专利名称：一种具有美白效果的鱼皮胶原肽及其制备工艺和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种具有美白效果的鱼皮胶原肽及其制备工艺和用途。具体地说，本发明涉及一种利用碱溶液处理鱼皮，再利用蛋白酶水解的方式处理上述鱼皮，通过对水解液进行一系列脱色、脱味、去除杂质的技术处理得到的具有美白效果的鱼皮胶原肽，及其制备工艺和作为化妆品或护肤品添加剂的用途。
背景技术：
胶原是生物体内一种纤维蛋白，主要存在于皮肤、骨、软骨及肌腱等组织中，占人体或其他动物体总蛋白含量的25％～33％。胶原蛋白因其优良的生物学特性而广泛地应用于生物医用材料领域。因此，如何进行高纯度、高产率的具有生物活性的胶原的提取一直是广大研究者关注的课题。从猪皮和牛皮中提取胶原的历史比较悠久，并且由于其原料充足，至今仍然是皮胶原的主要来源；长期以来胶原主要是从牛和猪等动物组织中提取的。可近年来疯牛病和口蹄疫的发生使人们开始考虑使用牛、猪胶原的替代品，鱼皮胶原的提取成为近几年研究的新热点。胶原的最小单元是胶原三肽(Collagen tripeptide)简称CTP。其结构可以表示为(Gly-X-Y)，是一种在N端带有甘氨酸的高纯度的胶原三肽。微量射线自动照相法研究表明，CTP具有约280Da的平均分子量。而目前市场上的绝大多数胶原肽，主要由30至100个氨基酸构成多聚氨基酸.平均分子量达3000-10000Da，其生物利用率有限。
发明内容
本发明的目的是提供一种以鱼皮为原料，富含小分子肽(分子量280Da)的具有美白功效的鱼皮胶原肽。
本发明的另一目的是提供所述具有美白功效的鱼皮胶原肽的制备工艺。
本发明的另一目的是提供所述具有美白功效的鱼皮胶原肽的用途。
本发明技术方案是一种具有美白功效的鱼皮胶原肽，由以下工艺制备而成，所述工艺依次包括下述步骤 1)称取鱼皮原料，清洗，沥干水分，称重。
2)将上述处理的鱼皮加其质量5～6倍的水，再加入其质量3.0～5.0％的氢氧化钙，搅拌均匀浸泡5～7天，在去除鱼皮中的非胶原蛋白的同时，还起到了一定的去腥作用。
3)将上述处理的鱼皮洗净至中性，沥干水分，称重，所得鱼皮即为前处理后的原料。
4)将上述处理后的鱼皮原料按照其质量5～6倍加水，121℃高压60～90min，降温至50～60℃，双层纱布滤去残渣，调pH值为6.0～8.0，50℃恒温水浴，首先加入鱼皮原料质量0.5～1.0％的枯草杆菌碱性蛋白酶，再同时加入鱼皮原料质量0.5～1.0％的菠萝蛋白酶和鱼皮原料质量0.5～1.0％的中性蛋白酶，从加入枯草杆菌碱性蛋白酶开始计时，共酶解5～6小时。酶解完毕后，95℃以上，10分钟灭酶，冷却，滤布过滤，滤液为鱼皮胶原肽水解液。
5)将上述滤液用K15活性碳柱脱色脱味。
6)将上述脱色脱味后的滤液浓缩至适当的体积，喷雾干燥，制得成品。
本发明另一技术方案是一种制备具有美白功效的鱼皮胶原肽的工艺，其特征在于依次包括下述步骤 1)称取鱼皮原料，清洗，沥干水分，称重。
2)将上述处理的鱼皮加其质量5～6倍的水，再加入其质量3.0～5.0％的氢氧化钙，搅拌均匀浸泡5～7天，在去除鱼皮中的非胶原蛋白的同时，还起到了一定的去腥作用。
3)将上述处理的鱼皮洗净至中性，沥干水分，称重，所得鱼皮即为前处理后的原料。
4)将上述处理后的鱼皮原料按照其质量5～6倍加水，121℃高压60～90min，降温至50～60℃，双层纱布滤去残渣，调pH值为6.0～8.0，50℃恒温水浴，首先加入鱼皮原料质量0.5～1.0％的枯草杆菌碱性蛋白酶，再同时加入鱼皮原料质量0.5～1.0％的菠萝蛋白酶和鱼皮原料质量0.5～1.0％的中性蛋白酶，从加入枯草杆菌碱性蛋白酶开始计时，共酶解5～6小时。酶解完毕后，95℃以上，10分钟灭酶，冷却，滤布过滤，滤液为鱼皮胶原肽水解液。
5)将上述滤液用K15活性碳柱脱色脱味。
6)将上述脱色脱味后的滤液浓缩至适当的体积，喷雾干燥，制得成品。
本发明另一技术方案是一种权利要求1所述的具有美白功效的鱼皮胶原肽作为化妆品或护肤品添加剂的用途。
本发明的鱼皮胶原肽，最大限度地提高鱼皮胶原肽中小分子肽(分子量280Da左右)组分的含量，实验证明由于CTP分子量很小，因而能有效的渗入角质层，真皮层和头发根部细胞内，能促进胶原的合成和真皮层纤维细胞的透明质酸的合成。将CTP组分添加于皮肤洁净液类的日用品中，将对皮肤的弹性，湿润性和改善皮肤的粗糙状态呈现出极为优异的效果，且具有安全性高、细胞黏结性好、透明、无臭和无刺激作用等特点，可作为化妆品或护肤品添加剂，有广阔的市场前景。
由本发明的制备工艺生产的具有美白效果的鱼皮胶原肽，其富含的小分子肽(分子量280Da)能够有效地与酪氨酸酶作用，使其失活或阻断酪氨酸生成黑色素的氧化途径，除具有一般胶原产品的营养成分外，还拥有市场上同类产品中最强的美白功效。
附图1为本发明制备具有美白功效的胶原肽的工艺流程框图。
具体实施例方式 下面通过实施实例来理解本发明制备具有美白功效的鱼皮胶原肽的工艺，但下述实施实例不限制本发明的内容。
制备具有美白功效的鱼皮胶原肽的工艺 1)原料前处理。洗净鱼皮，控水(称重)，加其质量5～6倍的水，再加入其质量3.0～5.0％的氢氧化钙，搅拌均匀浸泡5～7天，用自来水充分清洗浸泡后的鱼皮，直至pH值到7.0左右为止，控水(称重)备用。经本发明的碱溶液处理方法，去除原料中的非胶原蛋白的同时，还起到了一定的去腥作用。
2)变性。按照上述湿基原料质量的5～6倍加蒸馏水，121℃高压变性60～90min。
3)过滤。将上述变性后的水解液降温到50～60℃，用双层纱布滤去鱼鳞残渣和油脂，可视油脂去除情况重复过滤儿次。加蒸馏水补足变性时蒸发的水分。
4)蛋白酶水解。调pH值至6.0～8.0，恒温在50℃，向上述滤液中加入1所述湿基原料质量0.5～1.0％的枯草杆菌碱性蛋白酶，再同时加入1所述湿基原料质量0.5～1.0％的菠萝蛋白酶和1所述湿基原料质量0.5～1.0％的中性蛋白酶，从加入枯草杆菌碱性蛋白酶开始计时，共搅拌酶解5～6小时(期间适时补水，保持料液混合物体积不变)。
5)灭活。将上述水解液95℃以上，灭活10min。
6)过滤。将上述灭活后的水解液降温至50～60℃，滤布过滤。
7)活性碳柱吸附脱色脱味。将上述滤液用K15活性碳柱脱色脱味，注意控制柱内液体动态平衡，以免漏碳。
8)干燥。将上述滤液浓缩至适当的体积，喷雾干燥，制得成品。
根据上述工艺制备具有美白功效的胶原肽的实施实例1 1、解冻鱼皮冻块10kg，洗净残肉和血迹，沥干称重得约9kg鱼皮，加54L自然水和270g氢氧化钙，混匀浸泡5天(每天搅拌2次)，6天后，用自然水(200L，耗时2h)洗至中性，沥干称重约得6公斤鱼皮(洗掉的鱼鳞弃去)冷藏备用。
2、台秤称取1kg冷藏备用的鱼皮，按料液比1∶5加蒸馏水5L，121℃高压变性60min。
3、双层纱布过滤去除鱼皮残渣，50℃恒温水浴，调pH值为7.0，加入7g枯草杆菌碱性蛋白酶，再加入7g菠萝蛋白酶和7g中性蛋白酶，从加入枯草杆菌碱性蛋白酶开始计时，共自动搅拌酶解5h。
4、水浴灭活(95℃，10min)，降温至50℃～60℃。
5、300目滤布过滤，得滤液体积约5000ml。
6、活性碳柱(K15颗粒碳，径高比1∶4)脱色脱味，加2000ml蒸馏水洗碳柱，洗脱至总液体体积7000ml 7、滤液喷雾干燥，得105克具有美白功效的鱼皮胶原肽。
根据上述工艺制备具有美白功效的胶原肽的实施实例2 1、解冻鱼皮冻块9kg，洗净残肉和血迹，沥干称重得约8kg鱼皮，加40L自然水和240g氢氧化钙，混匀浸泡7天(每天搅拌2次)，7天后，用自然水(200L，耗时2h)洗至中性，沥干称重约得5.5公斤鱼皮(洗掉的鱼鳞弃去)冷藏备用。
2、台秤称取1kg冷藏备用的鱼皮，按料液比1∶5.5加蒸馏水5.5L，121℃高压变性80min。
3、双层纱布过滤去除鱼皮残渣，50℃恒温水浴，调pH值为8.0，加入9g枯草杆菌碱性蛋白酶，再加入9g菠萝蛋白酶和9g中性蛋白酶，从加入枯草杆菌碱性蛋白酶开始计时，共自动搅拌酶解5.5h。
4、水浴灭活(95℃，10min)，降温至50℃～60℃。
5、300目滤布过滤，得滤液体积约5500ml。
6、活性碳柱(K15颗粒碳，径高比1∶4)脱色脱味，加1800ml蒸馏水洗碳柱，洗脱至总液体体积7300ml 7、滤液喷雾干燥，得110克具有美白功效的鱼皮胶原肽。
由本实施实例中工艺制备的具有美白功效的鱼皮胶原肽的产品指标为 总氮≥15.5％ 水分≤5.0％灰分≤2％ 脂肪≤0.5％羟脯氨酸占蛋白质含量(％)8.5～10.0 多肽≥90％ 平均分子量90％≤1000D 其组分90％左右分子量在1000Da以下，其中小分子肽(分子量280Da)含量在50％左右，其理化指标如表1所示 表1鱼皮胶原肽理化指标表
本发明的美白功效研究工作简述如下 1、实验原理 人类皮肤的颜色与皮肤中存在的色素的种类和数量有关，黑色素对皮肤颜色影响最大。黑色素在表皮基底部的黑色素细胞中形成。其过程为黑色素细胞中的酪氨酸在酪氨酸酶的作用下生成多巴、多巴醌最终形成黑色素。酪氨酸酶是黑色素生成的关键酶，抑制酪氨酸酶的活性或阻断酪氨酸生成黑色素的氧化途径即可达到美白的效果。
2材料与设备 2.1受试物 鱼皮胶原肽简称鱼，自制； 其他样品市场上的同类型胶原产品，共计7种，计为样品1-样品7。
2.2主要设备与仪器 2.2.1试剂 酪氨酸酶(Sigma生产，北京化学试剂公司购买)7mg/100ml； L-多巴溶液(上海瀚鸿化工科技有限公司提供)5g/L； 曲酸(北京贝丽莱斯生物化学有限公司提供)20g/L； pH值6.8磷酸缓冲液磷酸二氢钾(AR河南焦作市化工三厂)6.8g、氢氧化钠(AR汕头市西陇化工厂)0.944g定容至1000ml。
2.2.2仪器 恒温水浴锅；武汉市琴台医疗器械厂HH·W21·600型恒温水箱； 紫外分光光度计上海精密科学仪器有限公司722型可见分光光度计； 3试验方法 3.1样品处理用超纯水将受试物配成溶液(酪氨酸酶是铜蛋白，溶液中不应含有铜离子)备用。
3.2实验操作在玻璃试管中进行生化反应，各管加入所需缓冲液(pH6.8磷酸缓冲液)、样品液、曲酸溶液和酶溶液。于37℃水浴中反应10min，依次加入多巴溶液，再于37℃水浴中反应10min，测475nmOD值。实验体系设计见表2。
表2实验体系设计表 注空白对照采用3ml超纯水 3.3实验质控条件 3.3.1曲酸标准对照结果抑制率低于阳性对照。曲酸是常用的美白添加剂，其效应位点和作用机理清楚，酶动力曲线相关关系密切，酪氨酸酶活性抑制强度适中，故将其作为标准对照物用于检验实验操作的准确性和结果的可靠性。
3.3.2OD值实测结果应为阳性对照＞样品(含标准对照)＞阴性对照。
3.4功效评价表示方法 3.4.1抑制率计算方法样品对酪氨酸酶活性的抑制强度以抑制率表示。参照李莉介绍的较简便方法，以阳性对照结果为对照，按以下公式算出抑制率抑制率＝阳性对照吸光值-(样品管吸光值-阴性对照吸光值)/阳性对照吸光值×100％，抑制率高表明其对酶活性抑制强度高。
3.4.2标准品参比为保证实验结果的准确性，在实验室做检测时都应设有标准品对照。我们选用曲酸作为标准对照，将在阳性对照OD值为0.3左右的条件下测得的曲酸抑制率为参比对照标准值。不同批次试验时，曲酸标准对照的抑制率会有所不同，可以将标准对照的抑制率折算成100％，受试物的抑制率等比例变化后再作比较。
4结果与分析 4.1受试物酪氨酸酶抑制率的检测与比较 按照3.2的实验操作进行受试物配成2％浓度进行试验，并通过3.4.2的方法加以折算，结果如表3所示 表3各受试物抑制酪氨酸酶活性效果表(X±s，n＝8) 由表3可以看出，鱼皮胶原肽抑制酪氨酸酶活性或阻断酪氨酸生成黑色素的氧化途径的能力强于市场上的同类产品，其富含的小分子肽(分子量280Da)能够有效地与酪氨酸酶作用，使其失活或阻断酪氨酸生成黑色素的氧化途径。就精密度而言各受试物(包括标准对照)的变异系数(CV)为1.94～12.59％，均符合常规条件变异(RCV)小于15％的要求，大部分符合最佳条件变异(OCV)小于7％的要求。
由以上分析可知，使用本实施实例中工艺制备的具有美白功效的鱼皮胶原肽，除具有一般胶原产品的营养成分外，还拥有市场上同类产品中最强的美白功效，可作为无毒副作用的化妆品或护肤品添加剂，具有广泛的市场前景。
权利要求
1.一种具有美白功效的鱼皮胶原肽，由以下工艺制备而成，所述工艺依次包括下述步骤
1)称取鱼皮原料，清洗，沥干水分，称重。
2)将上述处理的鱼皮加其质量5～6倍的水，再加入其质量3.0～5.0％的氢氧化钙，搅拌均匀浸泡5～7天，在去除鱼皮中的非胶原蛋白的同时，还起到了一定的去腥作用。
3)将上述处理的鱼皮洗净至中性，沥干水分，称重，所得鱼皮即为前处理后的原料。
4)将上述处理后的鱼皮原料按照其质量5～6倍加水，121℃高60～90min，降温至50～60℃，双层纱布滤去残渣，调pH值为6.0～8.0，50℃恒温水浴，首先加入鱼皮原料质量0.5～1.0％的枯草杆菌碱性蛋白酶，再同时加入鱼皮原料质量0.5～1.0％的菠萝蛋白酶和鱼皮原料质量0.5～1.0％的中性蛋白酶，从加入枯草杆菌碱性蛋白酶开始计时，共酶解5～6小时。酶解完毕后，95℃以上，10分钟灭酶，冷却，滤布过滤，滤液为鱼皮胶原肽水解液。
5)将上述滤液用K15活性碳柱脱色脱味。
6)将上述脱色脱味后的滤液浓缩至适当的体积，喷雾干燥，制得成品。
2.按权利要求1所述的鱼皮胶原肽，其特征在于所述鱼皮胶原肽的组分90％的分子量在1000Da以下，其中分子量280Da的小分子肽含量在50％。
3.按权利要求1所述的鱼皮胶原肽，其特征在于所述鱼皮胶原肽的产品指标为
总氮≥15.5％
水分≤5.0％灰分≤2％
脂肪≤0.5％羟脯氨酸占蛋白质含量(％)8.5～10.0
多肽≥90％ 平均分子量90％≤1000D
4.按权利要求1所述的鱼皮胶原肽，其特征在于所述鱼皮胶原肽的分子量分布见下表
5.按权利要求1所述的鱼皮胶原肽，其特征在于所述鱼皮胶原肽的理化指标见下表
6.一种制备具有美白功效的鱼皮胶原肽的工艺，其特征在于依次包括下述步骤
1)称取鱼皮原料，清洗，沥干水分，称重。
2)将上述处理的鱼皮加其质量5～6倍的水，再加入其质量3.0～5.0％的氢氧化钙，搅拌均匀浸泡5～7天，在去除鱼皮中的非胶原蛋白的同时，还起到了一定的去腥作用。
3)将上述处理的鱼皮洗净至中性，沥干水分，称重，所得鱼皮即为前处理后的原料。
4)将上述处理后的鱼皮原料按照其质量5～6倍加水，121℃高压60～90min，降温50～60℃，双层纱布滤去残渣，调pH值为6.0～8.0，50℃恒温水浴，首先加入鱼皮原料质量0.5～1.0％的枯草杆菌碱性蛋白酶，再同时加入鱼皮原料质量0.5～1.0％的菠萝蛋白酶和鱼皮原料质量0.5～1.0％的中性蛋白酶，从加入枯草杆菌碱性蛋白酶开始计时，共酶解5～6小时。酶解完毕后，95℃以上，10分钟灭酶，冷却，滤布过滤，滤液为鱼皮胶原肽水解液。
5)将上述滤液用K15活性碳柱脱色脱味。
6)将上述脱色脱味后的滤液浓缩至适当的体积，喷雾干燥，制得成品。
7.按权利要求6所述的鱼皮胶原肽的制备工艺，其特征在于所制得的鱼皮胶原肽的产品指标为
总氮≥15.5％
水分≤5.0％灰分≤2％
脂肪≤0.5％羟脯氨酸占蛋白质含量(％)8.5～10.0
多肽≥90％ 平均分子量90％≤1000D
8.按权利要求6所述的鱼皮胶原肽的制备工艺，其特征在于所制得的鱼皮胶原肽的分子量分布见下表
9.按权利要求6所述的鱼皮胶原肽的制备工艺，其特征在于所制得的鱼皮胶原肽理化指标见下表
10.一种权利要求1所述的具有美白功效的鱼皮胶原肽作为化妆品或护肤品添加剂的用途。
全文摘要
本发明揭示了一种具有美白效果的鱼皮胶原肽及其制备工艺和用途，具体来说就是利用碱溶液处理鱼皮，再利用蛋白酶水解的方式处理上述鱼皮，通过对水解液进行一系列脱色、脱味、去除杂质的技术处理得到的鱼皮胶原肽及其制备工艺和作为化妆品或护肤品添加剂的用途。本发明的鱼皮胶原肽与一般的胶原肽相比，不仅小分子肽含量高，而且灰分较低，蛋白质含量高，还拥有市场上同类产品中最强的美白功效，作为无毒副作用的化妆品或护肤品添加剂，有广阔的发展前景。
文档编号C07K7/00GK101607982SQ20081004808
公开日2009年12月23日 申请日期2008年6月19日 优先权日2008年6月19日
发明者陈栋梁 申请人:陈栋梁