一种类风湿关节炎自身抗体结合抗原及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物工程领域，尤其是涉及一种新的类风湿关节炎的诊断、治疗用蛋 白。
【背景技术】
[0002] 类风湿关节炎（rheumatoid arthritis, RA)是一种慢性、全身性、自身免疫性疾 病，其特征是外周关节的非特异性、对称性慢性炎症，关节滑膜的慢性炎症、增生，形成血管 翳，侵犯关节软骨、软骨下骨、韧带和肌腱等，造成关节软骨、骨和关节囊破坏，最终导致关 节畸形和功能丧失，部分患者伴不同程度的全身表现。RA在中国是一个常见的多发性自身 免疫疾病，患病率约为0.3% -0.4%，美国本病患者约占人群的1 %，女性发病率较男性高 2-3倍。各年龄组人群均可发病，但25-50岁为本病的好发年龄。目前尚无有效地根治RA、 防治患者受累关节畸形和功能丧失的治疗方法，早期诊断、早期治疗是唯一有效延缓病变 发展、减少不可逆关节病变的措施。
[0003] 1987年美国风湿病学会（ACR)制定的RA诊断标准为病变持续6周，并有以下七个 方面的表现可确诊为类风湿关节炎（RA):①关节运动受阻一小时以上或②关节炎发生三 个以上关节或③关节炎发生在手关节上或④对称性关节炎或⑤风湿性小结在关节上出现 或⑥血清RF阳性或⑦X光显示关节出现变形。2009年ACR修订了 RA诊断标准，以下指标 获得6分及以上肯定RA诊断：①受累关节情况，最高得5分或②血清学抗体检测，包括类风 湿因子（RF)或抗环瓜氨酸肽（CCP)抗体至少一项低滴度阳性的2分，高滴度阳性得3分， 两者均阴性不得分或③滑膜炎持续超过6周得1分或④CRP或ESR增高得1分。从两个标 准可看出，风湿病学专家们已经充分认识到血清学抗体检测在RA诊断中的重要价值。由于 RF对于RA的特异性差，CCP抗体已经成为辅助临床早期诊断和鉴别诊断RA的最特异性实 验室指标。
[0004] 然而，目前临床上常用的CCP抗体检测试剂辅助诊断RA的特异性高达95%，但敏 感性不够，在50-75%之间（Fan LY，et al.ClinicaChimicaActa2010,411: 2049-2053)。因 此，本领域迫切需要开发一种特异性高、灵敏度强的RA相关自身抗原，以满足临床辅助诊 断的检测需求。
【发明内容】
[0005] 本发明提供了一种能够特异性识别样本中RA抗体的多肽。
[0006] 本发明第一方面，提供了一种式I表不的多肽，或其药学上可接受的盐：
[0007] [XaaO]-CEGRS(Cit)RSTSPEER(Cit)GPG-[Xaal]
[0008] 式⑴；
[0009] 其中，XaaO和Xaal分别为无，或1-5个氨基酸构成的肽段。
[0010] 在另一优选例中，所述式I所式的多肽或其衍生多肽具有RA自身抗体的结合活 性。
[0011] 在另一优选例中，所述的XaaO和Xaal分别为1-4个，较佳地为2-3个氨基酸构成 的肽段。
[0012] 在另一优选例中，所述的多肽包括线性肽或非线性肽。
[0013] 在另一优选例中，所述的多肽由Cit和Arg之间、Cit和Cit之间的氢键构成环肽。
[0014] 在另一优选例中，所述的多肽由Cit和Arg之间的氢键构成环肽。
[0015] 本发明第二方面，提供了一种偶联蛋白，所述的偶联蛋白具有以下结构：
[0016] Y-X
[0017] 其中，
[0018] Y为载体蛋白；
[0019] X为式I所示的多肽；
[0020] 表示连接X和Y的肽键或肽接头。
[0021] 在另一优选例中，所述的载体蛋白包括牛血清白蛋白（BSA)，或血蓝蛋白（KLH)。
[0022] 在另一优选例中，本发明还提供了一种分离的核苷酸，其编码权利要求1所述的 多肽。
[0023] 本发明第三方面，提供了一种类风湿关节炎诊断抗原组合，所述的抗原组合包括 本发明第一方面所述的多肽或本发明第二方面所述的偶联蛋白，和选自以下一种或两种的 多肽：
[0024] CGRPGTAS(Cit)PSTSTRYVT 式 II，
[0025] CEESA(Cit)HLL(Cit)EYQDINVK 式 III。
[0026] 本发明第四方面，提供了本发明第一方面所述多肽、本发明第二方面所述偶联蛋 白，或本发明第三方面所述的抗原组合的用途，用于制备检测样本中类风湿关节炎自身抗 体、和/或制备诊断类风湿关节炎的试剂或试剂盒。
[0027] 在另一优选例中，所述的样本包括血液样本、关节液样本。
[0028] 在另一优选例中，所述的血液样本包括血清、血浆和/或全血。
[0029] 在另一优选例中，所述的检测为早期检测。
[0030] 在另一优选例中，所述的早期指的是类风湿关节炎发病在1年半之内。
[0031] 本发明第五方面，提供了一种检测板，所述的检测板包括基片（支撑板）、测试条， 所述的测试条固定有本发明第一方面所述的多肽或其衍生多肽、本发明第二方面所述的偶 联蛋白，或本发明第三方面所述的抗原组合。
[0032] 在另一优选例中，所述的测试条由滤样纸、层析材料、硝酸纤维素膜和吸水纸依次 搭接组成。
[0033] 在另一优选例中，所述层析材料预包被有经胶体金标记或有色标记的权利要求1 所述的多肽或其衍生多肽、权利要求3所述的偶联蛋白，或权利要求5所述的抗原组合。 [0034] 本发明第六方面，提供了一种试剂盒，所述的试剂盒含有一容器，和位于容器内的 (i)本发明第五方面所述的检测板；或（ii)本发明第一方面所述的多肽或其衍生多肽、本 发明第二方面所述的偶联蛋白，或本发明第三方面所述的抗原组合；和（iii)使用说明书。
[0035] 在另一优选例中，所述的说明书记载了检测样本中是否存在类风湿关节炎自身抗 体的方法，包括步骤：
[0036] (a)将样本与本发明第一方面所述多肽、或本发明第二方面所述偶联蛋白，或本发 明第三方面所述的抗原组合接触；
[0037] (b)检测是否形成抗原-抗体复合物，其中，形成复合物就说明样本中存在类风湿 关节炎自身抗体。
[0038] 在另一优选例中，所述的试剂盒还含有抗本发明第一方面所述的多肽或其衍生多 肽、本发明第二方面所述的偶联蛋白，或本发明第三方面所述的抗原组合的抗体，用于阳性 对照。
[0039] 本发明第七方面，提供了一种体外非诊断性的检测样本中是否存在类风湿关节炎 自身抗体的方法，包括步骤：
[0040] (a)将样本与本发明第一方面所述多肽、或本发明第二方面所述偶联蛋白，或本发 明第三方面所述的抗原组合接触；
[0041] (b)检测是否形成抗原-抗体复合物，其中，形成复合物就说明样本中存在类风湿 关节炎自身抗体。
[0042] 在另一优选例中，所述的诊断为早期诊断，和/或所述对象为类风湿关节炎疑似 患者。
[0043] 本发明第八方面，提供了一种诊断类风湿关节炎的方法，包括步骤：
[0044] (a)将检测对象的样本与本发明第一方面所述多肽或其衍生多肽、或本发明第二 方面所述偶联蛋白，或本发明第三方面所述的抗原组合接触；
[0045] (b)检测是否形成抗原-抗体复合物，其中，形成复合物就说明所述对象患有类风 湿关节炎。
[0046] 在另一优选例中，所述的样本包括血、关节液。
[0047] 应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文（如实施例）中具 体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。
【附图说明】
[0048] 图1显示了精氨酸在肽精氨酸脱亚胺基酶、水分子和钙离子的作用下进行脱氨并 释放出氢离子而形成瓜氨酸的反应过程。
[0049] 图2显示了在三羧酸循环和尿素代谢中，主要以鸟氨酸氨基甲酰转移酶和氨基甲 酰合成酶的作用下，氨基甲酰磷酸与瓜氨酸（Cit)之间可作转化代谢，从而在多肽蛋白合 成代谢中产生精氨酸（R)的非正常衍生物瓜氨酸（Cit)多肽的反应过程。
[0050] 图3显示了当精氨酸的衍生物瓜氨酸在蛋白多肽代谢中形成后，其多肽中的精氨 酸和瓜氨酸在结构上，精氨酸与瓜氨酸或瓜氨酸与瓜氨酸可能会形成环化结构的二种模 式。
[0051] 图4显示了 CCP5F、CCP5G、CCP5H多肽-BSA偶联蛋白质的氨基酸顺序，其中BSA为 牛血清蛋白，瓜氨酸（Cit)是从精氨酸（R)代谢中的衍生物。瓜氨酸（Cit)和瓜氨酸（Cit) 之间和或瓜氨酸（Cit)和精氨酸（R)之间的边线为其多肽结构中可能存在的环化。例如， 在CCP5G的二个环化连线中，链线（1)和链线（2)是两种环化可选择的可能性（也是造成 抗原多样性一方面）或除了瓜氨酸（Cit)三字母代码外，其它英文字母为氨基酸单字母代 码。
[0052] 图5显示了制备的抗CCP5F、CCP5G和CCP5H抗血清经三倍系列稀释后分别与对应 多肽-BSA抗原蛋白反应，并经二抗-HRP信号放大反应后，在96孔ELISA板上显示出不同 中的吸光度（OD)和梯度曲线，以代表羊抗CCP5F-H抗体与CCP5F-H抗原的效价。
【具体实施方式】
[0053] 本发明人经过广泛而深入的研究，通过对多种商品化类风湿关节炎自身抗原 (CCP)进行了研究，对这些抗原结构进行了变构、变性改造，并对合成的多肽进行了大量筛 选，从而获得了数十种具有新构型的环化瓜氨酸多肽并制备了含有这些多肽的偶联蛋白， 然后，通过对含有这些多肽的偶联蛋白与RA血清内自身抗体的结合反应性研究，进一步筛 选到数条具有与RA血清自身抗体结合活性的多肽，其中，以本发明多肽（CCP5G)的反应性 最佳，而将这些多肽进行组合后，也能够有良好的反应性效果。此外，本发明人采用本发明 多肽对大量临床病例进行了验证，实验证明，在RA患者，尤其是早期RA患者中，本发明多肽 的阳性检出率显著高于现有的CCP检测，因此本发明多肽可用于对RA患者尤其是早期患者 的诊断和检测，其特异性