专利名称：一种具有保湿效果的鱼皮胶原肽及其制备工艺和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种具有保湿效果的鱼皮胶原肽及其制备工艺和用途。具体地说，本发明涉及一种利用碱溶液处理鱼皮，再利用蛋白酶水解的方式处理上述鱼皮，通过对水解液进行一系列脱色、脱味、去除杂质的技术处理得到的具有保湿效果的鱼皮胶原肽，及其制备工艺和作为化妆品或护肤品添加剂的用途。
背景技术：
胶原是生物体内一种纤维蛋白，主要存在于皮肤、骨、软骨及肌腱等组织中，占人体或其他动物体总蛋白含量的25％～33％。胶原蛋白因其优良的生物学特性而广泛地应用于生物医用材料领域。因此，如何进行高纯度、高产率的具有生物活性的胶原的提取一直是广大研究者关注的课题。从猪皮和牛皮中提取胶原的历史比较悠久，并且由于其原料充足，至今仍然是皮胶原的主要来源；长期以来胶原主要是从牛和猪等动物组织中提取的。可近年来疯牛病和口蹄疫的发生使人们开始考虑使用牛、猪胶原的替代品，鱼皮胶原的提取成为近几年研究的新热点。胶原的最小单元是胶原三肽(Collagen tripeptide)简称CTP。其结构可以表示为(Gly-X-Y)，是一种在N端带有甘氨酸的高纯度的胶原三肽。微量射线自动照相法研究表明，CTP具有约280Da的平均分子量。而目前市场上的绝大多数胶原肽，主要由30至100个氨基酸构成多聚氨基酸.平均分子量达3000-10000Da，其生物利用率有限。
发明内容
本发明的目的是提供一种以鱼皮为原料，富含小分子肽(分子量280Da)的具有保湿功效的鱼皮胶原肽。
本发明的另一目的是提供所述具有保湿功效的鱼皮胶原肽的制备工艺。
本发明的另一目的是提供所述具有保湿功效的鱼皮胶原肽的用途。
本发明的技术方案是一种具有保湿功效的鱼皮胶原肽，由以下工艺制备而成，所述工艺依次包括下述步骤 1)称取鱼皮原料，清洗，沥干水分，称重。
2)将上述处理的鱼皮加其质量5～6倍的水，再加入其质量3.0～5.0％的氢氧化钙，搅拌均匀浸泡5～7天，在去除鱼皮中的非胶原蛋白的同时，还起到了一定的去腥作用。
3)将上述处理的鱼皮洗净至中性，沥干水分，称重，所得鱼皮即为前处理后的原料。
4)将上述处理后的鱼皮原料按照其质量5～6倍加水，100℃煮沸60～90min，降温至50～60℃，双层纱布滤去残渣，调pH值为6.0～8.0，50℃恒温水浴，首先加入鱼皮原料质量0.5～1.0％的枯草杆菌碱性蛋白酶，再同时加入鱼皮原料质量0.5～1.0％的菠萝蛋白酶和鱼皮原料质量0.5～1.0％的中性蛋白酶，从加入枯草杆菌碱性蛋白酶开始计时，共酶解5～6小时。酶解完毕后，95℃以上，10分钟灭酶，冷却，滤布过滤，滤液为鱼皮胶原肽水解液。
5)将上述滤液用K15活性碳柱脱色脱味。
6)将上述脱色脱味后的滤液浓缩至适当的体积，喷雾干燥，制得成品。
本发明的另一技术方案是一种制备具有保湿功效的鱼皮胶原肽的工艺，其特征在于依次包括下述步骤 1)称取鱼皮原料，清洗，沥干水分，称重。
2)将上述处理的鱼皮加其质量5～6倍的水，再加入其质量3.0～5.0％的氢氧化钙，搅拌均匀浸泡5～7天，在去除鱼皮中的非胶原蛋白的同时，还起到了一定的去腥作用。
3)将上述处理的鱼皮洗净至中性，沥干水分，称重，所得鱼皮即为前处理后的原料。
4)将上述处理后的鱼皮原料按照其质量5～6倍加水，100℃煮沸60～90min，降温至50～60℃，双层纱布滤去残渣，调pH值为6.0～8.0，50℃恒温水浴，首先加入鱼皮原料质量0.5～1.0％的枯草杆菌碱性蛋白酶，再同时加入鱼皮原料质量0.5～1.0％的菠萝蛋白酶和鱼皮原料质量0.5～1.0％的中性蛋白酶，从加入枯草杆菌碱性蛋白酶开始计时，共酶解5～6小时。酶解完毕后，95℃以上，10分钟灭酶，冷却，滤布过滤，滤液为鱼皮胶原肽水解液。
5)将上述滤液用K15活性碳柱脱色脱味。
6)将上述脱色脱味后的滤液浓缩至适当的体积，喷雾干燥，制得成品。
本发明的另一技术方案是一种权利要求1所述的具有保湿功效的鱼皮胶原肽作为化妆品或护肤品添加剂的用途。
本发明的鱼皮胶原肽，最大限度地提高鱼皮胶原肽中小分子肽(分子量280Da左右)组分的含量，实验证明由于CTP分子量很小，因而能有效的渗入角质层，真皮层和头发根部细胞内，能促进胶原的合成和真皮层纤维细胞的透明质酸的合成。将CTP组分添加于皮肤洁净液类的日用品中，将对皮肤的弹性，湿润性和改善皮肤的粗糙状态呈现出极为优异的效果，且具有安全性高、细胞黏结性好、透明、无臭和无刺激作用等特点，可作为化妆品或护肤品的添加剂，有广阔的市场前景。
由本发明的制备工艺生产的具有保湿效果的鱼皮胶原肽，具有良好的细胞黏结性、吸收性和生物相溶性，在化妆品中作为保湿剂和皮肤保护剂，可促进上皮细胞形成，直接补充人体流失的胶原蛋白，延缓皮肤衰老，可用于祛皱、保湿和修复等，且在应用于皮肤表面时，呈现出优异的保湿效果和丝毫不会出现过敏的现象。
附图1为本发明制备具有保湿功效的鱼皮胶原肽的工艺流程框图。
具体实施例方式 下面通过实施实例来理解本发明制备具有保湿功效的鱼皮胶原肽的工艺，但下述实施实例不限制本发明的内容。
本发明制备具有保湿功效的鱼皮胶原肽的工艺 1)原料前处理。洗净鱼皮，控水(称重)，加其质量5～6倍的水，再加入其质量3.0～5.0％的氢氧化钙，搅拌均匀浸泡5～7天，用自来水充分清洗浸泡后的鱼皮，直至pH值到7.0左右为止，控水(称重)备用。经本发明的碱溶液处理方法，去除原料中的非胶原蛋白的同时，还起到了一定的去腥作用。
2)变性。按照上述湿基原料质量的5～6倍加蒸馏水，100℃煮沸变性60～90min。
3)过滤。将上述变性后的水解液降温到50～60℃，用双层纱布滤去鱼鳞残渣和油脂，可视油脂去除情况重复过滤几次。加蒸馏水补足变性时蒸发的水分。
4)蛋白酶水解。调pH值至6.0～8.0，恒温在50℃，向上述滤液中加入1所述湿基原料质量0.5～1.0％的枯草杆菌碱性蛋白酶，再同时加入1所述湿基原料质量0.5～1.0％的菠萝蛋白酶和1所述湿基原料质量0.5～1.0％的中性蛋白酶，从加入枯草杆菌碱性蛋白酶开始计时，共搅拌酶解5～6小时(期间适时补水，保持料液混合物体积不变)。
5)灭活。将上述水解液95℃以上，灭活10min。
6)过滤。将上述灭活后的水解液降温至50～60℃，滤布过滤。
7)活性碳柱吸附脱色脱味。将上述滤液用K15活性碳柱脱色脱味，注意控制柱内液体动态平衡，以免漏碳。
8)干燥。将上述滤液浓缩至适当的体积，喷雾干燥，制得成品。
根据上述工艺制备具有保湿功效的鱼皮胶原肽的实施实例1 1、解冻鱼皮冻块10kg，洗净残肉和血迹，沥于称重得约9kg鱼皮，加54L自然水和270g氢氧化钙，混匀浸泡5天(每天搅拌2次)，5天后，用自然水(200L，耗时2h)洗至中性，沥干称重约得6公斤鱼皮(洗掉的鱼鳞弃去)冷藏备用。
2、台秤称取1kg冷藏备用的鱼皮，按料液比1∶5加蒸馏水5L，100℃煮沸变性60min。
3、双层纱布过滤去除鱼皮残渣，50℃恒温水浴，调PH值为7.0，加入8g枯草杆菌碱性蛋白酶，再加入8g菠萝蛋白酶和8g中性蛋白酶，从加入枯草杆菌碱性蛋白酶开始计时，共自动搅拌酶解5h。
4、水浴灭活(95℃，10min)，降温至50℃～60℃。
5、300目滤布过滤，得滤液体积约4700ml。
6、活性碳柱(K15颗粒碳，径高比1∶4)脱色脱味，加1800ml蒸馏水洗碳柱，洗脱至总液体体积6500ml 7、滤液喷雾干燥，得110克具有保湿功效的鱼皮胶原肽。
根据上述工艺制备具有保湿功效的胶原肽的实施实例2 1、解冻鱼皮冻块9kg，洗净残肉和血迹，沥干称重得约8kg鱼皮，加40L自然水和240g氢氧化钙，混匀浸泡7天(每天搅拌2次)，7天后，用自然水(200L，耗时2h)洗至中性，沥干称重约得5.5公斤鱼皮(洗掉的鱼鳞弃去)冷藏备用。
2、台秤称取1kg冷藏备用的鱼皮，按料液比1∶5.5加蒸馏水5.5L，100℃煮沸变性80min。
3、双层纱布过滤去除鱼皮残渣，50℃恒温水浴，调PH值为8.0，加入9g枯草杆菌碱性蛋白酶，再加入9g菠萝蛋白酶和9g中性蛋白酶，从加入枯草杆菌碱性蛋白酶开始计时，共自动搅拌酶解5.5h。
4、水浴灭活(95℃，10min)，降温至50℃～60℃。
5、300目滤布过滤，得滤液体积约4900ml。
6、活性碳柱(K15颗粒碳，径高比1∶4)脱色脱味，加2000ml蒸馏水洗碳柱，洗脱至总液体体积6900ml 7、滤液喷雾干燥，得120克具有保湿功效的鱼皮胶原肽。
由本实施实例中工艺制备的具有保湿功效的鱼皮胶原肽的产品指标为 总氮≥15.5％ 水分≤5.0％灰分≤2％ 脂肪≤0.5％羟脯氨酸占蛋白质含量(％)8.5～10.0 多肽≥90％ 平均分子量90％≤1000D 其组分90％左右分子量在1000Da以下，其中小分子肽(分子量280Da)含量在50％左右，其理化指标如表1所示 表1 鱼皮胶原肽理化指标表
本发明的保湿功效研究工作简述如下 1体表仪器测定法 1.1试验原理 采用SK-III数字水分测定仪(深圳市凯尔电子厂)测定皮肤表层含水率的变化。用含水率来表示胶原肽的保湿性，含水率越高，说明皮肤表层水分含量越高，胶原肽的改善皮肤水分功能(保湿性能)越好。
1.2实验材料 1.2.1受试物 鱼皮胶原肽简称鱼，自制； 其他样品市场上的同类型胶原产品，共计6种，计为样品1-样品6。
1.2.2试剂 化妆品级透明质酸钠(阳性对照)山东东辰生物工程公司提供。
1.2.3仪器 SK-III数字水分测定仪(深圳市凯尔电子厂)；秒表；棉签。
1.2.4环境 室温25℃以下，相对湿度70％以下 1.3实验方法 用不添加胶原肽的蒸馏水的空白对照组、相同浓度受试物溶液，0.3％透明质酸钠溶液(阳性对照)，在人的胳膊内侧部位进行测定，测定方法如下 ①于被验者的胳膊内侧部位选适当面积的被验区，在被验区打上记号(被验区数量由试样的数量来决定)。
②分别测定各部位的表层水分含量(t＝0)。
③取试样溶液用棉签粘取均匀涂敷，(空白用蒸馏水涂敷，阳性对照用0.3％透明质酸钠涂敷)。60秒后用滤纸擦去液滴。
④试样液滴擦去后立即开启SK-III数字水分测定仪开始测定被验区的含水率，然后不断清零重新测定被验区的含水率约120秒。
⑤以含水率(％)和时间(以秒计算，简写为s)为坐标作图，同一个被验者，以空白t＝0时的水分含量测定值为标准，其余各受试物(包括阳性对照)再以各受试物t＝0时的水分含量测定值与空白t＝0时的水分含量测定值的差值对各时间点的水分含量测定值进行折算，使各受试物起始值相同，以比较各受试物改善皮肤水分功能的强弱。
1.4试验人群 共计12人，年龄段20～50岁，男女各6人。
1.5注意事项 1.5.1在宽敞、通风条件良好，温度、湿度等空间环境稳定的检查室进行。
1.5.2试验开始前让受试者在规定环境下平静10分钟。
1.5.3同一被验区测定工作由同一仪器、同一人进行。
1.6结果与分析 1.6.1鱼皮胶原肽与市场上同类产品体表保湿效果的比较 按料液比1∶4配制受试物溶液并按照1.3的方法进行试验，结果见表2 表2 各受试物体表水分测定数据表(X±s，n＝12)
由表2可见，在市场上的同类产品中鱼皮胶原肽的保湿效果是最好的，其富含的小分子肽(分子量280Da)能有效地保持皮肤水分。就精密度而言，空白的变异系数(CV)为2.21％～4.33％，阳性对照的变异系数(CV)为0.82％～4.08％，各受试物的变异系数(CV)为0.76％～4.27％，以上常规条件变异(RCV)和最佳条件变异(OCV)均在通常要求的15％和7％以内。
2体外试验法 2.1试验原理 硫酸铵[(NH4)2SO4]饱和溶液相对湿度约80％。经过长时间测试，盛有硫酸铵饱和溶液干燥器的环境相对湿度为85％。
根据保湿剂保湿性能的差异，不同保湿剂分子对水分子的作用力不同，吸收水分和保持水分的能力也不同。作用力大的，对水分子结合力强，吸收和保持水的量也较大。含一定水分的样品放在恒温恒湿的干燥器中干燥，定时称量样品质量的减少，通过对比分析，比较出不同样品保湿性的大小。
为了更好的模拟皮肤的实际情况，给载玻片贴上3M胶布，将保湿剂的水溶液涂敷其上，放进干燥器一定时间后称重，计算失水率，失水率越低说明保湿效果越好。
2.2实验材料 2.2.1受试物同体表试验 2.2.2试剂 化妆品级透明质酸钠(阳性对照)山东东辰生物工程公司； 硫酸铵(恒湿剂)国药集团北京化学试剂公司。
2.2.3仪器 干燥器；干湿球温度计；电子天平；载玻片；3M胶布。
2.3实验方法 2.3.1试验步骤 将适量的0.3％透明质酸钠溶液(阳性对照)、受试物溶液、蒸馏水(空白)涂在贴有3M胶布的载玻片上，放入盛有饱和硫酸铵溶液(相对湿度为85％)的干燥器中，每隔1～2小时(h)进行称量，计算其在该时间段的失水率。
2.3.2计算方法 失水率＝(m0-mt)/m0×100％ 式中mt为放置th后水分的质量；m0为开始的水分质量。
2.4结果及分析 2.4.1鱼皮胶原肽与市场上同类产品体外保湿效果的比较 将各受试物按料液比1∶4配成溶液，按照2.3.1进行试验，结果见表3 表3 各受试物体外试验保湿效果比较表(X±s，n＝6)
注*变异系数(CV)大于OCV规定的7％，但小于RCV规定的15％，其余均满足OCV要求。
由表3可以看出单位时间间隔的失水率和若干小时的失水总和，鱼皮胶原肽都较小，最后的几个小时由于其他受试物的水分丧失殆尽，所以单位时间的失水率较鱼皮胶原肽小，这也正反衬出鱼皮胶原肽可以更持久而稳定地保持水分。就精密度而言，空白的变异系数(CV)为1.01％～13.29％，阳性对照的变异系数(CV)为0.19％～2.40％，各受试物的变异系数(CV)为0.53％～13.49％，除两处超过7％外其余均小于7％，都符合常规条件变异(RCV)的要求。
由以上分析可知，使用本实施实例中工艺制备的具有保湿功效的鱼皮胶原肽，除具有一般胶原产品的营养成分外，还拥有市场上同类产品中最强的保湿功效，可作为无毒副作用的化妆品或护肤品添加剂，具有广泛的市场前景。
权利要求
1.一种具有保湿功效的鱼皮胶原肽，由以下工艺制备而成，所述工艺依次包括下述步骤
1)称取鱼皮原料，清洗，沥干水分，称重。
2)将上述处理的鱼皮加其质量5～6倍的水，再加入其质量3.0～5.0％的氢氧化钙，搅拌均匀浸泡5～7天，在去除鱼皮中的非胶原蛋白的同时，还起到了一定的去腥作用。
3)将上述处理的鱼皮洗净至中性，沥干水分，称重，所得鱼皮即为前处理后的原料。
4)将上述处理后的鱼皮原料按照其质量5～6倍加水，100℃煮沸60～90min，降温至50～60℃，双层纱布滤去残渣，调pH值为6.0～8.0，50℃恒温水浴，首先加入鱼皮原料质量0.5～1.0％的枯草杆菌碱性蛋白酶，再同时加入鱼皮原料质量0.5～1.0％的菠萝蛋白酶和鱼皮原料质量0.5～1.0％的中性蛋白酶，从加入枯草杆菌碱性蛋白酶开始计时，共酶解5～6小时。酶解完毕后，95℃以上，10分钟灭酶，冷却，滤布过滤，滤液为鱼皮胶原肽水解液。
5)将上述滤液用K15活性碳柱脱色脱味。
6)将上述脱色脱味后的滤液浓缩至适当的体积，喷雾干燥，制得成品。
2.按权利要求1所述的鱼皮胶原肽，其特征在于所述鱼皮胶原肽的组分90％的分子量在1000Da以下，其中分子量280Da的小分子肽含量在50％。
3.按权利要求1所述的鱼皮胶原肽，其特征在于所述鱼皮胶原肽的产品指标为
总氮≥15.5％
水分≤5.0％灰分≤2％
脂肪≤0.5％羟脯氨酸占蛋白质含量(％)8.5～10.0
多肽≥90％ 平均分子量90％≤≤1000D
4.按权利要求1所述的鱼皮胶原肽，其特征在于所述鱼皮胶原肽的分子量分布见下表
5.按权利要求1所述的鱼皮胶原肽，其特征在于所述鱼皮胶原肽理化指标见下表
6.一种制备具有保湿功效的鱼皮胶原肽的工艺，其特征在于依次包括下述步骤
1)称取鱼皮原料，清洗，沥干水分，称重。
2)将上述处理的鱼皮加其质量5～6倍的水，再加入其质量3.0～5.0％的氢氧化钙，搅拌均匀浸泡5～7天，在去除鱼皮中的非胶原蛋白的同时，还起到了一定的去腥作用。
3)将上述处理的鱼皮洗净至中性，沥干水分，称重，所得鱼皮即为前处理后的原料。
4)将上述处理后的鱼皮原料按照其质量5～6倍加水，100℃煮沸60～90min，降温至50～60℃，双层纱布滤去残渣，调pH值为6.0～8.0，50℃恒温水浴，首先加入鱼皮原料质量0.5～1.0％的枯草杆菌碱性蛋白酶，再同时加入鱼皮原料质量0.5～1.0％的菠萝蛋白酶和鱼皮原料质量0.5～1.0％的中性蛋白酶，从加入枯草杆菌碱性蛋白酶开始计时，共酶解5～6小时。酶解完毕后，95℃以上，10分钟灭酶，冷却，滤布过滤，滤液为鱼皮胶原肽水解液。
5)将上述滤液用K15活性碳柱脱色脱味。
6)将上述脱色脱味后的滤液浓缩至适当的体积，喷雾干燥，制得成品。
7.按权利要求6所述的鱼皮胶原肽的制备工艺，其特征在于所制得的鱼皮胶原肽的产品指标为
总氮≥15.5％
水分≤5.0％灰分≤2％
脂肪≤0.5％羟脯氨酸占蛋白质含量(％)8.5～10.0
多肽≥90％ 平均分子量90％≤1000D
8.按权利要求6所述的鱼皮胶原肽的制备工艺，其特征在于所制得的鱼皮胶原肽的分子量分布见下表
9.按权利要求6所述的鱼皮胶原肽的制备工艺，其特征在于所制得的鱼皮胶原肽理化指标见下表
10.一种权利要求1所述的具有保湿功效的鱼皮胶原肽作为化妆品或护肤品添加剂的用途。
全文摘要
本发明揭示了一种具有保湿效果的鱼皮胶原肽及其制备工艺和用途，具体来说就是利用碱溶液处理鱼皮，再利用蛋白酶水解的方式处理上述鱼皮，通过对水解液进行一系列脱色、脱味、去除杂质的技术处理得到的鱼皮胶原肽及其制备工艺和作为化妆品或护肤品添加剂的用途。本发明的鱼皮胶原肽与一般的胶原肽相比，不仅小分子肽含量高，而且灰分较低，蛋白质含量高，还拥有市场上同类产品中最强的保湿功效，作为无毒副作用的化妆品或护肤品添加剂，有广阔的发展前景。
文档编号C07K1/00GK101608203SQ20081004808
公开日2009年12月23日 申请日期2008年6月19日 优先权日2008年6月19日
发明者陈栋梁 申请人:陈栋梁