一类双烷氧酰胺烷基阳离子肽脂质及其合成方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，特别是涉及一类非病毒基因载体及制备方法。 技术背景
[0002] 随着人们在细胞水平上对疾病发病机制认识的不断深入，基因治疗已日渐成为科 学家们研宄的热点。基因治疗是通过向靶细胞或组织引入外源基因 DNA或RNA片段，来纠 正或补偿基因的缺陷，关闭或抑制异常基因的表达，从而达到治疗疾病的目的。基因治疗作 为一种新的治疗手段，可以治疗多种疾病，包括癌症、遗传性疾病、感染性疾病、心血管疾病 和自身免疫性疾病，其中癌症基因治疗是其主要应用领域。用于基因转运的载体主要有病 毒载体和非病毒载体。病毒载体如重组腺病毒载体，这类载体由于转染效率较高且对大多 数细胞都具有靶向作用，因此在基因转运方面具有一定的优越性。但它会引起体内的一些 免疫反应，而且含有可转录的病毒基因，可能在体内发生基因的重组或互补，进一步对人体 造成伤害。非病毒载体与之相比虽然转染效率有限，但是具有无传染性、不限制载体容量、 化学结构可控以及可大量制备等优点而越来越受到研宄者的青睐。
[0003] 阳离子脂质体具有类细胞结构和生物膜的特性，在体内可降解，可以保护其运载 基因片段的生物活性，是一种有临床应用潜力的非病毒基因转染载体。脂质体的这种结 构可以压缩基因形成复合物，递送至病变组织或细胞。自从1987年Feigner等首次利用 N-[l-(2, 3-二油酰氧基）丙基]-N，N，N-三甲基氯化铵（DOTMA)对COS-7等细胞进行成功 转染后，脂质体已经发展成为除反转录病毒载体外应用最广泛的基因传递方法，特别在肿 瘤及囊性纤维化等疾病的治疗中应用较多。但由于其仍存在一定的局限性，如细胞毒性大， 对器官的靶向性不明显，基因转运机制不明确等限制了其广泛应用。因此，人们一直致力于 对阳离子脂质体的各种构建及化学修饰，试图寻求一种高效低毒的基因治疗药物。
[0004] 脂质体发展的近30年来，从广泛使用的季铵盐头部、胍基头部到多胺头部阳离子 脂质，已经形成了比较完善的脂质体载体系统，但这些载体系统仍然存在许多问题，如介导 基因的转运效率还有待提高；对靶组织无定向识别性；阳离子脂质体/DNA复合物进入细胞 后，核酸被束缚于内涵体中，释放困难，不利于在细胞质或细胞核中表达，从而无法达到治 疗目的。中国专利CN103613516A，2014-03-05公开了一类双子型阳离子类脂的制备及其在 药物或基因转运中的应用，该载体由于具有双头部结构生物降解性较差而存在一定的细胞 毒性，因此在体内基因转染方面受到了限制。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一类细胞毒性小，在体外和体内基因转染效率高的双烷氧 酰胺烷基阳离子肽脂质及其合成方法和应用。
[0006] 本发明的技术方案为：
[0007] -、一类双烷氧酰胺烷基阳离子肽脂质及制备方法
[0008] 1、一类双烷氧酰胺烷基阳离子肽脂质，其化学结构由通式I表示：
[0009]
[0010] 其中：
[0011] X选自1~6，最优选2~4 ;
[0012] y选自1~8，最优选2~4 ;
[0013] R选自C8_2(l烷基，该烷基包括直链烷基和支链烷基；
[0014] AA选自精氨酸（Arg)、组氨酸（His)、天冬氨酸（Asp)、丙氨酸（Ala)、甘氨酸 (Gly)、鸟氨酸（Orn)或赖氨酸（Lys);
[0015] B选自鸟氨酸（Orn)或赖氨酸（Lys)。
[0016] 2、一类双烷氧酰胺烷基阳离子肽脂质的合成方法，是以氨基保护的氨基酸制备肽 头部中间体；以酰化试剂和醇类化合物进行酰化，酰化产物再与多胺类化合物反应，制备双 长碳链中间体；将制备的肽头部中间体与制备的双长碳链中间体经过酰胺化进行连接；将 保护基团脱掉，再与氨基保护的氨基酸进行反应，脱保护后得到所述双烷氧酰胺烷基阳离 子肽脂质化合物。
[0017] 具体步骤如下：
[0018] (1)以酰化试剂对醇类化合物进行酰化，所述酰化试剂为羰基二咪唑；所述醇类 化合物为十二醇、十四醇、十六醇或十八醇；所述酰化试剂与醇类物质的摩尔比为1:10~ 10:1，反应溶剂为甲苯、二氯甲烷、DMF或氯仿，反应温度为10~60°C，反应时间为0. 5~ 12h ；
[0019] (2)酰化产物再与多胺类化合物反应，制备双长碳链中间体。所述多胺类化合物 为二乙烯三胺、二丙烯三胺或二丁烯三胺等多胺，多胺与酰化产物摩尔比为1:2~1:8 ;催 化剂为三乙胺、碳酸钠或甲基吡啶等，催化剂的加入量为多胺投料质量的10%，反应温度为 10~100°C，反应时间为2~48h，经重结晶得到带有双长碳链的中间体N，N-双烷氧酰胺烷 基胺，所述重结晶溶剂为乙酸乙酯或无水乙醇/水混合溶剂（v/v = 5:1);
[0020] (3)采用保护试剂保护氨基酸的氨基，所述氨基酸为Lys、His、Arg、Asp、Ala、Gly 或Orn ;所述保护试剂为二碳酸二叔丁醋（Boc2O)、荷甲氧羰酰琥泊酰亚胺（Fmoc-OSu)或氯 甲酸苄酯（CbzCl);所述保护试剂与氨基酸摩尔比为1:8~8:1;反应溶剂为水、乙腈或丙 酮，反应温度为〇~25°C，反应时间为0. 5~2h，经重结晶得到肽头部中间体，所述重结晶 溶剂为乙酸乙酯/石油醚混合溶剂（v/v = 3 :1);
[0021] (4)将步骤⑶制备的肽头部中间体，与步骤⑵制备的双长碳链中间体经过酰 胺化进行连接：a首先将肽头部中间体进行活化生成活泼酯，活化试剂为2-(7-偶氮苯并三 氮唑）-N，N，Ν'，Ν' -四甲基脲六氟磷酸酯（HATU)、Ν，Ν' -二环己基碳酰亚胺（DCC)或HOBt， 氨基酸与活化试剂摩尔比为1:1~1:8,反应溶剂为二氯甲烷、DMF或三氯甲烷，活化时间 为0. 5~2h，活化温度为0~30°C。b在步骤a反应液中加入双长碳链中间体的二氯甲烧、 DMF或三氯甲烷溶液，经过酰胺化使中间体的氨基与肽头部中间体的羧基生成酰胺键，两者 摩尔比为1:8~8:1，催化剂为4-二甲氨基吡啶（DMP)，1-羟基苯并三唑（HOBt)，催化剂 加入量与双长碳链中间体摩尔比为1:1~1:8,反应时间为2h~120h，反应温度为20~ 60 0C ；
[0022] (5)脱掉氨基保护试剂。所述脱保护试剂为三氟乙酸或质量分数10% NaHCO3，脱 保护试剂与类脂化合物摩尔比为1:1~1: 2。脱保护时间为0. 5~12h，脱保护温度为0~ 4°C。经重结晶法进行提纯，重结晶溶剂乙腈、无水乙醇、超纯水、乙酸乙酯或石油醚；
[0023] (6)重结晶后，产物溶解在氯仿中，使用硅胶柱纯化该粗产物，用甲醇/氯仿（3:1 体积比）混合试剂进行洗脱。在70°C下，用旋转蒸发法去除溶剂，冻干，即得到含有一个氨 基酸头部的双烷氧酰胺烷基阳离子肽脂质化合物。
[0024] (7)以含有一个氨基酸头部的双烷氧酰胺烷基阳离子肽脂质化合物为原料，合成 其他双烷氧酰胺烷基类阳离子肽脂质：将步骤（3)制备的肽头部中间体与步骤（6)制备的 含有一个氨基酸头部的阳离子肽脂质，经过氨基酸活化和酰胺化，得到头部为1~4个氨基 酸的阳离子脂质化合物。两者摩尔比为1:8~8:1，具体反应条件与提纯方法与步骤（4) (5) (6)相同。
[0025] 二、阳离子肽脂质体及制备方法
[0026] 1、一种由所述双烷氧酰胺烷基阳离子肽脂质制备的阳离子肽脂质体，该阳离子肽 脂质体为双烷氧酰胺烷基阳离子肽脂质分散在水相中形成的粒径大小为IOOnm左右的均 一稳定的表面带有正电荷的脂质体。
[0027] 2、双烷氧酰胺烷基阳离子肽脂质体的制备方法，步骤如下：按摩尔比1:1~8:1将 所述双烷氧酰胺烷基肽脂质化合物和助剂在氯仿、甲苯、甲醇等有机溶剂中混合，使双烷氧 酰胺烷基肽脂质化合物的浓度为〇. 5~3mg/ml。在氮气下将溶液吹干，形成均匀薄膜，真空 干燥2~24h (真空度为0. 09MPa，常温）。加入超纯水、乙醇、磷酸缓冲液或三种物质的混 合液，在10~80°C水化1~10h，超声频率为IOOHz下超声震荡至澄清透明，所述阳离子肽 脂质体浓度为0.5~3mg/mL。所述助剂为二油酰磷脂酰乙醇胺（DOPE)、二油酰磷脂酰胆碱 (DOPC)、胆固醇或蔗糖酯。
[0028] 三、双烷氧酰胺烷基阳离子肽脂质体/基因复合物及制备方法
[0029] 1、双烷氧酰胺烷基阳离子肽脂质体/基因复合物是由所述双烷氧酰胺烷基阳离 子肽脂质体与质粒DNA (pDNA)或小干扰RNA(SiRNA)，通过静电相互作用形成分散在水相中 均一稳定的纳米颗粒。
[0030] 2、双烷氧酰胺烷基阳离子肽脂质体/基因复合物的制备方法，步骤如下：
[0031] (1)取所述双烷氧酰胺烷基阳离子肽脂质体分散在细胞培养液（DMEM或 RPMI1640)中，混匀，使浓度为 0· 02 μ g/ μ L-0. 16 μ g/ μ L ;
[0032] (2)将(λ 5~L 0 μ g pDNA或siRNA稀释在细胞培养液DMEM或RPMI1640中，混 匀，使质粒浓度为〇.〇2^8/^1^;
[0033] (3)按照脂质体与基因质量比1:1~8:1比例，将⑴和⑵两稀释液混勾，室温 放置I0~40min，即可得到双烷氧酰胺烷基阳离子肽脂质体/基因复合物。
[0034] 四、所述双烷氧酰胺烷基阳离子肽脂质体/基因复合物在细胞转染中的应用和体 内转染中的应用，主要包括：
[0035] 1、所述肽脂质体基因载体可进入癌细胞中，完成目的基因在细胞内的转染。
[0036] 2、所述细胞为人喉癌上皮细胞Ofep-2)和非小肺腺癌细胞（A549)。不同氮磷比下 结合获得的所述肽脂质基因载体系统，在不同细胞内的转染效率会有所差异。
[0037] 3、本发明提供的肽脂质体/基因复合物适用于编码荧光素酶、绿色荧光蛋白报告 基因，也适用于其他各种实验所需的siRNA。该载体能高效运载pDNA和siRNA转染细胞，并 对细胞几乎不产生毒性。
[0038] 4、氨基酸或肽分子具有带正电荷的氨基，可与带负电的基因物质结合，增加了基 因载体压缩基因的能力，提高基因转染效率。
[0039] 本发明的作用机理大致如下：本发明提供的一类双烷氧酰胺烷基阳离子肽脂质体 /基因复合物，由于其阳离子肽脂质具有氨基酸或氨基酸组成的肽头部、氨基甲酸酯键和烷 基疏水尾部，因此同时具有疏水和亲水特性，其疏水部分来源于双长碳链，亲水部分取自于 具有良好生物相容性的氨基酸或肽构成的脂质头部，由于氨基酸或肽具有多氨基结构，可 与带负电的遗传物质（核酸、基因和遗传物质要统一）结合，对细胞及核酸具有良好的亲和 性，提高压缩基因的能力，从而可提高载体的转染效率。另外，氨基酸和肽为生物体必需的 物质，可降低阳离子脂质极性头部带来的毒性。
[0040] 本发明与现有技术相比具有如下优点：
[0041] 1