成8~12 mg/mL的溶液，经过葡聚糖凝胶G-25柱层析分离，用pH 6.5~7.5磷酸盐缓冲液进行洗脱，根据220 nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，DPPH自由基清除活性最高组分为凝胶层析酶解物，冻干得凝胶层析酶解物干粉；将上述凝胶层析酶解物干粉用PH 6.5-7.5磷酸盐缓冲液配成45飞5μ g/mL的溶液，利用反相高效液相色谱(RP-HPLC)进行纯化，根据抗氧化活性得I个高活性抗氧化妝 Ala-Pro-Pro-Glu-Asn-Gly-Met-Ala-Gln-Met (APPENGMAQM)。
[0010]优选，所述反相高效液相色谱条件为:进样量15~25 yg;色谱柱为Zorbax C18(250mmX4.6mm, 5 μ m);流动相:30%乙腈(含0.1%三氟乙酸)；洗脱速度1.0 mL/min ;紫外检测波长220 nm。
[0011]本发明为解决上述第三个技术问题所采取的技术方案为:一种金乌贼蛋白抗氧化肽的应用，其特征在于 Ala-Pro-Pro-Glu-Asn-Gly-Met-Ala-Gln-Met (APPENGMAQM)对 DPPH自由基、羟基自由基、ABTS自由基和超氧阴离子自由基具有良好的清除作用；同时，Ala-Pro-Pro-Glu-Asn-Gly-Met-Ala-Gln-Met (APPENGMAQM)亦显不出良好的脂质过氧化抑制作用；Ala-Pro-Pro-Glu-Asn-Gly-Met-Ala-Gln-Met (APPENGMAQM)具有安全无毒副作用、抗氧化活性强和易于消化吸收等优点，可以作为药品、保健食品和食品添加剂进行应用。
[0012]与现有技术相比，本发明的优点在于:本发明工艺科学合理，选用木瓜蛋白酶作为酶解用酶，通过生物酶解法同时融合超滤分级和色谱精制，酶解过程易监控，同时制得的抗氧化肽具有较高的活性；与化学合成的抗氧化剂相比较，本发明制得的抗氧化肽具有安全无毒副作用、抗氧化活性强和易于消化吸收等优点，可以作为药品、保健食品和食品添加剂等。
【专利附图】
【附图说明】
[0013]图1是本发明的超滤分级组分AEH-1II的葡聚糖凝胶G-25层析图；
图2是本发明的超滤分级组所分离各分离组分(AEH-1I1-1、AEH-1I1-2、AEH-111-3和AEH-111-4)的DPPH自由基清除活性图；
图3是本发明的葡聚糖凝胶G-25柱层析制备酶解物AEH-1I1-3的RP-HPLC分析图；图 4 是本发明的抗氧化妝 AEH-P3 (Ala-Pro-Pro-Glu-Asn-Gly-Met-Ala-Gln-Met)的质谱图。
[0014]图5是本发明的抗氧化肽的DPPH自由基清除活性；
图6是本发明的抗氧化肽的羟自由基清除活性；图1是本发明的抗氧化肽的ABTS自由基清除活性；
图8是本发明的抗氧化肽的超氧阴离子自由基清除活性)。
[0015]图9是本发明的抗氧化肽的抗脂质过氧化实验图。
【具体实施方式】
[0016]以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。
[0017]一种金乌贼蛋白抗氧化肽的制备方法，制备工艺流程如下:金乌贼肉〃脱脂〃酶解〃酶解物〃超滤〃凝胶过滤层析〃高效液相色谱制备〃抗氧化肽。
[0018]实施例1:
1)将洗净、去壳的金乌贼肉用高速组织捣碎机匀浆，然后按照料液比lg:4mL加入异丙醇，于35°C中脱脂24 h，然后于4500 rpm离心15min除去异丙醇，收集脱脂金乌贼肉固形物；
2)按固液比lg:3mL向上述脱脂金乌贼肉固形物中加入0.2 mol/L磷酸盐缓冲液,调节pH为7.0，得到混合液；
3)将上述混合液温度升至55°C搅拌预热10min,以所述脱脂金乌贼肉固形物的质量为基准加入1.0%的木瓜蛋白酶，在55°C酶解5h，得到酶解产物；
4)将上述酶解产物升温至90°C并恒温保持15min后，冷却至室温，然后于4500rpm离心15min，得到酶解液，冻干得酶解物干粉；再将酶解物干粉依次经超滤和层析，得到抗氧化肽，利用蛋白/多肽序列分析仪和质谱测定其结构，具体过程为:
①超滤:将酶解物干粉溶于PH7.0的磷酸盐缓冲液配成15 mg/mL的溶液，于0.1~
0.15 MPa的工作压力和20 °C的温度下采用3 kDa超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于3 kDa部分，得超滤酶解液，冻干得超滤酶解物干粉；
②层析:将上述超滤酶解物干粉用PH7.0的磷酸盐缓冲液配成10 mg/mL的溶液，经过葡聚糖凝胶G-25柱层析分离，用pH 7.0磷酸盐缓冲液进行洗脱，根据220 nm下的吸光度曲线收集洗脱组分(图1)，其中，DPPH自由基清除活性最高组分为凝胶层析酶解物(图1)，冻干得凝胶层析酶解物干粉；
③反相高效液相色谱(RP-HPLC)精制:将上述凝胶层析酶解物干粉用pH7.0磷酸盐缓冲液配成50 μ g/mL的溶液，利用反相高效液相色谱(RP-HPLC)进行纯化(条件:高效液相色谱仪:Agilent 1260 ;色谱柱为:Zorbax C18 (250mmX4.6mm, 5 μ m);柱温:室温；流动相:30%乙腈(含0.1%三氟乙酸);洗脱速度1.0 mL/min ;检测波长220 nm)，根据抗氧化活性得I个高活性抗氧化肽AEH-P3 (图2)。
[0019]④结构检测:收集活性最高的抗氧化肽AEH-P3经检测为单一峰，利用蛋白/多妝序列分析仪测定氨基酸序列为Ala-Pro-Pro-Glu-Asn-Gly-Met-Ala-Gln-Met(APPENGMAQM)，分子量为 1045.21 Da (图 3)。
[0020]将上述制得的金乌贼蛋白抗氧化肽Ala-Pro-Pro-Glu-Asn-Gly-Met-Ala-Gln-Met(APPENGMAQM)进行DPPH自由基清除实验、羟基自由基清除实验、ABTS自由基清除实验、超氧阴离子自由基清除实验和脂质过氧化抑制实验。实验结果表明=Ala-Pro-Pro-Glu-Asn-GIy-Met-Ala-Gln-Met (APPENGMAQM)对 DPPH 自由基(EC50 4.01 mg/mL)、羟自由基(EC50 4.66mg/mL)、ABTS自由基(EC5tl 3.44 mg/mL)和超氧阴离子自由基(EC5tl 6.03 mg/mL)具有良好的清除作用；同时，Ala-Pro-Pro-Glu-Asn-Gly-Met-Ala-Gln-Met (APPENGMAQM)亦显不出良好的脂质过氧化抑制作用。
[0021]最后，尚需注意的是，以上列举的仅是本发明的一个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形 ，均应认为是本发明的保护范围。
【权利要求】
1.一种金乌贼蛋白抗氧化肽，其特征在于该抗氧化肽的氨基酸序列为Ala-PiO-PiO-GIu-Asn-Gly-Met-Ala-Gln-Met SEQ ID NO: 1，分子量为 1045.21 Da。
2.—种权利要求1所述的金乌贼蛋白抗氧化肽的制备方法，其特征在于包括以下步骤: 1)将洗净、去内壳的金乌贼肉用高速组织捣碎机匀浆，然后按照料液比Ig:3飞mL加入异丙醇，于35~40°C中脱脂18~24 h，然后于4000~5000 rpm离心l(Tl5min除去异丙醇，收集脱脂金乌贼肉固形物； 2)按固液比lg:l~3mL向步骤I)所述脱脂金乌贼肉固形物中加入0.2 mol/L磷酸盐缓冲液，调节PH为6.5~7.5，得到混合液； 3)将步骤2)所述混合液温度升至5(T60°C搅拌预热1(T15min,以步骤I)所述脱脂金乌贼肉固形物的质量为基准加入0.8~1.2%的木瓜蛋白酶，在5(T60°C酶解4~6h，得到酶解产物； 4)将步骤3)所得的酶解产物升温至9(T95°C并恒温保持l(Tl5min后，冷却至室温，然后于4000~5000 rpm离心l(Tl5min，得到酶解液，冻干得酶解物干粉；再将酶解物干粉依次经超滤和层析纯化，得到抗氧化肽。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述步骤3)中的木瓜蛋白酶的酶活力≥1.5 X IO6 U/g。
4.根据权利要求2所述 的制备方法，其特征在于所述步骤4)的超滤和层析的具体过程为: 超滤:将酶解物干粉溶于PH 6.5~7.5的磷酸盐缓冲液配成1(T15 mg/mL的溶液，于0.1~0.15 MPa的工作压力和20~25 °C的温度下采用3 kDa超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于3 kDa部分，得超滤酶解液，冻干得超滤酶解物干粉； 层析:将上述超滤酶解物干粉用PH 6.5~7.5的磷酸盐缓冲液配成8~12 mg/mL的溶液，经过葡聚糖凝胶G-25柱层析分离，用pH 6.5~7.5磷酸盐缓冲液进行洗脱，根据220 nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，DPPH自由基清除活性最高组分为凝胶层析酶解物，冻干得凝胶层析酶解物干粉；将上述凝胶层析酶解物干粉用PH 6.5^7.5磷酸盐缓冲液配成45飞5μ g/mL的溶液，利用反相高效液相色谱(RP-HPLC)进行纯化，根据抗氧化活性得I个高活性抗氧化妝 Ala-Pro-Pro-Glu-Asn-Gly-Met-Ala-Gln-Met SEQ ID NO:1; 优选，所述反相高效液相色谱条件为:进样量15~25 μ g;色谱柱为Zorbax C18(250mmX4.6mm, 5 μ m);流动相:30%乙腈(含0.1%三氟乙酸)；洗脱速度1.0 mL/min ;紫外检测波长220 nm。
5.一种权利要求1所述的金乌贼蛋白抗氧化肽的应用，其特征在于Ala-Pro-Pro-Glu-Asn-Gly-Met-Ala-Gln-Met SEQ ID NO:1 应用于对 DPPH 自由基、羟基自由基、ABTS 自由基和超氧阴离子自由基具有良好的清除；Ala-Pro-Pro-Glu-Asn-Gly-Met-Ala-Gln-MetSEQ ID NO:1 应用于脂质过氧化抑制；Ala-Pro-Pro-Glu-Asn-Gly-Met-Ala-Gln-Met SEQID NO:1作为药品、保健食品和食品添加剂进行应用。
【文档编号】A61P39/06GK103467568SQ201310194623
【公开日】2013年12月25日 申请日期:2013年5月23日 优先权日:2013年5月23日
【发明者】王斌, 郁迪, 徐银峰, 胡发远 申请人:浙江海洋学院