LISA反应 板等；所述的测试条由滤样纸、层析材料、硝酸纤维素膜和吸水纸依次搭接组成，搭接部位 可以采用常规的方法，如胶带等固定连接；其中：层析材料预包被胶体金标记或有色标记 的本发明多肽或其偶联蛋白。
[0085] 检测方法与结果判定：
[0086] 平放检测板，将样本（如血清）滴加在滤样纸上，L 5_5min内观察层析结果。根据 出现的条纹位置来判断结果。
[0087] 阴性：质控区、检测区均出现明显的色带，示为阴性；阳性：只在质控区出现明显 色带，而在检测区无色带，示为阳性；无效：质控区、检测区无任何色带或在质控区未出现 色带而在检测区出现色带，表明检测方法错误或检测板变质或失效，应重新换取检测板检 测。
[0088] 试剂盒
[0089] 本发明还提供了一种检测RA相关抗体的试剂盒。一般地，本发明的试剂盒可以含 有上述的检测板，或所述的试剂盒可以包括以下组分：容器或载体；以及位于所述容器内 或载体上的本发明多肽或其偶联蛋白。在另一优选例中，所述试剂盒还包括酶结合液、反应 底物和任选的说明书。较佳地，所述的试剂盒还可包括选自下组的组分：反应终止液、样本 稀释液、和洗涤液。一种优选的可用于检测RA相关抗体的试剂盒包括：容器以及位于容器 内的包被液、辣根过氧化物酶标记的鼠抗人IgG (H+L)抗体、底物液TMB、稀浓硫酸反应终止 液和样本稀释液。更佳地，还含有空白对照、阳性和阴性对照和作以监控检测过程是否符合 标准。
[0090] 本发明的有益效果：
[0091] 利用本发明CCP5G多肽作为检测RA相关抗体的抗原，敏感性高，特异性也较高， 能够有效地诊断RA，尤其是早期RA的患者，比目前已临床上开展的CCP、CRP、IgG-RF和 IgM-RF，特别是比CCP检出方法要优越得许多。此外，制备获得的本发明多肽的多克隆抗 体，可用于RA的特异性治疗。
[0092] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条 件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量 份数。
[0093] 实施例1 CCP5F-H多肽及其BSA偶联蛋白的制备、鉴定与保存
[0094] 按常规多肽合成方法制备获得本发明CCP5F、CCP5G和CCP5H多肽，经鉴定它们的 理化特性分别为：
[0095] 本发明CCP5F多肽为18个氨基酸长的环状多肽（图4)，分子量为2100. 85道尔 顿（Dal)，在与BSA偶联之前，氨基（-NH2)末端的修饰为氢链（H)，羟基（COOH)末端的修饰 为羟基（OH)。HPLC的Discovery HS C-18柱中，它在220um波长的迁移紫外吸收峰为在 0-2分钟达到95% A峰（主峰），在2~10分钟后为5%的B峰。此多肽经BSA偶联后，浓 度仍然按照CCP5F多肽的浓度计算（BSA为载体，浓度在反应中忽略不计），经冷冻干燥后， 配成1.0 mg/ml在PBS缓冲液中（可溶性佳）的多肽蛋白溶液并经0. 22um过滤，无菌保存 在4 °C冰箱中。
[0096] 本发明CCP5G多肽为18个氨基酸长的多肽（图4)，分子量为1967. 23道尔顿 (Dal)，在与BSA偶联之前，氨基（-NH2)末端的修饰为氢链（H)，羟基（COOH)末端的修饰为 羟基（OH)。HPLC的Discovery HS C-18柱中，它在220um波长的迁移紫外吸收峰为在0-2 分钟达到95% A峰（主峰），在2-10分钟后为5%的B峰。此多肽经BSA偶联后，浓度仍 然按照CCP5G多肽的浓度计算（BSA为载体，浓度在反应中忽略不计），经冷冻干燥后，配成 1.0 mg/ml在PBS缓冲液中（可溶性佳）的多肽蛋白溶液并经0· 22um过滤，无菌保存在4°C 冰箱中。
[0097] 本发明CCP5H多肽为18个氨基酸长的环状多肽（图4)，分子量为2239. 24道尔顿 (Dal)，在与BSA偶联之前，氨基（-NH2)末端的修饰为氢链（H)，羟基（COOH)末端的修饰为 羟基（OH)。HPLC的Discovery HS C-18柱中，它在220um波长的迁移紫外吸收峰为在0-2 分钟达到95% A峰（主峰），在2~10分钟后为5%的B峰。此多肽经BSA偶联后，浓度仍 然按照CCP5e多肽的浓度计算（BSA为载体，浓度在反应中忽略不计），经冷冻干燥后，配成 1.0 mg/ml在PBS缓冲液中（可溶性佳）的多肽蛋白溶液并经0· 22um过滤，无菌保存在4°C 冰箱中。
[0098] 实施例2 CCP5F、CCP5G和CCP5H多肽特征和抗原抗体的比较
[0099] CCP5F、CCP5G和CCP5H多肽BSA偶联蛋白，分别用加强免疫法免疫美国得克萨斯 州的纯种山羊，以产生较高滴度的抗血清。图5鉴定抗CCP5F-H抗体与抗原的反应性（反 应滴度），抗CCP5F-H抗血清经三倍系列稀释后与对应的抗原CCP5G多肽-BSA抗原蛋白反 应，并经二抗-HRP信号放大反应后，在96孔ELISA板上显示出不同中的吸光度（OD)和梯 度曲线，以代表羊抗CCP5F、CCP5G和CCP5H抗体的效价。
[0100] 羊抗CCP5F-H抗血清ELISA效价反应的鉴定，方法和步骤为：在PBS中CCP5F-H以 〇. 5微克/微升（ug/ml)的浓度100微升/孔（ul/well)包被于96孔ELISA板上（MaxiSorb plate，Nunc, Inc.)室温过夜。第二天，用I. 5%BSA/PBST(牛血清白蛋白/磷酸盐/吐温-20 缓冲液）封闭一小时，然后分别加上已经三倍系列稀释的羊抗CCP5F、CCP5G、CCP5H和相应 的羊的血清（在免疫羊之前收集的，作为本底对照），室温反应1小时；用PBST洗涤三次后 加上100ul/well经1 : 4000稀释后的HRP偶联的兔抗羊抗体（美国Jackson ImmunoLab 公司），室温哺育反应1小时，再用PBST洗涤四次后，加 HRP的底物TMB和过氧化氢溶液 进行显色；最后在Dynatech MR5000酶标阅读仪上取λ = 450nm波长阅读OD值和λ = 590nm波长参比OD值（减少本底的读数）而取得相对的抗体滴度效价。从图5的结果上， CCP5G抗体效价达1:6000 土，效价最高，CCP5F抗体和CCP5H抗体效价分别为1:2000 土和 1:1500土。
[0101] 从图5中可以看到，在免疫羊血清本底对照组中，CCP5F-H有一些本底，原因可能 此类动物羊的聚球蛋白与BSA有一些非特异性的吸附，或者在兔抗羊抗体中有非特异性反 应，但是这些本底并不是太高，不会影响到测定的OD读数。
[0102] 实施例3 CCP5F-H多肽的BSA偶联蛋白与临床上应用CCP多肽蛋白的诊断价值和 意义比较
[0103] 选择临床常用的CCP方法作为参考方法（试剂盒购自德国欧蒙医学实验诊断股份 公司）对21例类风湿关节炎（RA)患者血清测定，将其低、中和高三种结果各7例RA血清 选出，同时随机选取20例正常人血清进行混合。将混合正常人血清分别稀释此21例高、中 和低CCP值的RA患者血清（稀释至理论正常参考范围）。然后用参考方法和CCP5F~H的 ELISA分别进行检测，所得结果如表1所示。
[0104] 表1在检测临界值区域CCP抗体与CCP5F~H比较
[0105]
[0106] 表1可见，当将CCP5F、CCP5G和CCP5E蛋白多肽和CCP多肽互相比较，CCP5G为抗 原的ELISA检测CCP抗体的值相对最高、CCP5F次之，CCP5H相对较低。
[0107] 实施例4 CCP5G多肽的KLH偶联蛋白的制备、鉴定与保存
[0108] 采用锁孔血蓝蛋白（KLH，约56kDa分子量大小）制备了 CCP5G多肽的KLH偶联蛋 白。
[0109] 将实施例1中的BSA偶联蛋白和本实施例的KLH偶联蛋白分别以0.5ug/mL， lOOul/well包被于96孔ELISA反应板上并室温过夜，反应板封闭后，将已经1:100稀释的 混合正常人血清（用德国欧蒙医学实验诊断股份公司的抗CCP抗体ELISA检测试剂盒而检 测到CCP约为1个单位）和1:100稀释的已用欧蒙试剂盒检测过的RA患者血清（CCP中度 阳性）lOOul/well加在已包被和封闭好的ELISA反应板上，室温1小时后洗涤三次，再加 100111/冊11以1:30,000稀释!11^偶联的羊抗人186，室温1小时后再洗涤四次，加!11^底 物溶液（TMB和过氧化氢）并显色10分钟，读取OD 450/590nm值，表2显示了 BSA和KLH 分别偶联的CCP5G与正常人和RA患者血清反应的比较。
[0110]
[0111] 注：RA患者血清的阳性对照是以已临床测定的RF、IgM-RFXRP和CCP等的中间值 域（0D值）的患者血清（各3例）混合而成。CCP5G RU/ml是由取各3份混合阳性血清OD 值及各3份混合正常人血清OD值除得平均值为相应的抗CCP5单位（RU/ml)(重复三次）。
[0112] 从表3的结果分析看，KLH偶联的CCP5G也能够用于RA的检测，但BSA偶联的 CCP5G更优。
[0113] 实施例5间接ELISA法测定样本内抗CCP5G抗体以及与现有方法的比较
[0114] 5. 1抗CCP5G单位的定义
[0115] 本实施例采用间接ELISA法，临床上的血清标本用生理盐水作1 : 100稀释后为 样本进行检测。酶标的封闭液采用1. 5 % BSA/1. 0 %牛血清/PBST缓冲液（pH7. 4的磷酸盐、 Tween-20和牛血清白蛋白缓冲液）。
[0116] CCP5G蛋白多肽诊断单位的定值，采用10份CCP5G阳性血清和10份混合正常人血 清（其CCP值在1.0 RU/ml，即欧蒙公司相对单位）进行间接ELISA检测并重复3次，然后分 别计算其混合阳性血清和混合正常人阴性血清的平均吸光度值。其中，定义该混合正常人 阴性血清的抗CCP5G自身抗体水平吸光度值（Atl)的为一个抗CCP5G单位。再将混合阳性血