5mL三氯甲烷中，待充分溶解后，在氮气下吹成均匀薄膜，真空干燥8h使溶剂全部挥发（真 空度为-〇. 〇9MPa，常温），加入5mL磷酸盐缓冲液，在30°C水化8h，超声频率为IOOHz下超 声震荡至澄清透明，制得浓度为5mg/mL阳离子肽脂质体。
[0101] 实施例8用R18ORRR制备阳离子肽脂质体
[0102] 准确称量摩尔比为3:1的阳离子肽脂质R18ORRR与助剂蔗糖酯S070(阳离子肽脂 质体为2mg)，溶于ImL甲醇和三氯甲烷混合溶剂中（甲醇：三氯甲烷=1:2体积比），待充 分溶解后，在氮气下吹成均匀薄膜，真空干燥4h使溶剂全部挥发（真空度为-0. 09MPa，常 温），加入200 μ L55°C左右的无水乙醇使膜脱落，加入800 μ L缓冲夜，在40°C左右反复超声 震荡（超声频率为100Hz)至澄清透明，制得浓度为2mg/mL的阳离子肽脂质体。
[0103] 实施例9脂质体的粒径及Zeta电位检测
[0104] 采用激光散射粒度仪（H0RIBA纳米粒度仪SZ-100)在25°C，光散射角度90°条件 下测定制备的阳离子肽脂质体的粒径及其Zeta电位，用移液枪取20 μ L实施例1~实施例 8制备的阳离子肽脂质体稀释于ImL超纯水中分别进行粒径和Zeta电位检测，结果见图1 和图2。图1为4种阳离子肽脂质体的平均粒径，图2为4种阳离子肽脂质体的Zeta电位。
[0105] 结果显示，4种阳离子肽脂质形成的脂质体粒径都在IOOnm左右，在转染的有效粒 径（< 1 μπι)范围之内。Zeta电位绝对值均大于30mV，具有较好的静电稳定性。
[0106] 实施例1OR12KA脂质体/DNA复合物的制备
[0107] 如实施例5中所述方法制备得到阳离子肽脂质体。取lmg/mL脂质体R12KAO. 5 μ g 用无血清DMEM培养基稀释到25 μ L ;取0. 5mg/mL质粒DNA0. 5 μ g，用无血清DMEM培养基稀 释到25 μ L ;两稀释液混合（脂质体与DNA质量比为1:1)，轻微漩涡震荡，室温孵育10min， 得到R12KA脂质体/DNA复合物。
[0108] 实施例1lR14ODD脂质体/DNA复合物的制备
[0109] 如实施例6中所述方法制备得到阳离子肽脂质体。取0. 5mg/mL脂质体R14ODDl μ g， 用无血清DMEM培养基稀释到25 μ L ;取0. 5mg/mL质粒DNAO. 5 μ g，用无血清DMEM培养基稀 释到25 μ L ;两稀释液混合（脂质体与DNA质量比为2:1)，轻微漩涡震荡，室温孵育20min， 得到R14ODD脂质体/DNA复合物。
[0110] 实施例12R16KHHH脂质体/DNA复合物的制备
[0111] 如实施例7中所述方法制备得到阳离子肽脂质体。取1.5mg/mL脂质体 R16KHHH3. 0 μ g，用无血清DMEM培养基稀释到25 μ L ;取0. 5mg/mL质粒DNA0. 5 μ g，用无血清 DMEM培养基稀释到25 μ L ;两稀释液混合（脂质体与DNA质量比为6:1)，轻微漩涡震荡，室 温孵育30min，得到R16KHHH脂质体/DNA复合物。
[0112] 实施例13R180RRR脂质体/DNA复合物的制备
[0113] 如实施例8中所述方法制备得到阳离子肽脂质体。取3. Omg/mL脂质体 R180RRR4. 0 μ g，用无血清DMEM培养基稀释到25 μ L ;取0· 5 μ g/ μ L质粒DNA0. 5 μ g，用无血 清DMEM培养基稀释到25 μ L ;两稀释液混合（脂质体与DNA质量比为8:1)，轻微漩涡震荡， 室温孵育40min，得到R18ORRR脂质体/DNA复合物。
[0114] 实施例14阳离子肽脂质体/siRNA复合物的制备
[0115] 如实施例5~实施例8中所述方法制备得到阳离子肽脂质体，取脂质体Img/ mLR140DD0· 9 μ g，用无血清DMEM培养基稀释到25 μ L ;取0· 3 μ g/ μ L siRNAO. 3 μ g，用无血 清DMEM培养基稀释到25 μ L ;两稀释液混合（脂质体与siRNA质量比为3:1)，轻微漩涡震 荡，室温孵育20min，得到R14ODD脂质体/siRNA复合物。
[0116] 实施例15脂质体结合质粒DNA电泳延滞实验
[0117] 采用琼脂糖凝胶电泳延滞实验，检测阳离子肽脂质体与质粒DNA在不同质量比时 其相应的电荷比情况，进一步得出压缩的有效比例。将阳离子肽脂质体与质粒DNA按质量 比依次为 〇:1、〇. 5:1、1:1、2:1、3:1、4:1、6 :1、8:1 分别稀释于 15yL RPMI1640 培养液中轻 微漩涡震荡混匀，室温孵育20min，取2 μ L的6 X DNA Loading buffer依次加入上述15 μ L 阳离子肽脂质体与质粒DNA复合物中混匀，并依次上样于1. 2%的琼脂糖凝胶上样孔中，电 压设为90V，电泳40min。制胶时已加入核酸染液NA-Red，电泳结束后直接在凝胶成像系统 Gene Genius Bio-imaging System(SYNGENE公司）中观察DNA延滞情况。电泳结果如附 图3所示，其中泳道1~8为阳离子肽脂质体与DNA按质量比分别为0:1、0. 5:1、1:1、2:1、 3:1、4:1、6:1和8:1的脂质体/DNA复合物。A为阳离子肽脂质体R12KA结合DNA电泳图，B 为阳离子肽脂质体R14KDD结合DNA电泳图，C为阳离子肽脂质体R16KHHH结合DNA电泳图， D为阳离子肽脂质体R18ORRR结合DNA电泳图。
[0118] 图3的A结果显示，随着脂质体质量的增加，DNA延滞效果也逐渐明显，在质量比 为6:1时DNA已完全延滞。图3的B结果显示，随着脂质体质量的增加，DNA延滞效果也逐 渐明显，在质量比为8:1时DNA已完全延滞。图3的C结果显示，随着脂质体质量的增加， DNA延滞效果也逐渐明显，在质量比为6:1时DNA已完全延滞。图3的D结果显示，随着脂 质体质量的增加，DNA延滞效果也逐渐明显，在质量比为6:1时DNA已完全延滞。
[0119] 实施例16体外生物学评价实验
[0120] (1)运载PGFP-N2质粒转染细胞实验
[0121] 将H印-2及NCI-H460细胞种植于24孔细胞培养板中，每孔加细胞浓度约为 I. 0 X IO5个/孔，孵育24h后，使在转染日细胞密度达80~90 %。将脂质体与PGFP-N2质 粒分别按照1:1，2:1，3:1，4:1，6:1和8:1比例复合，复合后总体积为100 μ L。将复合物加 到细胞培养板中，培养4-5h，更换含血清10%和抗生素的培养基，培育48h。绿色荧光蛋白 基因表达的产物GFP能激射峰值508nm的绿色荧光，采用倒置荧光显微镜进行基因表达分 析。阳性细胞发出明亮的绿色荧光，而阴性细胞则无，GFP阳性细胞越多，信号越强，表明转 染率越高。观察倍数20X10。
[0122] 结果如附图4和图5所示，脂质体与DNA质量比为6:1，图4是阳离子肽脂质体转 染NCI-H460细胞的转染结果；图5是阳离子肽脂质体转染Hep-2细胞的转染结果，结果表 明：脂质体能高效转染NCI-H460和H印-2细胞，与双子型脂质体基因载体G14相比，转染效 率提高了 50%。
[0123] (2)运载pGL-3质粒转染细胞实验
[0124] 细胞培养方法与上述步骤（1)相同。脂质体与pGL3质粒分别按照1/1，2/1，3/1， 4/1，6/1和8/1比例复合，复合后总体积为100 μ L。将复合物加到细胞培养板中，摇动培 养板，轻轻混匀。在37°C，5%的CO2(培养箱）中培养4-5h，更换含血清10%和抗生素 的培养基，培育48h。转染后将细胞用DPBS洗1次，每孔加入600 μ L裂解液，20min后， 移至96孔白板中，每孔加80μL普洛麦格E151A检测液。利用Synergy2多功能酶标仪 (BioTek)检测相对酶活力。以热电公司的PierceBCAProteinAssay试剂盒为标准对照测定 总蛋白含量。蛋白质测定后，转染效率可表示为：RLU/mg蛋白。采用商品化基因转染试剂 Lipofectamine2000 及 DOTAP 做对照。
[0125] 实验结果如附图6所示，其中，G14为双子型脂质体基因载体；优选的脂质体与DNA 质量比为6:1。4个脂质体均能够运载pGL3质粒转染NCI-H460和H印-2细胞。在N/P为 3:1时，转染效率达到最佳。与双子型脂质体基因载体相比，转染效率提高约50%。
[0126] (3) RNA干扰实验
[0127] 细胞铺板没有计数，取基本长满的A549细胞，加到12孔板中，每孔加2mL，培养约 24h，细胞密度约为50-60%。每孔加入200 μ L脂质体/siRNA复合物，转染18h，换生长培 养基培养30h。将细胞用DPBS洗1次，每孔加入600 μ L裂解液，20min后，移至96孔白板 中，每孔加20 μ L，加80 μ L普洛麦格E151A检测液，用多功能酶标仪（BioTek)检测相对酶 活力。取裂解液5 μ L加到96孔透明板中，以热电公司的Pierce BCA Protein Assay试剂 盒为标准对照测定总蛋白含量。
[0128] 图7选择脂质体与siRNA最佳N/P比6:1，介导RNAi研宄考察4种阳离子脂质体运 载siRNA转染A549细胞沉默Iuciferase基因的能力。G14为双子型脂质体基因载体，siRNA 和Control为空白对照。结果显示转染后，Iuciferase基因的表达水平均受到不同程度的 抑制。其中，脂质体R16KHffiVsiRNA和R180RRR/siRNA与空白组相比，荧光素酶基因的沉默效 率可达75%，与双子型脂质体相比，沉默效率提高约20%。说明脂质体介导siRNA进入细胞 后可与细胞质中的蛋白质形成核酸蛋白复合物（RNA-induced silencing complex，RISC)， 在RISC的作用下，siRNA特异识别目的mRNA，在核酸内切酶作用下切割目的mRNA，mRNA片 段在核酸外切酶作用下降解后无法指导合成相应的蛋白质，从而实现了对Iuciferase基 因的沉默。
[0129] (4)细胞毒性研宄（MTT比色法）
[0130] 采用MTT法对转染效率较高的阳离子脂质体进行细胞毒性试验，以商品化基因转 染试剂Lipofectamine2000及DOTAP为对照。将H印-2及NCI-H460细胞种植于96孔细 胞培养板中，每孔加细胞培养液（含双抗和血清）100 μ L，浓度约为1. 0 X IO6个/孔，孵育 24h，使在转染日细胞密度达80~90 %。移去生长培养基，用100 μ L培养基清洗，再用等 量（IOOyL)培养基替换。将脂质体与质粒DNA分别按照1:1，2:1，3:1，4 :1，6:1和8:1比 例复合加到细胞培养板中。细胞培养24