、本发明的双烷氧酰胺烷基类阳离子肽脂质合成方法简单，采用的反应试剂及得 到的产物无毒无污染，且原料成本低，具有较好的推广性；反应过程中，条件温和，副产物少 且易提纯；可广泛应用于科学研宄及生产。
[0042] 2、本发明提供的一类双烷氧酰胺烷基阳离子肽脂质体，富含阳离子，具有压缩 pDNA和siRNA的能力，可以形成纳米级的阳离子脂质体/基因复合物。所述阳离子肽脂质 体/基因复合物为酸敏感型，可有利于基因的细胞内释放，提高转染效率。复合物的阳离子 头部为肽，大部分氨基酸为人体必需氨基酸，生物相容性好，比传统季铵盐型阳离子脂质的 毒性要低。
[0043] 3、本发明所述的一类双烷氧酰胺烷基阳离子肽脂质体稳定性好，粒径为IOOnm左 右，Zeta电位在40~70mV之间，可压缩更多带负电的基因物质，提高体外体内转染效率、 细胞相容性好、毒性小，可作为新型高效低毒的非病毒基因载体和转染试剂。
[0044] 4、本发明提供的一类双烷氧酰胺烷基阳离子肽脂质体/基因复合物，在运载 siRNA用于基因沉默时也有良好的效果，其沉默效率高达70%。
[0045] 5、本发明提供的肽脂质体/基因复合物用于体内试验时，不会影响小鼠的正常生 长，对小鼠的肝脏和肾脏无毒性。
[0046] 6、本发明提供的双烷氧酰胺烷基阳离子肽脂质体与中国专利CN103613516A中双 子型阳离子脂质体载体G14相比，具有对肿瘤细胞的高效转染和更低的细胞毒性。
[0047] 7、本发明提供的双烷氧酰胺烷基阳离子肽脂质体/基因复合物使用方便，将有望 成为用于临床基因治疗的新型基因载体和转染试剂。
【附图说明】
[0048] 图1为阳离子肽脂质体R12KA、R14ODD、R 16KHHH和R18ORRR的粒径检测图。
[0049] 图2为阳离子肽脂质体R12KA、R14ODD、R 16KHHH和R18ORRR的Zeta电位检测图。
[0050] 图3为阳离子阳离子肽脂质体R12KA、R14ODD、R 16KHHH和R18ORRR与质粒DNA的电泳 延滞实验结果图。
[0051] 图4是采用倒置荧光显微镜检测阳离子肽脂质体运载pGFP-N2质粒转染NCI-H460 细胞（人大细胞肺癌细胞，图4A)和Hep-2细胞（人喉癌细胞，图4B)的绿色荧光蛋白表达 图。
[0052] 图5是采用酶标仪检测的阳离子肽脂质体运载pGL-3质粒转染NCI-H460细胞的 荧光素酶表达图。
[0053] 图6是采用酶标仪检测的阳离子肽脂质体运载pGL-3质粒转染H印-2细胞的荧光 素酶表达图。
[0054] 图7是酶标仪检测阳离子肽脂质体运载SiRNA转染A549细胞，Luciferase基因 沉默情况图。
[0055] 图8是采用MTT比色法检测本发明的阳离子肽脂质体/基因复合物细胞转染过程 中对NCI-H460细胞毒性的检测。
[0056] 图9是采用MTT比色法检测本发明的阳离子肽脂质体/基因复合物细胞转染过程 中对H印-2细胞毒性的测定图。
[0057] 图10是阳离子肽脂质体/基因复合物细胞摄入情况图。
[0058] 图11是阳离子肽脂质体R14ODD运载SiRNA体内沉默Luciferase基因情况图。
[0059] 图12是阳离子肽脂质体/基因复合物体内转染小鼠的体重变化曲线图。
【具体实施方式】
[0060] 为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明实施方案进行阐述，但是这些 阐述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制。
[0061] 本说明书中，脂质化合物N，N-双十二烷氧酰胺乙基赖氨酸丙氨酸酰胺用R12KA表 示，脂质化合物N，N-双十四烷氧酰胺乙基鸟氨酸二聚天冬氨酸酰胺用R14ODD表示，肽脂 质化合物N，N-双十六烷氧酰胺乙基赖氨酸三聚组氨酸酰胺用R16KHHH表示，脂质化合物 N，N-双十八烷氧酰胺乙基鸟氨酸三聚精氨酸酰胺用R18ORRR表示。
[0062] 实施例1阳离子肽脂质化合物R12KA合成方法如下：
[0063] (1)将20mmoL羰基二咪唑和200mmoL十二醇（摩尔比1 :10)用200mL二氯甲烷 溶解，在60°C反应2h，生成单取代中间体。将二乙烯三胺的二氯甲烷溶液滴加到上述反应 液中（二乙烯三胺与酰化产物摩尔比为1 :2)，加入等摩尔量的催化剂三乙胺，在KKTC下继 续反应2h，生成双取代中间体。反应完毕，过滤，旋转蒸发得到白色透明的粘稠状液体。用 乙酸乙酯进行重结晶提纯3次，得白色粉末状双取代长碳链中间体R12。
[0064] (2)称取2mmol L-Lys溶于15mL乙腈中，6mmol Boc2O溶于乙腈并滴加到赖氨酸 乙腈溶液中，25 °C搅拌反应2h，再加入6mmol Fmoc-OSu的乙腈溶液，继续反应6h，反应结束 后，旋转蒸发掉溶剂，用乙酸乙酯/石油醚混合溶剂（v/v = 3 :1)重结晶，得到肽头部中间 体 Fmoc-L-Lys(Boc)-OH。
[0065] (3) Immol肽头部中间体Fmoc-L-Lys (Boc) -OH与活化试剂HATU以摩尔比1:2溶解 于二氯甲烷溶液，(TC下活化2h，再加入长碳链中间体R12的二氯甲烷溶液（赖氨酸与长碳 链中间体两者摩尔比为1:8)，加入Immol催化剂DMAP，在20°C下酰胺化反应120h，反应后 在70°C旋转蒸发干溶剂，用二氯甲烷/三氟乙酸=2/1溶剂溶解，置于4°C下8h，脱去保护 基团Boc，用10% NaHCCV^剂溶解，反应Ih，脱去Fmoc基团。
[0066] (4)将产物用乙酸乙酯重结晶2次，乙腈重结晶2次。产物溶解在氯仿中，使用硅 胶柱纯化该粗产物，用甲醇/氯仿（3:1体积比）混合试剂进行洗脱。在70°C下，用旋转蒸 发法去除溶剂，冻干，即得到含有一个赖氨酸头部的双烷氧酰胺烷基阳离子肽脂质。
[0067] (5)将5mmol丙氨酸溶于四氢呋喃中，IOmmol的Boc2O溶于四氢呋喃中滴加到丙 氨酸中，加入5mmol DMAP，反应温度为0°C，反应2h。反应完毕，在70°C下旋转蒸发掉溶剂， 用乙腈重结晶2次，得到肽头部中间体L-Ala (Boc)-OH。
[0068] (6)以步骤（4)制备的含有一个赖氨酸头部的双烷氧酰胺烷基阳离子肽脂质化合 物为原料，与步骤（5)制备的已氨基保护的肽头部中间体L-Ala(Boc)-OH反应，两者摩尔 比为8 :1，经过氨基酸活化和酰胺化，得到含有一个Lys -个Ala的二肽头部阳离子肽脂质 R12KA,具体反应条件与提纯方法与步骤（3) (4)相同。
[0069] 其结构表征如下：? NMR(400MHz, CD3OD) δ :〇· 95(6H, CH3), I. 32(28H, ((CH2)7), 1 ? 49 (4H, CH2CH2O), 3· 32 (6H, CONHCH2, CH2NH), 3· 89 (4H, NH)，4· 08 (4H, CH2CH2O), 4· 95 (6H, NH2)。13C NMR (400MHz, CD3OD) δ 17. 25 (CH3) ,25. 44 (CH3CH2) ,33. 01 ((CH2)8) ,35. 12 (CHCH2) ,35. 92 ( CH3CH2CH2), 42. 10 (NHCH2), 57. 03 (NHCH, NH2CH), 68. 92 (CH2NH2), 162. 13 (COONH), 172. 78 (NC0 CH), 177. 35 (NHCOCH) 〇 IR ν/cm-1:3323. 29 ( ν ΝΗ), 2924. 56 ( ν CH), 1691. 23 ( ν c = 0), 1545.37 (δ 丽），1270. 30-1195. 36 ( ν ⑶c, ν CN) 0
[0070] 实施例2阳离子肽脂质化合物R14ODD合成方法如下：
[0071] (1)将40mmoL羰基二咪挫和240mmoL十四醇（摩尔比1:6)用200mL二氯甲烧溶 解，在60°C反应2h，生成单取代中间体。将二乙烯三胺的二氯甲烷溶液滴加到上述反应液 中（二乙烯三胺与酰化产物摩尔比为1:1)，加入等摩尔量的催化剂三乙胺，在40°C下继续 反应l〇h，生成双取代中间体。反应完毕，过滤，旋转蒸发得到白色透明的粘稠状液体。用乙 酸乙酯、乙醇混合溶剂（5:1体积比）进行重结晶提纯3次，得白色粉末状双取代长碳链中 间体R14。
[0072] (2)称取50mmol L-Orn溶于150mL水中，IOOmmol Boc2O溶于水并滴加到鸟氨 酸水溶液中，30 °C搅拌反应2h，再加入IOOmmol Fmoc-OSu的乙腈溶液，继续反应10h，反 应结束后，旋转蒸发掉溶剂，用乙酸乙酯/石油醚（2 :1)体系重结晶，得到肽头部中间体 L-Fmoc-Orn(Boc)-OH0
[0073] (3) 20mmol已保护的鸟氨酸肽头部中间体L-Fmoc-Orn(Boc)-OH与活化试剂HATU 以摩尔比1:4溶解于二氯甲烷溶液，(TC下活化2h，再加入长碳链中间体R14的二氯甲烷溶液 (鸟氨酸与长碳链中间体两者摩尔比为1:7)，加入I. 5_〇1催化剂DMAP，在40°C下酰胺化 反应2h，反应后旋转蒸发干溶剂，将产物用二氯甲烷/三氟乙酸=3/1体积比溶剂溶解，置 于4°C下8h，脱去保护基团Boc。用二氧六环^^!10)3溶剂溶解，反应12h，脱去Fmoc基团.
[0074] (4)用石油醚重结晶2次，乙醇和水5 :1混合溶剂重结晶2次，产物溶解在氯仿中， 使用硅胶柱纯化该粗产物，用甲醇/氯仿（3:1体积比）混合试剂进行洗脱。在70°C下，用 旋转蒸发法去除溶剂，冻干，即得到含有一个鸟氨酸头部的阳离子肽脂质化合物。
[0075] (5)将20mmol天冬氨酸与保护试剂Boc2O按照8:1摩尔比溶于水中，加入20mmol HOBt，在60°C，反应lh。反应完毕，在70°C下旋转蒸发掉溶剂，用石油醚进行重结晶3次，制 备肽头部中间体L-Asp (Boc) -OH。
[0076] (6)以步骤（4)制备的含有一个鸟氨酸头部的双烷氧酰胺烷基阳离子肽脂质化合 物为原料，与步骤（5)制备的已氨基保护的肽头部中间体L-Asp(B0C)-OH反应，两者摩尔 比为1 :4,经过氨基酸活化和酰胺化，得到含有一个Orn两个Asp的三肽头部阳离子肽脂质 R12ODD,具体反应条件与提纯方法与步骤（3) (4)相同。
[0077] 其结构表征如下：? NMR(400MHz, CD3OD) δ :〇· 902 (s, 6H, CH3) ; L 293 (t, 36H, J =6. 8, CH3CH2) ； I. 612 (s, 4H, CH2CH2O) ；4. 013 (s, 4H, CH2CH2O) ；3. 256 (s, 6H, NHCH2)； 2. 980 (s, 8H, CH2N) ；3. 544 (t,