h后，每孔中加入20 μ L MTT (Sigma，5mg/mL)，孵育 培养4-4. 5h。弃去培养液，加入150 μ L DMSO溶破细胞。
[0131] 基于MTT比色法的检测原理为：活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT 还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臜（Formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能，二甲 基亚砜（DMSO)能溶解细胞中的甲瓒，用酶标仪在570nm波长处测定其吸光值，可间接反映 活细胞数量。故此，以空白对照（未转染细胞）的吸光值为100%，计算转染后细胞存活的 百分率（％)。计算公式为：
[0132] 细胞存活率（％ ) = [A]样品/[A]对照X100%
[0133] [A]#s为测试孔的吸光值，[幻^为阴性空白对照孔的吸光值。
[0134] 实验结果如图8和图9,横坐标为所制备的阳离子肽脂质体，优选的脂质体与DNA 质量比为6:1。图8是采用MTT比色法检测本发明的阳离子肽脂质体/基因复合物细胞转 染过程中对NCI-H460细胞毒性的检测。图9是采用MTT比色法检测本发明的阳离子肽脂 质体/基因复合物细胞转染过程中对Hep-2细胞毒性的测定图。4个脂质体对NCI-H460细 胞和!fep-2细胞的毒性都不大，细胞存活率在80%~100%之间。与双子型脂质体基因载 体相比，细胞存活率提高20%。
[0135] (5)细胞摄入研宄
[0136] 将A549细胞种植于6孔细胞培养板中，每孔加细胞培养液（含双抗和血清）lmL， 浓度约为4. 0 X IO6个/孔，孵育24h，使在转染日细胞密度达70~80 %。
[0137] 将脂质体与siRNA以质量比为3:1复合，总体积200 μ L加到每孔中，培养30h。
[0138] 用DPBS洗一次，每孔加入0. 3mL胰酶消化细胞，l-2min后，加入0. 8mL培养基。离 心后，将细胞用〇. 4mL DPBS稀释，用流式细胞仪分析。
[0139] 图10为细胞摄入检测结果，肽脂质体与siRNA质量比为6:1，G14为双子型脂质体 基因载体，Oligo和Control为空白对照。4种脂质体均能进入细胞，其中，脂质体R16KHHH 和R18ORRR细胞摄入量均达到90 %以上，R14KDD细胞摄入量达到80 %，高于双子型脂质体基 因载体。
[0140] 实施例17体内生物学评价实验
[0141] (1)小鼠模型的建立
[0142] 取长满的A549细胞，用DPBS洗一次，加3mL Trypsin-EDTA放置3-4min，加5mL有 血清和双抗的PRMI1640,轻轻吹打，转移到15mL离心管中，在1200rpm下离心5min。移除 上清液，稀释于I. 5mL PBS中，植于裸鼠皮下，每只约lOOyL，肿瘤长到60-70mm3时，可以使 用。
[0143] (2)运载 siRNA 沉默 Luciferase 基因
[0144] 将脂质体/siRNA以质量比3:1复合，经尾静脉注射于荷瘤小鼠，24h后取肿瘤，放 于约500 μ L裂解液中，30min后，4°C下5000rmp离心10min。
[0145] 沉默效果分析方法与实施例18中步骤（3)相同。
[0146] 总蛋白含量分析方法与实施例18中步骤（2)相同。
[0147] 阳离子脂质体R18ORRR运载SiRNA，在小鼠肿瘤细胞内沉默Iuciferase基因的结 果如附图11所示，其中Control为空白对照，G14为双子型脂质体基因载体，肽脂质体与 siRNA质量比为6:1。注射脂质体R18ORRR后，小鼠细胞中Iuciferase基因蛋白表达显著降 低，与空白对照相比，大约降低2倍。且沉默效率优于双子型脂质体基因载体。说明阳离子 肽脂质R18ORRR可特异性地、高效地下调Iuciferase基因的过量表达。
[0148] (3)体内细胞毒性研宄
[0149] 将脂质体/siRNA以质量比3:1复合，经尾静脉注射于荷瘤小鼠，隔两天注射一次， 共注射5次。每天给药前测量小鼠体重，观察各组小鼠每天体重增长的变化。
[0150] 小鼠的体重变化如图12所示，在注射复合物前，小鼠的平均体重为25. 9g，注射复 合物后第6天小鼠体重呈明显上升趋势，第15天小鼠的平均体重达到27. 89g，体重增长 7. 6%，表明小鼠对一定剂量的脂质体R18ORRR的适应，脂质体不会影响小鼠的正常生长。
【主权项】
1. 一类双烷氧酰胺烷基阳离子肽脂质，其化学结构式为：其中： X选自1~6;y选自1~8;R选自C8_2(l烷基，该烷基包括直链烷基和支链烷基；AA选 自精氨酸（Arg)、组氨酸（His)、天冬氨酸（Asp)、丙氨酸（Ala)、甘氨酸（Gly)、鸟氨酸（Orn) 或赖氨酸（Lys) ;B选自Orn或Lys。2. 权利要求1所述双烷氧酰胺烷基类阳离子脂质的合成方法，其特征是：步骤如下： (1) 以酰化试剂和醇类化合物进行酰化，所述酰化试剂为羰基二咪唑；所述醇类化合 物为十二醇、十四醇、十六醇或十八醇；酰化试剂与醇类物质的摩尔比为1:10~10:1，反应 溶剂为甲苯、二氯甲烷、DMF或氯仿，反应温度为10~60°C，反应时间为0. 5~12h; (2) 酰化产物再与多胺类化合物反应，制备双长碳链中间体，所述多胺类化合物为二乙 烯三胺、二丙烯三胺或二丁烯三胺等多胺，多胺与酰化产物摩尔比为1:2~1:8 ;催化剂为 三乙胺、碳酸钠或甲基吡啶等，催化剂的加入量为多胺投料质量的10%，反应温度为10~ 100°C，反应时间为2~48h，经重结晶得到带有双长碳链的中间体N，N-双烷氧酰胺烷基胺， 所述重结晶溶剂为乙酸乙酯或无水乙醇/水混合溶剂（v/v= 5:1); (3) 采用保护试剂保护氨基酸的氨基，制备肽头部中间体：所述氨基酸为Lys、His、 Arg、Asp、Ala、Gly或Orn;所述保护试剂为二碳酸二叔丁醋（Boc20)、荷甲氧羰酰琥泊酰亚 胺（Fmoc-OSu)或氯甲酸苄酯（CbzCl);所述保护试剂与氨基酸摩尔比为1:8~8:1 ;反应溶 剂为30~300mL水、乙腈或丙酮，反应温度为0~25°C，反应时间为0. 5~2h，经重结晶得 到肽头部中间体，所述重结晶溶剂为乙酸乙酯/石油醚混合溶剂（v/V= 3 :1); (4) 将步骤（3)制备的肽头部中间体，与步骤⑵制备的双长碳链中间体经过酰胺化进 行连接： a首先将肽头部中间体进行活化生成活泼酯，活化试剂为2_(7_偶氮苯并三氮 唑）-N，N，N'，N' -四甲基脲六氟磷酸酯（HATU)、N，N' -二环己基碳酰亚胺（DCC)或HOBt，氨 基酸与活化试剂摩尔比为1:1~1:8,反应溶剂为二氯甲烷、DMF或三氯甲烷，活化时间为 0? 5~2h，活化温度为0~30°C; b在步骤a反应液中加入双长碳链中间体的二氯甲烷、DMF或三氯甲烷溶液，经过酰胺 化使中间体的氨基与肽头部中间体的羧基生成酰胺键，两者摩尔比为1:8~8:1，催化剂为 4_二甲氨基吡啶（DMAP)，1-羟基苯并三唑（HOBt)，催化剂加入量与双长碳链中间体摩尔比 为1:1~1:8,反应时间为2h~120h，反应温度为20~60°C; (5) 脱掉氨基保护试剂。所述脱保护试剂为三氟乙酸或10%NaHC03，脱保护试剂与类 脂化合物摩尔比为1:1~1: 2,脱保护时间为0. 5~12h，脱保护温度为0~4°C。经重结晶 法进行提纯，重结晶溶剂为乙腈、无水乙醇、超纯水、乙酸乙酯或石油醚； (6) 重结晶后，产物溶解在氯仿中，使用硅胶柱纯化该粗产物，用甲醇/氯仿（3:1体积 比）混合试剂进行洗脱。在70°C下，用旋转蒸发法去除溶剂，冻干，即得到含有一个氨基酸 头部的双烷氧酰胺烷基阳离子肽脂质化合物； (7)以含有一个氨基酸头部的双烷氧酰胺烷基阳离子肽脂质化合物为原料，合成其他 双烷氧酰胺烷基类阳离子肽脂质：将步骤（3)制备的肽头部中间体与步骤（6)制备的含有 一个氨基酸头部的阳离子肽脂质，进行氨基酸活化和酰胺化，得到头部为1~4个氨基酸的 阳离子脂质化合物。两者摩尔比为1:8~8:1，具体反应条件与提纯方法与步骤（4) (5) (6) 相同。3. -种由权利要求1所述双烷氧酰胺烷基类阳离子肽脂质制备的阳离子脂质体，其特 征是：该阳离子肽脂质体为双烷氧酰胺烷基类阳离子肽脂质分散在水相中形成的粒径大小 为lOOnm左右的均一稳定的表面带有正电荷的脂质体。4. 权利要求3所述的双烷氧酰胺烷基类阳离子肽脂质体的制备方法，其特征是：步骤 如下： (1) 将双烷氧酰胺烷基阳离子肽脂质和助剂按照摩尔比1:1~8:1比例溶解于氯仿或 甲醇中，使双烷氧酰胺烷基肽脂质化合物的浓度为〇. 5~3mg/mL，所述助剂为二油酰磷脂 酰乙醇胺（DOPE)、二油酰磷脂酰胆碱（D0PC)、胆固醇或蔗糖酯； (2) 溶液在氮气下吹成均匀薄膜，真空干燥4~12h; (3) 用乙醇、水、磷酸缓冲液或三种物质的混合液进行水化，水化温度为10~80°C;水 化时间为1~l〇h，超声震荡至澄清，得到双烷氧酰胺烷基阳离子肽脂质体，浓度为0. 5~ 3.Omg/mLo5. -种由权利要求3所述的双烷氧酰胺烷基阳离子肽脂质体制备的阳离子肽脂质 体/基因复合物，其特征是：由权利要求3所述双烷氧酰胺烷基阳离子肽脂质体与质粒 DNA(pDNA)或小干扰RNA(siRNA)，通过静电相互作用形成分散在水相中均一稳定的纳米颗 粒。6. 根据权利要求5所述双烷氧酰胺烷基阳离子肽脂质体/基因复合物的制备方法，步 骤如下： (1) 取如权利要求3所述双烷氧酰胺烷基阳离子肽脂质体分散在细胞培养液（DMEM或 RPMI1640)中，混匀，使浓度为 0? 02yg/yL-0. 16yg/yL; (2) 将0? 5~1. 0ygpDNA或siRNA稀释在细胞培养液DMEM或RPMI1640中，混匀，使 质粒浓度为〇? 02yg/yL; ⑶按照脂质体与基因质量比1:1~8:1比例，将⑴和⑵两稀释液混勾，室温放置 10~40min，即可得到双烷氧酰胺烷基阳离子肽脂质体/基因复合物。7. -种权利要求5所述的双烷氧酰胺烷基阳离子肽脂质体/基因复合物，其特征是： 该基因复合物在细胞转染中的应用及在体内转染中的应用。
【专利摘要】一类双烷氧酰胺烷基阳离子肽脂质，其化学结构式为：其分散在水中可以得到稳定性好、分散均匀，平均粒径在120nm左右，Zeta电位在30～50mV之间的阳离子肽脂质体。脂质体能有效压缩质粒DNA和siRNA，在体外体内都能高效转染，并对细胞和小鼠几乎不产生毒性。本发明所述的一类双烷氧酰胺烷基阳离子肽脂质作为基因载体可在基因转运中广泛应用。
【IPC分类】C07K5/11, C07K1/06, C12N15/87
【公开号】CN104987360
【申请号】CN201510305970
【发明人】张树彪, 赵轶男, 崔韶晖, 陈会英, 周泉
【申请人】大连民族学院
【公开日】2015年10月21日
【申请日】2015年6月4日