基因工程靶向抗神经胶质瘤Acp-W1蛋白及制备方法和用途的制作方法

专利名称：基因工程靶向抗神经胶质瘤Acp-W1蛋白及制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，本发明涉及一种基因工程靶向抗神经胶质瘤Acp-Wl蛋 白，同时还涉及靶向抗神经胶质瘤Acp-Wl蛋白重组的制备方法，还涉及该基因工程蛋白 Acp-Wl的用途，基因工程生产的耙向抗神经胶质瘤蛋白在动物模型水平上能高效抑制 神经胶质瘤的增殖和转移，具有开发成抗神经胶质瘤药物的应用价值。
背景技术：
脑神经胶质瘤是中枢神经系统最常见的肿瘤，其发生率约占全部颅内肿瘤的40%， 患者平均存活时间为一年。目前所有治疗措施(如手术切除、化学治疗、放射治疗和 免疫治疗等)的疗效和应用潜力都极为有限。针对这一严峻现状，迫切需要研究和开发 一种有效的治疗神经胶质瘤的药物。1995年，Ullrich发现人脑神经胶质瘤细胞表达一种独特的电压依赖的氯电流，而 这种电流可以被来源于蝎毒液的氯毒素Chlorotoxin有效抑制，从而有效地降低瘤细胞 增殖速度和肿瘤细胞的转移。随后，在动物模型上进一步证实Chlorotoxin可选择性抑 制神经胶质瘤。因此，筛选神经胶质瘤细胞所特有的氯离子通道的抑制剂可发展成为抗 神经胶质瘤的选择性靶向新药。现代科学研究表明，蝎毒的成分具有多种生理、药理活性，对抗肿瘤、治疗风湿、 抗癫痫以及心血管疾病有重要治疗作用。但是其成分相当复杂，而且成分的结构和物理 化学性质相似，难以分离，许多成分所起的作用甚至相反，而且有效成分往往含量低， 这些无疑都限制了蝎毒的研究和应用。特别是蝎毒氯毒素Chlorotoxin只有36氨基酸 的小肽，在蝎毒中的含量非常低，从蝎毒混合物分离和纯化Chlorotoxin的产量低和成 本昂贵，这严重限制了蝎毒氯毒素Chlorotoxin抗神经胶质瘤药物的研发工作。尽管采 用基因工程技术可以生产大量的蛋白质，然而蝎毒氯毒素Chlorotoxin仅由36个氨基 酸组成，是一个很小的蛋白质多肽，如果采用基因工程的办法生产重组Chlorotoxin, 那么Chlorotoxin在受体表达菌中易于被蛋白酶降解，而且这么小蛋白的表达量不高和后期纯化困难。因此，通过人工改造蝎毒氯毒素Chlorotoxin,使Chlorotoxin与其它 标签融合，形成一个较大有生物活性的融合蛋白成为了高效开发Chlorotoxin靶向抗神 经胶质瘤药物研发的最佳途径。发明内容本发明的目的是在于提供了一种基因工程靶向抗神经胶质瘤Acp-Wl蛋白。该蛋白 稳定性好，易于保存。本发明的另一个目的是在于提供了一种基因工程靶向抗神经胶质瘤Acp-Wl蛋白的 制备方法。该方法简单易行，操作方便，易于生产，制备的蛋白纯度高，产量高。本发明的再一个目的是在于提供了一种基因工程靶向抗神经胶质瘤Acp-Wl蛋白在 制备治疗或预防神经胶质瘤的药物中的应用。为了实现上述目的，本发明采用以下技术措施一种基因工程靶向抗神经胶质瘤Acp-Wl蛋白。通过分子生物学方法，申请人分子 设计了靶向抗神经胶质瘤Acp-Wl蛋白。一种分离的蛋白Acp-Wl，其序列为SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列。申请人发现Acp-Wl蛋白以液态形式在-20。C下保存6个月以上和 以干粉形式在4'C下保存12个月以上，其生物活性不变。Acp-Wl蛋白稳定性好，易于保存。本发明涉及一种基因工程靶向抗神经胶质瘤蛋白以及生产靶向抗神经胶质瘤蛋白 的方法。该基因工程靶向抗神经胶质瘤Acp-Wl蛋白的生产方法简单，后期纯化得率高， Acp-Wl蛋白的生物活性好。Acp-WlQGPLGSDDDDKMCMPCFTTDHQMARKCDDCCGGKGRGKCYRPRCLCR (SEQ ID NO: 1)。一种基因工程耙向抗神经胶质瘤Acp-Wl蛋白的制备方法。它包括下列步骤A、设计引物设计4条PCR扩增引物进行2轮PCR扩增获取W1基因，正向引物为Pl: 5'GCCGGATCCGATGACGATGACAAAATGTGTATGCCGTGCTTCACTACC3'，引物P2: 5' CAATCGTCACATTTACGTGCCATCTGGTGATCGGTAGTGAAGCACGGCAT3'; 反向引物为P3 : 5' CGTAAATGTGACGATTGCTGTGGTGGCAAAGGTCGTGGTAAATGCTACCG3'，引物P4 : 5， GCCCTCGAGTCAACGGCACAGACGCTGCGGACCGTAGCATTTACCACGAC3'。B、两轮PCR扩增W1基因第一轮PCR扩增用引物P2和引物P3，第二轮PCR 扩增用引物Pl和引物P4。第一轮PCR反应的试剂如下将5微升的10x聚合酶缓冲 液、4微升的脱氧核糖核苷酸(dNTP)混合物、1微升的引物P2、 1微升的引物P3、 0.25微升的耐热DNA聚合酶(TaqDNA)和37.75微升的无菌水混合。PCR反应条件 94"C预变性300秒、94'C变性45秒、55'C复性45秒、72'C延伸45秒、72"C最后延伸 200秒，循环32次。第二轮PCR中使用引物P1和引物P4，加入第一轮PCR扩增产物 稀释50倍的模板1微升，其它反应条件不变，获得特异性的扩增带(图l)。C、将PCR扩增W1基因融合到谷胱苷肽转移酶(GST)的下游，表达和纯化Acp-Wl蛋白PCR扩增产物凝胶电泳回收后用BamHI和XhoI双酶切，酶切后的片段插入 经BamHI和Xhol双酶切的表达载体pGEX-6p-l(购自Pharmacia公司)，构建重组表达 质粒，转化大肠杆菌Rossetta(DE3)(购自Promega)。对转化的大肠杆菌异丙基-P-D-硫代半乳糖苷(IPTG，购自华美生物工程公司)诱导培养后，收集菌体，悬浮于缓冲 液(50mM Tris-Cl， l.OmM EDTA， pH8.0)中，超声波破菌并离心，所得上清通过GS T亲和层析胶后可收集洗脱得到的融合蛋白。收集得到的融合蛋白溶液再经超虑脱盐和 色谱分离，获得基因工程Acp-Wl蛋白(图2)，纯度达到95% (图3)。基因工程Acp-Wl蛋白作为药物在治疗神经胶质瘤中的用途。它包括下列步骤A、 建立大鼠神经胶质瘤C6细胞皮下移植瘤动物模型收获大鼠神经胶质瘤C6(购 自上海细胞所)培养细胞并配成1. 5X 1()6个/ml浓度的悬液，按0. 2-0. 3ml的体积注射 于每只实验大鼠(150g士10g)右前腋皮下，接种7至10天，即可在右前肢腋下随手触 摸到肿瘤颗粒。正常培养7天后，挑选成瘤较好、肿瘤大小适宜的个体作为实验的模型 动物(图4)。B、 Acp-Wl靶向大鼠神经胶质瘤釆用氯胺T法将方文身才性元素'"I标记GST蛋白和Acp-Wl蛋白。取巳通过碘饱和甲状腺的模型大鼠15只，随机均分为3组，试验组注 射131I-Acp-Wl蛋白，另两组注射游离的Na1311 (由中国原子能科学研究院同位素)和'"I-GST蛋白做对照组。注射方式为尾静脉注射，剂量20pl。分别于5min、10min、30min、 60min、 120min和180min时，采用断颈法处死实验动物，分别取血液以及心脏、肺、 肝、肾、胰、胃、大脑、肌肉和肿瘤组织块作为样品，以FT-613自动计算放免测量仪 (购自北京核仪器厂)记录样品的脉冲数，记录时间30秒，换算出单位重量样品的放 射强度(脉冲数)以及样本单位放射量权重((某样品单位重量脉冲数/样本单位重量脉 冲数总和〕X100%)。统计分析发现，在180分钟内，荷瘤大鼠肿瘤组织内131I-Acp-Wl 的含量随时间的延长而不断增加(富集)，而其它非肿瘤组织则不具有这种现象(图5)， 表明重组Acp-Wl蛋白对由C6细胞所诱发的肿瘤组织有明显的特异靶向作用。C、 体内抑制大鼠神经胶质瘤增殖大鼠腋下接种C6细胞7天后，挑选已成瘤的 个体12只随机分为3组，分别对3组动物腹腔注射Acp-Wl蛋白、GST蛋白和生理盐水。 蛋白溶液浓度2PgA4，注射剂量3组均为100W/只大鼠，频率为每2天注射一次，共 注射7次。最后一次注射后再将动物词养5天，观察肿瘤生长情况，解剖摘取肿瘤前采 用断颈法处死动物，剥离皮下肿瘤组织并称量各自瘤重，比较分析两组间的差异。结果 表明，两组动物皮下肿瘤平均重量分别为生理盐水组0.3259士0. 1114g; GST蛋白组 0. 3399±0. 1965g;Acp-Wl蛋白组0. 0432±0. 0217g。Acp-Wl蛋白实际抑瘤率为86. 74%。 统计学分析也显示两组间肿瘤均重差异极显著，显示Acp-Wl蛋白具有很强的抑瘤效果(图6)。D、 体内抑制大鼠神经胶质瘤转移大鼠腋下接种C6细胞14天后，挑选已成瘤的 个体15只随机分为3组，分别对3组动物腹腔注射Acp-Wl蛋白、GST蛋白和生理盐水。 蛋白溶液浓度2^gAa，注射剂量3组均为100W/只大鼠，频率为每2天注射一次，共 注射7次。最后一次注射后再将动物饲养7天，观察肿瘤生长情况，解剖摘取肿瘤前采 用断颈法处死动物，观察各组动物肺部肿瘤转移情况，比较分析两组间的差异。结果表 明，Acp-Wl蛋白试验组动物的肺基本上是正常的，而GST蛋白和生理盐水的试验动 物的肺出现了肿瘤(图7)。统计学分析也显示两组间肿瘤转移差异极显著，显示Acp-Wl 蛋白具有很强的抑制肿瘤转移的效果(图7)。可见，本发明具有如下特点(1)基因工程生产Acp-Wl蛋白产量高。实验室小试 生产95%纯度以上的Acp-Wl蛋白产量达到30mg/L培养物，中试发酵水平达到500mg/L 培养物；(2) Acp-Wl稳定性高。Acp-Wl是一个由272氨基酸组成的31. 5 KDa大小的蛋白，具有很高的稳定性，不易变质；(3)易于生产。使用亲和层析、超虑脱盐和高效液 相色谱3个纯化操作步骤，就可以得到95%以上色谱纯的Acp-Wl蛋白；(4) Acp-Wl 药物效果显著。动物实验表明，重组Acp-Wl蛋白不仅对神经胶质瘤组织具有特异靶向 性，而且能有效抑制神经胶质瘤恶性增殖和转移。


图1重叠PCR方法扩增Wl基因示意图M: DNA Mark Ladder2000; 1:引物P2和P3的扩增带；2:引物Pl和P4的扩增带。图2工程菌BL21(pGEX/Acp-Wl)的诱导表达示意图1:未经诱导转化pGEX-Acp-Wl的全细胞蛋白提取物；2:经IPTG诱导转化pGEX-pGEX-Acp-Wl的全细胞蛋白提取物；3:纯化的基因工程Acp-Wl蛋白；4:中分 子量蛋白质Mark。图3基因工程Acp-Wl蛋白的HPLC分析图4建立大鼠神经胶质瘤C6细胞皮下移植瘤动物模型(A):大鼠神经胶质瘤C6细胞皮下移植瘤动物外形照片(接种21天)；(B):对应A图大鼠神经胶质瘤C6细胞皮下移植瘤动物解剖照片。 图5Acp-Wl蛋白耙向大鼠神经胶质瘤(A):生理盐水对照组mI在大鼠不同组织中的增长速率；(B): GST蛋白在大鼠不同组织中的增长速率；(C): 131I-Acp-Wl蛋白在大鼠不同组织中的增长速率。 图6 Acp-Wl蛋白体内抑制大鼠神经胶质瘤增殖(A):生理盐水、GST蛋白和Acp-Wl蛋白处理组大鼠神经胶质瘤解剖结果；(B): 生理盐水、GST蛋白和Acp-Wl蛋白处理组大鼠神经胶质瘤重量及其抑瘤率；(C): 生理盐水、GST蛋白和Acp-Wl蛋白处理组大鼠神经胶质瘤重量的矩形图。 图7 Acp-Wl蛋白体内抑制大鼠神经胶质瘤转移(A):生理盐水和Acp-Wl蛋白处理组大鼠肺的肿瘤转移情况统计；(B):典型的生理盐水和Acp-Wl蛋白处理组大鼠肺解剖照片(a: —只具有+ + +肿瘤严重程度 的生理盐水对照组大鼠肺；b: —只没有发生病变的Acp-Wl蛋白组大鼠肺)。
具体实施方式
实施例l:分子设计W1基因基于已报道的蝎毒氯毒素Chlorotoxin(蛋白登记号P45639)的氨基酸序列，利用 常规方法推断编码蛋白质的核苷酸序列，同时考虑大肠杆菌密码子偏好性。在此基础上， 分别设计引物进行PCR扩增获取目的基因Wl 。正向引物为Pl : 5'GCCGGATCCGATGACGATGACAAAATGTGTATGCCGTGCTTCACTACC3'，引物P2 : 5' CAATCGTCACATTTACGTGCCATCTGGTGATCGGTAGTGAAGCACGGCAT3'; 反向引物为P3 : 5' CGTAAATGTGACGATTGCTGTGGTGGCAAAGGTCGTGGTAAATGCTACCG3'，引物P4 : 5' GCCCTCGAGTCAACGGCACAGACAACGCGGACCGTAGCATTTACCACGAC3'。第一轮PCR扩增用引物 P2和引物P3，第二轮PCR扩增用引物P1和引物P4。第一轮PCR反应的试剂如下 将5微升的10xTaq聚合酶缓冲液、4微升的dNTP混合物、1微升的引物P2、 1微升的 引物P3、 0.25微升的TaqDNA聚合酶和37.75微升的无菌水混合。PCR反应条件94 'C预变性300秒、94。C变性45秒、55。C复性45秒、72'C延伸45秒、72。C最后延伸200 秒，循环32次。第二轮PCR中使用引物P1和引物P4，加入第一轮PCR扩增产物稀 释50倍的模板1微升，其它反应条件不变。实施例2: Acp-Wl蛋白重组表达载体的构建 A: Wl和pGEX-6p-l的双酶切与连接将实施例1中所得PCR产物经过酚:氯仿异戊醇(25: 24: l)抽提，无水乙醇(2. 5 倍体积)沉淀后用50^1灭菌水溶解沉淀。用限制性内切酶BamHI和Xhol (Takara公 司产品)对回收的PCR产物和表达载体pGEX-6p-l质粒进行酶切。酶切反应 BamHI(14U/nl)和XhoI(20U^il)各l)al， 10倍缓冲液2.5^1,， PCR产物或pGEX-6p-l质粒 50-100ng，加无菌水至总体积为25pl。 37'C水浴5小时，酶切产物经酚氯仿异戊醇抽 提，无水乙醇(2.5倍体积)沉淀后用TJ)NA连接酶(Takara公司产品)将PCR产物与 表达载体pGEX-6p-l连接。连接反应T4DNA连接酶(1U 1) 1^1， PCR产物与表达 载体pGEX-6p-l的摩尔比为3: 1，并且DNA总量为O.lng， 5倍连接酶反应缓冲液4^1， 加无菌水至总体积为2(^1， 16'C放置24小时。B:大肠杆菌DH5a和Rossetta(DE3)感受态细胞的制备DH5ct (购自中国典型培养物保藏中心，该菌株DH5a为普通菌株)感受态细胞的制备在划线平板上挑取DH5a单菌落，接种于5mlLB培养液，37°C， 250rpm摇床中 培养过夜；以1%量转接于5ml LB培养基中，生长至OD,至lj 0.4 0.6，取菌液lml 于预冷的1.5ml Eppendorf管中，冰浴5 10分钟，4°C 12,000rpm离心20 30秒，收 集菌体，倒置1分钟，再冰浴10分钟；沉淀重悬于lml预冷的0.1M CaCl2中，冰浴 20 40分钟，4°C 12,000rpm离心20 30秒，收集菌体，将菌体重悬于150^1预冷的 CaCl2中，冰浴2 7小时，4'C冰箱保存，如放置在-7(TC则可保存6个月。Rossetta(DE3)感受态细胞的制备同于DH5a感受态细胞的制备。C-连接产物的转化和阳性克隆的鉴定将实施例2A步骤中的20[xl连接反应液加到100^1的DH5a感受态细胞，混匀，冰 浴30分钟，42'C水浴卯秒(不能摇动)，再冰浴2分钟；加等体积2XLB培养液，37 'C摇床(120rpm)温育1小时；摇匀菌液，取200|11涂布于LB/AP+琼脂平板上，待菌 液吸干后倒置于37'C培养12 16小时，观察结果。加氨苄青霉素琼脂平板(LB/AP+)上挑取单菌落10个，于500pl含氨苄的LB液 体培养基中37'C振摇4小时，取2pl菌液作为模板，以实施例1中的正反向引物P1、 P2、 P3、 P4进行PCR。 PCR筛选的阳性克隆子进一步使用限制性酶切反应鉴定。两者 都为阳性结果的克隆子送上海三博公司进行测序分析。测序引物是针对pGEX-6p-l质 粒的通用测序引物pGEX5'primer。实施例3:重组Acp-Wl基因工程菌的制备将实施例2C步骤中测序正确的阳性克隆子按照碱裂解法提取重组表达质粒 pGEX-Acp-Wl (方法见《分子克隆》第二版)。按照实施例2C步骤中的转化方法将提取 的pGEX-Acp-Wl质粒转入实施例2B步骤制备的大肠杆菌感受态Rossetta(DE3)细胞中。 平板为LB/AP+琼脂平板。挑取单克隆子获得基因工程菌Rossetta(DE3) (pGEX-Acp-Wl)。实施例4:重组Acp-Wl蛋白的表达和纯化在含氨苄青霉素的LB液体培养基中以1:100的比例接种克隆子(重组大肠杆菌Ro ssetta (DE3) /pGEX-Acp-Wl)， 37。C培养至OD6。。=0. 8时加入IPTG(终浓度为0. ImM) 对培养物进行诱导，然后将培养物在28'C培养4小时以进行目的基因的表达。浓缩诱 导后的培养物50倍，超声波破细胞(80HZ,30秒/次，至培养物变清亮为止)，12000rpm离心15分钟，所得上清加入到GST亲和层析胶中充分混合后26'C作用1小时使Acp-W 1蛋白与GST亲和层析胶充分结合。用含50rnM的EDTA(乙二胺四乙酸)的Tris-Cl(三羟 甲基氨基甲烷盐酸)缓冲溶液(l. OmM, pH8. O)反复冲洗GST亲和层析胶去除杂蛋白。然后 用10mM的GSH (还原型谷胱甘肽)溶液按照50ml/L培养物洗脱Acp-Wl蛋白。洗脱的A cp-Wl蛋白通过50ml的lOKDa超虑管(Millipore， Centricon， USA)离心浓縮脱盐， 离心速度为3500rpm/min，温度为4°C。然后浓縮脱盐的Acp-Wl蛋白进行HPLC (美国 安吉伦公司产品)纯化。HPLC的参数设置为分离柱子C18 (EliteHPLC， China, 10 X250隱，5—，流速5ml/min，液相为含有0. 1%的三氟乙酸TFA的乙腈(CH3CN: 10% to 80%)洗脱液，紫外检测设置在280nm处。手工收集Acp-Wl蛋白峰，并且冷冻干燥 (一4(TC)。通过Tris-Tricine缓冲液的十二垸基磺酸钠聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-P AGE)检测收集液中的重组Acp-Wl蛋白，并用Bradford方法测定含量。高效液相色谱 鉴定蛋白纯度达到95%。实施例5:大鼠神经胶质瘤C6细胞皮下移植瘤动物模型的建立收获C6培养细胞并配成1. 5X 1(f个/ml浓度的悬液，按0. 2-0. 3ml的体积注射于 每只实验SD大鼠(150g土10g，购自湖北省试验动物中心)右前腋皮下，接种7至10 天，即可在右前肢腋下随手触摸到肿瘤颗粒。正常培养7天后，挑选成瘤较好、肿瘤大 小适宜的个体作为实验的模型动物。实施例6: Acp-Wl耙向大鼠C6细胞皮下移植瘤采用氯胺T法将方文射性元素1311标记GST蛋白和Acp-Wl蛋白。取已通过碘饱和甲状腺的模型大鼠15只，随机均分为3组，试验组注射^I-Acp-Wl蛋白，另两组注射 游离的Na1311和131I-GST蛋白做对照组。注射方式为尾静脉注射，剂量20^1。分别于 5min、 10min、 30min、 60min、 120min和180min时，采用断颈法处死实验动物，分别 取血液以及心脏、肺、肝、肾、胰、胃、大脑、肌肉和肿瘤组织块作为样品，以FT-613 自动计算放免测量仪记录样品的脉冲数，记录时间30秒，换算出单位重量样品的放射 强度(脉冲数)以及样本单位放射量权重((某样品单位重量脉冲数/样本单位重量脉冲 数总和〕X100%)。统计分析发现，在180分钟内，荷瘤大鼠肿瘤组织内131I-Acp-Wl的 含量随时间的延长而不断增加(富集)，而其它非肿瘤组织则不具有这种现象，表明重组Acp-Wl蛋白对由C6细胞所诱发的肿瘤组织有明显的特异靶向作用。实施例7: Acp-Wl蛋白体内抑制大鼠神经胶质瘤增殖大鼠腋下接种C6细胞7天后，挑选已成瘤的个体12只随机分为3组，分别对3 组动物腹腔注射Acp-Wl蛋白、GST蛋白和生理盐水。蛋白溶液浓度2PgAa，注射剂量 3组均为100W/只大鼠，频率为每2天注射一次，共注射7次。最后一次注射后再将动 物饲养5天，观察肿瘤生长情况，解剖摘取肿瘤前采用断颈法处死动物，剥离皮下肿瘤 组织并称量各自瘤重，比较分析两组间的差异。结果表明，两组动物皮下肿瘤平均重量 分别为生理盐水组0. 3259±0. 1114g; GST蛋白组0. 3399±0. 1965g; Acp-Wl蛋白组 0. 0432±0. 0217g。 Acp-Wl蛋白实际抑瘤率为86. 74%。统计学分析也显示两组间肿瘤均 重差异极显著，显示Acp-Wl蛋白具有很强的抑瘤效果。实施例8: Acp-Wl蛋白体内抑制大鼠神经胶质瘤转移大鼠腋下接种C6细胞14天后，挑选已成瘤的个体15只随机分为3组，分别对3 组动物腹腔注射Acp-Wl蛋白、GST蛋白和生理盐水。蛋白溶液浓度2PgAi1，注射剂量 3组均为100ri/只大鼠，频率为每2天注射一次，共注射7次。最后一次注射后再将动 物饲养7天，观察肿瘤生长情况，解剖摘取肿瘤前采用断颈法处死动物，观察各组动物 肺部肿瘤转移情况，比较分析两组间的差异。结果表明，Acp-Wl蛋白试验组动物的肺 基本上是正常的，而GST蛋白和生理盐水的试验动物的肺出现了肿瘤。统计学分析也 显示两组间肿瘤转移差异极显著，显示Acp-Wl蛋白具有很强的抑制肿瘤转移的效果。SEQUENCE LISTING〈110〉 武汉大学〈120〉基因工程靶向抗神经胶质瘤Acp-Wl蛋白及制备方法和用途 〈130〉基因工程靶向抗神经胶质瘤Acp-Wl蛋白及制备方法和用途〈160〉 1<170〉 Patentln version 3.1〈210〉 1〈211〉 272〈212〉 PRT 〈213〉人工合成〈400〉 1Met Ser Pro lie Leu Gly Tyr Trp Lys lie Lys Gly Leu Val Gin Pro15 10 15Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu His Leu20 25 30Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Trp Arg Asn Lys Lys Phe Glu Leu35 40 45Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr lie Asp Gly Asp Val Lys50 55 60Leu Thr Gin Ser Met Ala lie lie Arg Tyr lie Ala Asp Lys His Asn 65 70 75 80Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala Glu lie Ser Met Leu Glu85 90 95Gly Ala Val Leu Asp lie Arg Tyr Gly Val Ser Arg lie Ala Tyr Ser100 105 110Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys Val Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu115 120 125Met Leu Lys Met Phe Glu Asp Arg Leu Cys His Lys Thr Tyr Leu Asn130 135 140Gly Asp His Val Thr His Pro Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu Asp 145 150 155 160Val Val Leu Tyr Met Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu165 170 175Val Cys Phe Lys Lys Arg lie Glu Ala lie Pro Gin lie Asp Lys Tyr180 185 190Leu Lys Ser Ser Lys Tyr lie Ala Trp Pro Leu Gin Gly Trp Gin Ala195 200 205Thr Phe Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys Ser Asp Leu Glu Val Leu210 215 220Phe Gin Gly Pro Leu Gly Ser Asp Asp Asp Asp Lys Met Cys Met Pro 225 230 235 240Cys Phe Thr Thr Asp His Gin Met Ala Arg Lys Cys Asp Asp Cys Cys245 250 255Gly Gly Lys Gly Arg Gly Lys Cys Tyr Arg Pro Arg Cys Leu Cys Arg 260 265 270
权利要求
1. 一种分离的多肽，其序列为SEQ ID NO1所示的氨基酸序列。
2、 一种制备权利要求l所述的一种基因工程靶向抗神经胶质瘤Acp-Wl蛋白的方法， 其步骤是A、 设计引物设计4条PCR扩增引物进行2轮PCR扩增获取W1基因，正向引 物为Pl: 5'GCCGGATCCGATGACGATGACAAAATGTGTATGCCGTGCTTCACTACC3'，引物P2: 5' CAATCGTCACATTTACGTGCCATCTGGTGATCGGTAGTGAAGCACGGCAT3'; 反向引物为P3 : 5' CGTAAATGTGACGATTGCTGTGGTGGCAAAGGTCGTGGTAAATGCTACCG3'，引物P4 : 5， GCCCTCGAGTCAACGGCACAGACAACGCGGACCGTAGCATTTACCACGAC3';B、 两轮PCR扩增W1基因第一轮PCR扩增用引物P2和引物P3，第二轮PCR 扩增用引物P1和引物P4，第一轮PCR反应的试剂如下将5微升的10xTaq聚合酶缓 冲液、4微升的dNTP混合物、1微升的引物P2、 1微升的引物P3、 0.25微升的TaqDNA 聚合酶和37.75微升的无菌水混合，PCR反应条件94'C预变性300秒、94'C变性45 秒、55'C复性45秒、72r延伸45秒、72'C最后延伸200秒，循环32次，第二轮PCR 中使用引物P1和引物P4，加入第一轮PCR扩增产物稀释50倍的模板1微升，其它反 应条件不变，获得扩增带；C、 Acp-Wl蛋白的表达和纯化PCR扩增产物凝胶电泳回收后用Saw/7I和J^01 双酶切，酶切后的片段插入经SflmM和Wol双酶切的表达载体pGEX-6p-l ，构建重组 表达质粒，转化大肠杆菌Rossetta(DE3),对转化的大肠杆菌异丙基-P -D-硫代半乳糖 苷诱导培养后，收集菌体，悬浮于缓冲液中，超声波破菌并离心，所得上清通过GST 亲和层析胶后收集洗脱液得到融合蛋白，再经超虑脱盐和色谱分离，获得基因工程Ac p-Wl蛋白。
3、 权利要求1所述的一种基因工程靶向抗神经胶质瘤Acp-Wl蛋白在制备治疗或 预防神经胶质瘤的药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种基因工程靶向抗神经胶质瘤Acp-W1蛋白及制备方法和应用，本发明分离了一种蛋白质，其序列为SEQ ID NO1所示的氨基酸序列。基因工程所涉及的引物，将蝎毒氯毒素的核苷酸序列插入表达载体中pGEX-6p-1，构成重组表达质粒；重组质粒转化大肠杆菌Rossetta(DE3)，然后细胞裂解经亲和层析、超虑脱盐和色谱纯化得到Acp-W1蛋白。Acp-W1蛋白对神经胶质瘤有特异靶向作用，且能有效抑制大鼠神经胶质瘤的增殖，具有靶向抗神经胶质瘤的作用。Acp-W1蛋白在制备治疗或预防神经胶质瘤药物中的应用。本发明方法简单易行，操作方便，产量高，生物活性好。
文档编号C07K14/435GK101270157SQ20081004755
公开日2008年9月24日 申请日期2008年4月30日 优先权日2008年4月30日
发明者辉 刘, 孙正博, 曹志贱, 李文鑫, 范少忠, 蒋达和 申请人:武汉大学