高、灵敏度强。在此基础上，完成了本发明。
[0054] 类风湿关节炎
[0055] 类风湿关节炎（rheumatoid arthritis, RA)是一种慢性、全身性、自身免疫性疾 病，其特征是外周关节的非特异性、对称性慢性炎症，关节滑膜的慢性炎症、增生，形成血管 翳，侵犯关节软骨、软骨下骨、韧带和肌腱等，造成关节软骨、骨和关节囊破坏，最终导致关 节畸形和功能丧失，部分患者伴不同程度的全身表现。RA在中国是一个常见的多发性自身 免疫疾病。
[0056] 目前，RA的发病机制尚未完全阐明，且也未出现有效地根治RA、防治患者受累关 节畸形和功能丧失的治疗方法。
[0057] RA相关抗体
[0058] 在RA患者血清中可检测多种抗体，包括类风湿因子、RA33抗体、抗II性胶原抗 体、抗环瓜氨酸肽抗体（CCP抗体）等等。其中CCP抗体是目前公认的辅助诊断RA的特异 性最高的指标。但是目前市售的不同品牌CCP抗体试剂检测均存在着检测结果对RA诊断 敏感度不高的缺憾，特别是对早期RA诊断敏感度低于50 %，导致部分早期RA得不到及时诊 断和治疗。
[0059] 瓜氨酸
[0060] 瓜氨酸不是人体内的天然氨基酸、也不是代谢必须氨基酸，而由是精氨酸在体内 去氨基后的衍生物。如图1所示，肽链中的精氨酸在肽精氨酸脱亚胺酶（PAD = P印tidgl arginine deiminase)、水分子和钙离子的作用下进行脱氨并释放出氢离子而形成瓜氨酸 (Citrulline or Cit) 〇
[0061] 精氨酸（Arginine, Arg or R)与赖氨酸（Lysine, Lys or K)和组氨酸 (Histidine, His or H) -样是一种碱性氨基酸，是人体20种天然氨基酸之一，也是人体正 常蛋白质合成、分解代谢中（如三羧酸循环）不可缺少的原料之一。
[0062] 瓜氨酸也是在三羟酸循环和尿素代谢中的中间体。如图2所示，在三羧酸循环和 尿素代谢中，主要以鸟氨酸氨基甲酰转移酶和氨基甲酰合成酶的作用下，氨基甲酰磷酸与 瓜氨酸（Cit)之间可作转化代谢，从而在多肽蛋白合成代谢中产生精氨酸（R)的非正常衍 生物瓜氨酸（Cit)多肽。
[0063] 如果在人体蛋白质多肽链中，过多地出现瓜氨酸，一方面该受累蛋白的许多生物 学特性、甚至功能将发生改变，另一方面此多肽蛋白就可能被人体的免疫机制看作是一个 外来抗原而产生自身抗体。自身抗体与抗原的结合物会沉积在人体一些关节中，激活补体 而造成局部组织损伤，是潜在的类风湿关节炎（RA)病的发病基础。
[0064] 活性多肽
[0065] 在本发明中，术语"本发明多肽"、"CCP5G多肽"、"本发明变性变构型瓜氨酸多肽"、 "本发明环瓜氨酸多肽"可互换使用，都指具有类风湿关节炎自身抗体结合活性的肽CCP5G 氨基酸序列的蛋白或多肽。此外，所述术语还包括具有类风湿关节炎自身抗体结合活性的、 SEQ ID NO :1序列的变异形式。这些变异形式包括（但并不限于）：在C末端和/或N末端 添加或缺失一个或数个（通常为5个以内，较佳地为3个以内，更佳地为1-2个以内）氨基 酸。例如，在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的 结构和功能。此外，所述术语还包括单体和多聚体形式本发明多肽。
[0066] 本发明多肽还包括线性以及非线性的多肽（如环肽）。优选地，本发明多肽为环肽 形式，例如，本发明多肽的Cit和Arg之间、Cit和Cit之间可形成氢键，从而构成结构稳定 的环肽。更优选地，本发明的多肽结构如下所示：
[0067] CEGRS(Cit)RSTSPEER(Cit)GPG 式（I)
[0068] 本发明还包括CCP5G多肽的活性片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语"片 段"、"衍生物"和"类似物"是指基本上保持类风湿关节炎自身抗体结合活性的多肽。本发 明的多肽片段、衍生物或类似物可以是（i)有一个或几个保守或非保守性氨基酸残基（优 选保守性氨基酸残基）被取代的多肽，或（ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的 多肽，或（iii)CCP5G多肽与另一个化合物（比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇、 载体蛋白（优选为BSA和KLH))融合所形成的多肽，或（iv)附加的氨基酸序列融合于此多 肽序列而形成的多肽（与前导序列、分泌序列或6His等标签序列融合而形成的然后蛋白）。 根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
[0069] 发明还提供CCP5G多肽的类似物。这些类似物与天然CCP5G多肽的差别可以是氨 基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。类似物还包 括具有不同于天然L-氨基酸的残基（如D-氨基酸）的类似物，以及具有非天然存在的或 合成的氨基酸（如β、Y-氨基酸）的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的 代表性的多肽。
[0070] 修饰（通常不改变一级结构）形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙 酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进 行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶（如哺乳动 物的糖基化酶或去糖基化酶）而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基（如磷酸酪 氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸）的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优 化了溶解性能的多肽。
[0071] 本发明多肽还可以以由药学上或生理学上可接受的酸或碱衍生的盐形式使用。这 些盐包括（但不限于）与如下酸形成的盐：氢氯酸、氢溴酸、硫酸、柠檬酸、酒石酸、磷酸、乳 酸、丙酮酸、乙酸、琥珀酸、草酸、富马酸、马来酸、草酰乙酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、或羟乙 磺酸。其他盐包括：与碱金属或碱土金属（如钠、钾、钙或镁）形成的盐，以及以酯、氨基甲 酸酯或其他常规的"前体药物"的形式。
[0072] 此外，本发明还提供了一种抗原组合，即将本发明多肽与其他相同用途的多肽进 行组合。通常，这些组合中的多肽数量可以为一个或多个，优选地，所述其他相同用途的多 肽也能够与血清中类风湿关节炎抗体结合，例如如式II或式III所示的多肽：
[0073] CGRPGTAS(Cit)PSTSTRYVT 式 II (SEQ ID NO. :2)，
[0074] CEESA(Cit)HLL(Cit)EYQDINVK 式 III(SEQ ID NO. :3)。
[0075] 将式I-III的抗原联合应用于类风湿关节炎抗体，能够提高单一抗原的抗原-抗 体识别反应率，从而进一步提1?抗体的检出率。
[0076] 多肽的制备方法
[0077] 本发明多肽可以是重组多肽或合成多肽。本发明的多肽可以是化学合成的，或重 组的。相应地，本发明多肽可用常规方法人工合成，也可用重组方法生产。
[0078] -种优选的方法是使用液相合成技术或固相合成技术，如Boc固相法、Fmoc固相 法或是两种方法联合使用。固相合成可快速获得样品，可根据目的肽的序列特征选用适当 的树脂载体及合成系统。例如，Fmoc系统中优选的固相载体如连接有肽中C端氨基酸的 Wang树脂，Wang树脂结构为聚苯乙烯，与氨基酸间的手臂是4-烷氧基苄醇；用25%六氢吡 啶/二甲基甲酰胺室温处理20分钟，以除去Fmoc保护基团，并按照给定的氨基酸序列由C 端逐个向N端延伸。合成完成后，用含4%对甲基苯酚的三氟乙酸将合成的胰岛素原相关 肽从树脂上切割下来并除去保护基，可过滤除树脂后乙醚沉淀分离得到粗肽。将所得产物 的溶液冻干后，用凝胶过滤和反相高压液相层析法纯化所需的肽。当使用Boc系统进行固 相合成时，优选树脂为连接有肽中C端氨基酸的PAM树脂，PAM树脂结构为聚苯乙烯，与氨 基酸间的手臂是4-羟甲基苯乙酰胺；在Boc合成系统中，在去保护、中和、偶联的循环中，用 TFA/二氯甲烷（DCM)除去保护基团Boc并用二异丙基乙胺（DIEA/二氯甲烷中和。肽链缩 合完成后，用含对甲苯酚（5-10% )的氟化氢（HF)，在0°C下处理1小时，将肽链从树脂上 切下，同时除去保护基团。以50-80%乙酸（含少量巯基乙醇）抽提肽，溶液冻干后进一步 用分子筛Sephadex GlO或Tsk_40f分离纯化，然后再经高压液相纯化得到所需的肽。可以 使用肽化学领域内已知的各种偶联剂和偶联方法偶联各氨基酸残基，例如可使用二环己 基碳二亚胺（DCC)，羟基苯骈三氮唑（HOBt)或1，1，3, 3-四脲六氟磷酸酯（HBTU)进行直接 偶联。对于合成得到的短肽，其纯度与结构可用反相高效液相和质谱分析进行确证。
[0079] 在一优选例中，本发明多肽CCP5F、CCP5G和CCP5H，按其序列，采用固相合成的方 法制备，行高效液相色谱纯化，获得高纯度目的肽冻干粉，-20°C贮存。
[0080] 此外，本发明多肽和蛋白质载体的连接可使用本领域已知的任何连接方式以构成 偶联蛋白。例如但不限于：碳二亚胺法（EDC)、戊二醛法等。
[0081] 可用于本发明的蛋白质载体包括（但不限于）：牛血清白蛋白（BSA)、血蓝蛋白 (KLH)。优选地，为BSA。
[0082] RA相关抗体检测板
[0083] 可采用本领域常规检测技术，利用本发明多肽或其偶联蛋白对样本内的RA相关 抗体进行检测。较佳地，所述的检测采用常规间接ELISA酶标法、金标法、比浊法、生物芯片 法、膜点杂交法等等血清学或体液学的诊断方法。优选地，可采用间接ELISA酶标法或金标 法。例如，可将RA相关抗体-载体蛋白固定于硝酸纤维膜上的检测区（固相抗体），待检样 品溶液中的RA相关抗体（游离抗体）与固相抗体竞争结合胶体金标记的本发明多肽或其 偶联蛋白（标记抗原）。待检样品中含有的RA相关抗体，将抑制标记抗体与固定抗原的结 合，抑制在硝酸纤维素膜的检测区形成色带。测定后检测区如果形成色带，则结果为阴性， 待测样品不含RA相关抗体；反之，不形成色带，则结果为阳性，检测样品含有RA相关抗体。
[0084] 本发明的检测板可采用本领域常用的检测板材料，采用常规的检测板制备方法制 成。本发明检测的检测板包括测试条和支撑测试条的支撑板，如可采用聚乙烯E