清平均吸光度值（A1)除以混合正常阴性血清的平均吸光度值，其商（A1Atl)即为混合阳性 血清抗CCP5G单位（U)。以混合阳性血清用含10%牛血清/PBS中作系列稀释，在测定后得 到相应的吸光度值，然后再和以混合正常人阴性血清的抗CCP5G检测平均吸光度值（Atl)相 除获得的商值，分别作为各阳性对照品的抗CCP5G单位（RU/ml)。在本发明中，以参考方法 测得的IRU/ml的血清样本，再用CCP5G ELISA测定，得到的吸光度值就当作是CCP5G试剂 测得的IRU/ml，待测样本检测获得的吸光度值除以此吸光度值，获得的倍数就是该样本中 CCP5G抗体的RU/ml，该方法获得的称为相关单位。
[0117] 5. 2本发明检测方法与临床四种方法对RA患者的确诊率对照
[0118] 用单盲法将配制的试剂、材料和操作方法检测90例已在临床确诊为RA(源自上海 市东方医院、上海市光华风湿病综合医院）的患者新鲜血清检测抗CCP5G自身抗体，还同时 对 CCP、CRP、IgG-RF、IgM-RF 作比较检测。
[0119] CCP的检测是用进口试剂盒（德国欧蒙医学实验诊断股份公司的抗CCP抗体 ELISA检测试剂盒）和其相应的标准（即大于25. ORU/ml为阳性），CRP和RF-IgG、RF-IgM 为西门子特定蛋白仪及其免疫比浊法配套试剂，CRP>8mg/L为" + "阳性、RF-IgG测定结果大 于16g/L、IgM-RF的测定结果大于2. 3g/L为异常升高。
[0120] 用四种对照方法的临床90例患者结果都一一与CCP5G间接ELISA结果作比较，并 采用2x2卡方（X2)检验方法进行统计学处理。在90例类风湿关节炎（RA)患者中，首先进 行以男女性别分组处理，其结果发现所有5项指标之间都没有男女性别的差异（未示出）。
[0121] 5.2. 1以年龄方面分组（如表3所示），男女平均年龄都小于40岁的有16个样本， 其RA的发病史在平均5年左右。通过统计结果分析，RA患者的CCP5G结果与CRP、RF-IgG、 RF-IgM测定结果没有显著差异。然而，CCP5G的阳性率为68. 8% (11/16)，而CCP只有 37. 5% (6/16)，两者之间结果经卡方检验的统计学分析显示，它们之间的差异有显著意义。
[0122] 结果说明，CCP5G自身抗体对40岁以下年龄组的检出率比CCP自身抗体要高得多。
[0123] 表3. CCP5G ELISA在诊断年轻RA患者中的诊断价值
[0124]
[0125] 5. 2. 2为了说明检测CCP5G的自身抗体能作为RA早期诊断的一个首选指标，从90 例RA患者中选出其发病史短于1年半的22例患者血清测定数据编成一组（如表4所示）。 以如上相同的五种检出方法作比较，其中抗CCP5G自身抗体的检出率不仅最高，而且它与 CCP结果比较有着非常显著的差异（P〈0. 01)。
[0126] 由此可见，抗CCP5G自身抗体的检测是对RA患者发病早期诊断的好方法。
[0127] 表4. CCP5G ELISA在诊断早期RA中的价值
[0128]
[0129] 5. 2. 3将所有90例RA患者以男女性别分开，以患者血清的五项检测指标（包括 CCP5G、CCP、CRP、RF-IgG、RF-IgM)结果陈列于表5中。所有90例RA患者的平均年龄在 53. 8岁左右，平均发病史在5. 8年左右，他们的性别与发病和检测结果没有差异。
[0130] 通过对包括CCP5G、CCP、CRP、IgG-RF、IgM-RF五项检测指标的结果进行两两X 2卡方检验和统计学处理。除了 CRP外，抗CCP5G自身抗体的检测结果都与CCP、IgG-RF和 IgM-RF的结果有着非常显著的差异。
[0131] 即抗CCP5G自身抗体与其它三者CCP、IgG-RF和IgM-RF结果比较，其检出率高，灵 敏性强，并且它的阳性高低与临床症状和诊断符合率高。
[0132] 表5. CCP5G ELISA在诊断RA中的价值
[0133]
[0135] 进一步分析90例患者检测结果，可以看到虽然CRP与抗CCP5G自身抗体的结果没 有明显的差异，但是这90例标本是以临床上诊断RA阳性患者的血清标本，而CRP是一个急 性时相反应蛋白，其与疾病的活动度有一定关系，但作为诊断特异性公认为不高。
[0136] 综上所述，抗CCP5G自身抗体检测的特异性和检出率总体上，比抗CCP自身抗体检 测要好和高许多。比如在这组90 RA患者中检测指标与临床诊断符合情况为，CCP5G有19 例漏检或为阴性（21. 1 % )，而CCP却有32例漏检或为阴性（35. 4% )，其比较有显著差异 (Ρ〈0· 05)。
[0137] 如果将漏检或阴性的RA病例作CCP5G和CCP两两比较，在CCP5G的19例阴性中， CCP只有4例为阳性占21% ;而在CCP 32例阴性中，CCP5G却有17例为阳性占53. 1% ;在 CCP 58例阳性，CCP5G仅6例阴性占10. 3%。虽然其漏检或为阴性结果的真正原因和二边 的误差性都有待于探讨和研究，但是从这些结果的比较上看，CCP5G比CCP检出阳性率显著 高，其意义是非常明显的。
[0138] 抗CCP5G自身抗体的检测不仅敏感性能达到CRP那样高，其特异性也非常好。在 这五个项目检测中，都以100例正常人血清的平均值为阴性的低值（基础值）。
[0139] 讨论：
[0140] 本发明人认为，当精氨酸的衍生物瓜氨酸在蛋白多肽中形成后，其多肽中的精氨 酸和瓜氨酸在结构上，精氨酸与瓜氨酸或瓜氨酸与瓜氨酸会形成环化结构（如图3所示）， 并且这样的变性变构型环瓜氨酸多肽结构更容易被人体的免疫机制所识别成为自身抗原， 这可能就是潜在的类风湿关节炎（RA)或自身免疫疾病的重要发病机制之一，也是本发明 的理论基础。
[0141] CCP5G在结构上有着一个或一个以上环状结构。虽然这个环多肽是人工合成的，但 是模拟了 RA患者血清中自身抗原的一些蛋白质多肽在代谢中的变性变构的性质。
[0142] 本发明CCP5G变性变构型环瓜氨酸多肽是根据多肽结构和RA的自身抗原结构为 依据，独立创新设计的一种新型、具有临床诊断意义，特别是对RA病可作早期诊断价值的 人工合成自身抗原。为此建立了一个特异强、稳定性好、敏感性高的间接ELISA CCP5G诊断 新方法。用单盲法对临床上90例类RA患者检出结果显示，它不仅可作RA的诊断和早期诊 断指标，而且比目前已临床上开展的CCP、CRP、IgG-RF和IgM-RF，特别是比CCP检出方法要 优越得许多，是今后将会发展成一个在中国乃至在世界对RA诊断方面可靠、可依赖早期诊 断和首选的方法。检出这一 CCP5G自身抗体也是临床上对RA进行早期治疗或预防的一个 非常有价值参考的指标，同时也可作为RA病程发展指标。
[0143] 在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独 引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可 以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范 围。
【主权项】
1. 一种式I表示的多肽，或其药学上可接受的盐： [XaaO]-CEGRS(Cit)RSTSPEER(Cit)GPG-[Xaal] 式⑴； 其中，XaaO和Xaal分别为无，或1-5个氨基酸构成的肽段。2. 如权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述的多肽包括线性肽或非线性肽。3. -种偶联蛋白，其特征在于，所述的偶联蛋白具有以下结构： Y-X 其中， Y为载体蛋白； X为式I所示的多肽； 表示连接X和Y的肽键或肽接头。4. 如权利要求3所述的偶联蛋白，其特征在于，所述的载体蛋白包括牛血清白蛋白 (BSA)，或血蓝蛋白（KLH)。5. -种类风湿关节炎诊断抗原组合，其特征在于，所述的抗原组合包括权利要求1所 述的多肽或权利要求3所述的偶联蛋白，和选自以下一种或两种的多肽： CGRPGTAS(Cit)PSTSTRYVT 式 II， CEESA(Cit)HLL(Cit)EYQDINVK 式 III。6. 权利要求1所述多肽、权利要求3所述偶联蛋白，或权利要求5所述的抗原组合的用 途，其特征在于，用于制备检测样本中类风湿关节炎自身抗体、和/或制备诊断类风湿关节 炎的试剂或试剂盒。7. 如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述的检测为早期检测。8. -种检测板，其特征在于，所述的检测板包括基片（支撑板）、测试条，所述的测试条 固定有权利要求1所述的多肽或其衍生多肽、权利要求3所述的偶联蛋白，或权利要求5所 述的抗原组合。9. 一种试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒含有一容器，和位于容器内的（i)权利要求 7所述的检测板；或（ii)权利要求1所述的多肽或其衍生多肽、权利要求3所述的偶联蛋 白，或权利要求5所述的抗原组合；和（iii)使用说明书。10. -种体外非诊断性的检测样本中是否存在类风湿关节炎自身抗体的方法，其特征 在于，包括步骤： (a) 将样本与权利要求1所述多肽、或权利要求3所述偶联蛋白，或权利要求5所述的 抗原组合接触； (b) 检测是否形成抗原-抗体复合物，其中，形成复合物就说明样本中存在类风湿关节 炎自身抗体。
【专利摘要】本发明为一种类风湿关节炎自身抗体结合抗原及其应用。本发明公开了一种新型的类风湿关节炎抗体的检测抗原，具体地，所述的检测抗原可以作为RA的诊断和早期诊断指标，并优于临床上开展的CCP、CRP、IgG-RF和IgM-RF等的检测，因此可作为临床上对RA进行早期治疗或预防的一个非常有价值参考的指标，同时也可作为RA病程发展指标。
【IPC分类】C07K7/64, C07K14/765, G01N33/68, C07K14/795
【公开号】CN104987366
【申请号】CN201410415275
【发明人】范列英, 宗明
【申请人】上海市东方医院
【公开日】2015年10月21日
【申请日】2014年8月21日