用于工程化的可植入组织和器官的平台及其制备方法

用于工程化的可植入组织和器官的平台及其制备方法
【专利摘要】本文公开了包含一个或多个肌肉层的工程化组织和器官，该工程化组织或器官基本上由细胞材料组成，条件是该工程化组织或器官可植入到脊椎动物受试者中，并且不是血管。
【专利说明】用于工程化的可植入组织和器官的平台及其制备方法
相关申请的交叉引用
[0001]本申请要求提交于2011年9月12日的美国申请序列号61/533，761和提交于2011年9月12日的美国申请序列号61/533，766的权益，二者均通过引用整体并入本文。
发明背景
[0002]医疗行业面临着许多紧迫的问题。截至2009年12月，有105，305名患者因需要器官移植而在器官分享联合网络(United Network for Organ Sharing,UNOS)上登记。2009年I月至9月之间，只进行了 21，423例移植。与进行的移植相比，每年有更多的患者加入UNOS名单，导致等待移植的患者人数净增长。例如，在2008年初，有75，834人因需要肾脏而登记；在当年年底，这个数字已经增长到80，972。当年进行了 16，546例肾脏移植，但该名单中增加了 33，005名新的患者。UNOS登记需要肾脏的患者在2008年的移植率为20%。等待名单中的患者的死亡率为7%。

【发明内容】

[0003]对能促进再生医学和组织工程学技术应用于缓解对可植入组织和器官的迫切需求的材料、工具和技术存在需求。此外，对适用于创伤修复、组织增大、器官修复和器官置换的可植入组织和器官存在需求。因此，本发明人在此描述了可植入的组织、器官及其制备方法。
[0004]一方面，本 文公开了包含一个或多个层的、活的三维工程化组织或器官，该一个或多个层的特征在于以下的一项或多项:a)使用时基本无支架(scaffold-free);和b)生物打印的，该一个或多个层适合于在充分成熟后植入脊椎动物受试者中；条件是该工程化组织或器官的至少一个层包含肌细胞，并且该工程化组织或器官不是血管。在一些实施方案中，至少一个层包含多种细胞类型，该细胞类型相对于彼此空间排列从而构建平面几何形状。在进一步的实施方案中，至少一个层在制作时在其最小维度上为至少IOOym厚。在一些实施方案中，该组织或器官包含多个层，至少一个层在组成上或结构上与至少一个其它层不同，以构建层状的几何形状。在进一步的实施方案中，至少一个层在制作时在其最小维度上为至少IOOym厚。在一些实施方案中，该组织或器官是囊、片或管，其中所述管不是血管。在一些实施方案中，该组织或器官在使用时基本不含任何预形成的支架。在一些实施方案中，该组织或器官是生物打印的。在一些实施方案中，该一个或多个层生成细胞外基质。在一些实施方案中，该肌细胞是平滑肌细胞。在一些实施方案中，该肌细胞是骨骼肌细胞。在一些实施方案中，该肌细胞是心肌细胞。在一些实施方案中，该肌细胞来源于能够分化成肌细胞的干细胞或祖细胞。在进一步的实施方案中，该干细胞或祖细胞在制作之前、期间或之后分化成肌细胞。在一些实施方案中，该组织或器官进一步包含选自以下的细胞:内皮细胞、神经细胞、周细胞、成纤维细胞、组织特异性上皮细胞、软骨细胞、骨骼肌细胞、心肌细胞、骨来源的细胞、软组织来源的细胞、间皮细胞、组织特异性基质细胞、干细胞、祖细胞、内胚层来源的细胞、外胚层来源的细胞、中胚层来源的细胞及其组合。在一些实施方案中，除肌细胞以外的细胞被分配到该一个或多个层的至少一个表面上。在进一步的实施方案中，除肌细胞以外的细胞被生物打印到该一个或多个层的至少一个表面上。在一些实施方案中，除肌细胞以外的细胞基本在一个或多个层制作的同时、在一个或多个层制作之后、在一个或多个层成熟期间或在一个或多个层成熟之后被分配到该一个或多个层上。在一些实施方案中，除肌细胞以外的细胞被分配到该一个或多个层上成为约I至约20个细胞厚的细胞层。在一些实施方案中，该一个或多个层基本是平面的。在进一步的实施方案中，该组织或器官是适用于创伤修复、组织置换或组织增大的含肌细胞的片或补片(patch)。在一些实施方案中，该一个或多个层基本上是管状的。在进一步的实施方案中，该组织或器官是输尿管、泌尿导管、肝门十二指肠(portoduodenal)肠导管、输卵管、子宫、气管、支气管、淋巴管、尿道、肠、结肠、食道或其一部分。在一些实施方案中，该一个或多个层基本是囊。在进一步的实施方案中，该组织或器官是胃、膀胱、子宫或胆囊或其一部分。在一些实施方案中，该组织或器官选自:尿道、泌尿导管、肝门十二指肠肠导管、输尿管、膀胱、输卵管、子宫、气管、支气管、淋巴管、食道、胃、胆囊、肠和结肠。
[0005]另一方面，本文描述了该组织和/或器官的植入。
[0006]另一方面，本文描述了在培养物中维持该组织和/或器官用于离体研究用途。
[0007]另一方面，本文描述了用于制备包含含肌细胞层的可植入组织或器官的方法，该方法包括:将含肌细胞的生物墨水生物打印成形式；并且将该生物墨水融合成凝聚的细胞结构；条件是该组织或器官可植入脊椎动物受试者，并且不是血管。在一些实施方案中，可植入组织或器官在使用时基本不含任何预形成的支架。在一些实施方案中，该肌细胞是平滑肌细胞。在一些实施方案中，该肌细胞是骨骼肌细胞。在一些实施方案中，该肌细胞是心肌细胞。在一些实施方案中，该肌细胞分化自祖细胞。在一些实施方案中，该肌细胞由组织样品产生。在进一步的实施方案中，该组织样品是脂肪抽吸物。在一些实施方案中，该形式是囊或片。在一些实施方案中，该形式是在生物打印时内径为约0.15_或更大的管，其中该管不打算用作血管旁路移植物或动脉-静脉分流物(shunt)。在一些实施方案中，该生物墨水进一步包含选自以下的细胞:内皮细胞、神经细胞、周细胞、成纤维细胞、组织特异性上皮细胞、软骨细胞、骨骼肌细胞、心肌细胞、骨来源的细胞、软组织来源的细胞、间皮细胞、组织特异性基质细胞、干细胞、祖细胞、内胚层来源的细胞、外胚层来源的细胞、中胚层来源的细胞及其组合。在一些实施方案中，该方法进一步包括将除肌细胞以外的细胞生物打印、喷涂、涂抹、涂敷、浸涂、移植、接种、注射或分层到生物打印的形式之中或之上的步骤。在一些实施方案中，该方法进一步包括将除肌细胞以外的细胞生物打印、喷涂、涂抹、涂敷、浸涂、移植、注射、接种或分层到凝聚的细胞结构之中或之上。
[0008] 另一方面，本文描述了包含一个或多个层的、活的三维工程化组织或器官，该一个或多个层的特征在于以下的一项或多项:a)使用时基本无支架，和b)生物打印的，该一个或多个层成熟到针对脊椎动物受试者的植入就绪状态；该工程化组织或器官基本上由细胞材料组成；条件是该工程化组织或器官的至少一个层包含肌细胞，并且该工程化组织或器官不是血管。在一些实施方案中，至少一个层包含多种细胞类型，该细胞类型相对于彼此空间排列从而构建平面几何形状。在进一步的实施方案中，至少一个层在制作时在其最小维度上为至少IOOym厚。在一些实施方案中，该组织或器官包含多个层，至少一个层在组成上或结构上与至少一个其它层不同，以构建层状的几何形状。在进一步的实施方案中，至少一个层在制作时在其最小维度上为至少100μπι厚。在一些实施方案中，该组织或器官是囊、片或管，其中所述管不是血管。在一些实施方案中，该肌细胞是平滑肌细胞。在一些实施方案中，该肌细胞是骨骼肌细胞。在一些实施方案中，该肌细胞是心肌细胞。在一些实施方案中，该组织或器官进一步包含选自以下的细胞:内皮细胞、神经细胞、周细胞、成纤维细胞、组织特异性上皮细胞、软骨细胞、骨骼肌细胞、心肌细胞、骨来源的细胞、软组织来源的细胞、间皮细胞、组织特异性基质细胞、干细胞、祖细胞、内胚层来源的细胞、外胚层来源的细胞、中胚层来源的细胞及其组合。在一些实施方案中，细胞被分配到至少一个层的至少一个表面上。在进一步的实施方案中，细胞被生物打印到至少一个层的至少一个表面上。
[0009]另一方面，本文描述了该组织和/或器官的植入。
[0010]另一方面，本文描述了在培养物中维持该组织和/或器官用于离体研究用途。
【专利附图】

【附图说明】
[0011]在所附权利要求书中详细阐明了本发明的新颖特征。通过参考以下阐明了说明性实施方案的发明详述(其中利用了本发明的原理)和附图，将获得对本发明特征和优点的更好理解，附图中:
[0012]图1描绘了生物打印的平滑肌补片(例如，片)的非限制性实例，其由含有平滑肌细胞(SMC)并且还含有内皮细胞(EC)的生物墨水构建。在此实例中，该生物墨水在生物打印之前被配制成圆柱形形式。示出了各种组织学染色，以指示细胞类型的分布和位置。
[0013]图2描绘了生物打印的平面平滑肌补片(例如，片)的非限制性实例，其由仅含SMC的生物墨水构建。在此实例中，该SMC生物墨水不含任何支架或外源性加入的生物材料，并且采用圆柱形生物打印形式在NovoGen MMX生物打印机上生物打印。在此实例中，在制作后立即将第二细胞类型(内皮细胞)生物打印到生物打印的SMC补片的单个表面上形成薄层。示出了各种组织学染色，以指示细胞类型的分布和位置。
[0014]图3a描绘了从由人动脉来源的SMC组成的生物墨水生物打印的平面平滑肌补片(例如，片)的非限制性实例。在此实例中，SMC被打印到人皮肤成纤维细胞(HDF)层之上，以模拟与含成纤维细胞的外膜相邻的平滑肌细胞层的天然生物学。在此实例中，第三细胞类型(人动脉来源的内皮细胞)被生物打印到该生物打印的平滑肌补片之上形成薄层。对HASMC进行a SMA染色。
[0015]图3b是描绘了平滑肌补片(由SMC生物墨水构成)的一个非限制性实例的宏观图像，其紧随在NovoGen MMX生物打印机上进行生物打印之后示出。在此实例中，利用非粘附性水凝胶限制材料(NovoGel?)作为在其上打印构建体的基底支持物，以及环绕该生物打印的平滑肌补片的限制窗。
[0016]图4a是描绘了生物打印的平面平滑肌补片(例如，片)的一个非限制性实例的宏观图像，该补片由含有人动脉来源的SMC组合人动脉来源的内皮细胞(以85:15的比例混合)的圆柱形生物墨水构建。
[0017]图4b描绘了生物打印的平面平滑肌补片(例如，片)的非限制性实例，该补片由含有比例为85:15的SMC: EC的圆柱形生物墨水构建。通过对内皮细胞的特异性标志物⑶31进行免疫染色来鉴定EC (内皮细胞)。
[0018]图5是生物打印的平滑肌片的一个非限制性实例，其已经被生物打印在非粘附性水凝胶支持结构内，其中置于生物打印的平滑肌补片之上的限制材料被配置成网格结构，以允许直接接触生物打印的片的至少一些部分以及营养培养基；还示出了制作它们的示例性步骤。
[0019]图6是含有生物打印的平滑肌的管的一个非限制性实例。在此实例中，生物墨水包含SMC与两种其它细胞类型(成纤维细胞和内皮细胞)的组合，比例为75:25:5、
47.5:47.5:5 和 85:10:5 (从左到右)。
[0020]图7是描绘了工程化肝组织的一个非限制性实例的宏观图像，在此实例中，肝组织是通过使用连续沉积机构采用由在挤出化合物(例如，PF-127)中包封的细胞构成的生物墨水而生物打印的。(A)示出了单个功能单元的示意图；(B)每一层具有平面的棋盘格状几何形状的多层片；(C)和(D)示出了培养基施加和挤出化合物溶出之后的构建体。
[0021]图8是H&E染色的图7的多层构建体的显微照片，描绘了棋盘格状几何形状的示例性“轮辐(spoke) ”。
[0022]图9是图示了双细胞系统中可能的混合物的线图。
[0023]图10是管状构建体的横截面的示意图。示例性命名约定由圆柱形生物墨水单元的数目和紧随其后的轴向NovoGel?圆柱体的数目组成:(A) 6/1，(B) 12/4，(C) 10/4，和(D)12/7 ο
[0024]图11描绘了 用多型生物墨水组合物生物打印的6/1管状构建体，包括(A)宏观总体形态学，(B)示出了不透明性和光滑表面的总体形态学的放大图，和横截面组织学的显微照片(下面一排)。
[0025]图12图示了通过连续缝合(A)或多个间断缝合(B)像外科手术一样附接在一起的生物打印的组织片。
[0026]图13描绘了为了长期保持和成熟而制作到多孔插入物上的生物打印的骨骼肌组织㈧。培养3天和9天后，生物打印的骨骼肌组织的H&E染色(B，C)。
发明详述
[0027]本发明涉及再生医学和组织/器官工程领域。更具体地，本发明涉及包含至少一个含肌细胞层的组织和器官，其中该工程化组织或器官基本上由细胞材料组成，并且涉及其制备方法。本文所公开的组织、器官和方法的优势包括，例如，柔性三维组织几何形状，这允许制作任选分层的含肌细胞的片、管和囊。另一个优势在于灵活的分层法，这允许将除肌细胞以外的一种或多种细胞类型布置、分配和/或生物打印到该层的至少一个表面上。这些优势导致能模拟天然组织组成和结构的工程化组织和器官。
[0028]在某些实施方案中，本文公开了包含一个或多个层的、活的三维工程化组织或器官，该一个或多个层的特征在于以下的一项或多项:a)使用时基本无支架；和《生物打印的，该一个或多个层适合于在充分成熟后植入脊椎动物受试者中；条件是该工程化组织或器官的至少一个层包含肌细胞，并且该工程化组织或器官不是血管。
[0029]在某些实施方案中，本文还公开了该组织和/或器官的植入。
[0030]在某些实施方案中，本文还公开了用于制备包含含肌细胞层的可植入组织或器官的方法，该方法包括:将含肌细胞的生物墨水生物打印成形式；以及将该生物墨水融合成凝聚的细胞结构；条件是该组织或器官可植入脊椎动物受试者，并且不是血管。
[0031]在某些实施方案中，本文还公开了包含一个或多个层的、活的三维工程化组织或器官，该一个或多个层的特征在于以下的一项或多项:a)使用时基本无支架；和《生物打印的，该一个或多个层成熟到针对脊椎动物受试者的植入就绪状态；该工程化组织或器官基本上由细胞材料组成；条件是该工程化组织或器官的至少一个层包含肌细胞，并且该工程化组织或器官不是血管。
[0032]在某些实施方案中，本文还公开了该组织和/或器官的植入。
某些定义
[0033]除非另有定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。
[0034]如在本说明书和所附权利要求书中使用的，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数的指示物，除非上下文另有明确规定。因此，例如，提及“一种核酸”包括一种或多种核酸，和/或本领域技术人员在阅读本公开内容等之后将会明白的、本文所述的类型的组合物。本文中任何提及的“或”意在包括“和/或”，除非另有说明。
[0035]如本文中使用的，“生物墨水”意指包含多个细胞的液体、半固体或固体组合物。在一些实施方案中，生物墨水包含细胞溶液、细胞聚集体、包含细胞的凝胶、多细胞体或组织。在一些实施方案中，生物墨水另外还包含支承材料。在一些实施方案中，生物墨水另外还包含提供使生物打印能够进行的特定生物力学特性的非细胞材料。
[0036]如本文中使用的，“生物打印”是指:经由与自动的或半自动的、计算机辅助的三维原型装置(例如生物打印机)相匹配的方法，利用细胞(例如细胞溶液、含细胞的凝胶、细胞悬浮液、细胞浓缩物、多细胞聚集体、多细胞体等)的三维精确沉积。
[0037]如本文中使用的，“血管”意指平滑肌细胞管，其进一步包含血管内皮细胞并具有大于100μπι的内径，且旨在于体内作为间置血管移植物、旁路血管移植物或动静脉血管分流物使用。如本文使用的“血管”明确不包括其它器官或组织的组成血管元件(动脉、静脉、小动脉、小静脉、毛细血管和微脉管系统)。例如，与膀胱、肠或食道有关的血管网络将不包括在如本文所提出的“血管”的定义中。
[0038]如本文中使用的，“凝聚(cohere) ”、“凝聚的(cohered) ”和“凝聚(cohesion) ”指将细胞、细胞聚集体、多细胞聚集体、多细胞体和/或它们的层结合起来的细胞-细胞粘附性质。该术语可以与“融合(fuse) ”、“融合的(fused)”和“融合(fusion) ”互换使用。
[0039]如本文中使用的，“细胞外基质”意指由细胞产生并被转运出细胞进入细胞外隙的蛋白质，在其中它们作为支持物将组织保持在一起，以提供拉伸强度和/或促进细胞信号传导。
[0040]如本文中使用的，“可植入”意指生物相容的以及能够暂时或基本永久地插入或移植到或附着到活生物体中。
[0041]如本文中使用的，“层状”是指多层的、生物打印的组织，其中两个或多个平面层组合起来以增加该组织在z平面的总厚度。在一些实施方案中，每个平面层在结构和/或组成上基本类似。在其它实施方案中，每个平面层在结构和/或组成上是基本上独特的。
[0042]如本文中使用的，“多层的”是指由两个或多个组织层组成，其中每个组织层是一个或多个细胞层的厚度。在一些实施方案中，组织层一次沉积一个。在其它实施方案中，同时沉积多个层。任选地，每个层是由多种细胞类型组成的。进一步地，在每个层中的多种细胞类型任选地在χ-y平面(即:水平平面)上以空间限定的结构相对于彼此排列。此外，在某些情况下，在Z-平面(即:垂直平面)上的层增加导致细胞在层内相对于彼此的受控空间定位，使得空间限定的结构在Z-平面上继续。
[0043]如本文中使用的，“器官”意指加入结构单元中发挥共同功能的组织集合。器官的实例包括但不限于皮肤、尿道、导管、输尿管、膀胱、输卵管、子宫、气管、支气管、淋巴管、食道、胃、胆囊、小肠、大肠和结肠。
[0044]如本文中使用的，“平面的”是指生物打印的多细胞组织的层，其中在该组织层的x-y平面内，多个生物墨水组合物和/或空隙空间相对于彼此空间布置成设定的图案。“平面的”当用于描述组织“片”或“补片”的形状时还意指基本是平的。
[0045]如本文中使用的，“支架”是指:合成的支架，例如聚合物支架和多孔水凝胶；非合成的支架，例如预形成的细胞外基质层、死细胞层和脱细胞的组织，以及任何其它类型的预形成支架，它对于工程化组织和/或器官的物理结构而言是必要的，并且不能在不损坏/破坏所述组织和/或器官的情况下从该组织和/或器官除去。在进一步的实施方案中，脱细胞的组织支架包括脱细胞的天然组织或以任意方式由培养的细胞产生的脱细胞的细胞材料；例如，使之死亡或者脱细胞的细胞层，留下它们在活着时产生的ECM。本文使用的术语“无支架(scaffold-free)”表示含细胞的管、囊或片在使用时基本不含支架(如以上所定义的)。“无支架(scaffold-free) ”可以与“无支架(scaffoldless) ”或“无预形成的支架”互换使用。
[0046]如本文中使用的，“干细胞”意指表现出潜能和自我更新的细胞。干细胞包括但不限于全能细胞、多能细胞、多潜能细胞、寡能细胞、单能细胞和祖细胞。在各个实施方案中，干细胞是胚胎干细胞、围产期干细胞、成体干细胞、羊膜干细胞和诱导性多能干细胞。
[0047]如本文中使用的，“受试者”意指任何个体。该术语与“患者”、“受体”和“供体”是可以互换的。这些术语都不应被解释为需要医疗专业人员(例如，医师、护士、执业护士、医生助理、护理员、临终关怀工作者、社会工作者和临床研究助理)或科研人员的(持续的或以其它方式的)监督。
[0048]如本文中使用的，“组织”是指细胞的聚集体。组织的实例包括但不限于:结缔组织(例如，网形结缔组织、致密结缔组织、弹性组织、网状结缔组织和脂肪组织)、肌肉组织(例如，骨骼肌、平滑肌和心肌)、泌尿生殖组织、胃肠组织、肺组织、骨组织、神经组织和上皮组织(例如，单层上皮和复层上皮)、内胚层来源的组织、中胚层来源的组织和外胚层来源的组织。
组织工程
[0049]组织工程是跨学科的领域，其应用并结合了工程学和生命科学的原理，指向生物替代品的发展，该生物替代品通过器官或组织的增大(augmentation)、修复或更换来恢复、保持或改善组织功能。经典组织工程学的基本方法是将活细胞接种到生物相容且最终可生物降解的环境中(例如支架)，随后在生物反应器中培养该构建体，以便初始细胞群进一步扩充和成熟，以在植入后生成目标组织。采用模拟该生物细胞外基质(ECM)的适当支架，发育中的组织在体外和体内成熟之后采取了所需器官的形态和功能。然而，由于控制细胞在整个支架上的分布和空间布置的能力有限，达到足够高的细胞密度并具有类似于天然组织的结构是具有挑战性的。这些限制经常导致组织或器官具有较差的机械性能和/或不足的功能。在支架的生物降解性、残留聚合物的夹杂和制造工艺的工业规模化方面，存在额外的挑战。已经尝试了无支架的方法。目前的无支架方法受到一些限制:?复杂的几何形状，例如多层结构，其中各层包含不同细胞类型，通常需要将细胞类型在特定结构中进行明确的、高分辨率的放置，以可再现地获得类似于天然组织的结果。
?规模和/或几何形状受到扩散和/或营养供给需要功能血管网络的限制。
?在许多情况下，组织的存活力受到限制材料的损害，该限制材料限制了扩散并限制细胞获得营养物。
[0050]在一些实施方案中，本文中公开了工程化的组织和器官，以及制作方法。本文中公开的组织工程方法具有以下优点:
?它们能够产生包含细胞的组织和/或器官。
?通过重新产生类似于天然组织的细胞间相互作用，它们模拟在天然组织的发育、稳态和/或发病中发现的环境条件。
?它们任选地获得多样的复杂拓扑结构(例如多层结构、节段、片、管、囊等)。
?它们与自动制造手段相匹配，并且是可规模化的。
[0051]生物打印使得产生包含细胞的可植入组织的改进方法成为可能，该可植入组织在组织修复、组织增大、组织置换和器官置换中是有用的(参见下文)。
牛物打印
[0052]在一些实施方案，工程化的可植入组织和/或器官的至少一个部件是生物打印的。在进一步的实施方案中，工程化的可植入组织和/或器官完全是生物打印的。在又进一步的实施方案中，生物打印的构建体是采用使用了快速原型技术的方法得到的，该快速原型技术是基于通过三维递送装置(例如生物打印机)将细胞和限制材料向(例如由水凝胶和/或多孔膜组成的)生物相容性表面上进行三维、自动化、计算机辅助的沉积，该细胞包括细胞溶液、细胞悬浮液、包含细胞的凝胶或浆料、细胞浓缩物、多细胞体(例如圆柱体、球形体、带形体等)。如本文中使用的，在一些实施方案中，在用于指代组织和/或器官时，术语“工程化的”是指:根据计算机脚本，通过计算机辅助的装置(例如生物打印机)，将细胞、细胞溶液、细胞悬浮液、包含细胞的凝胶或浆料、细胞浓缩物、多细胞聚集体和它们的层放置以形成三维结构。在进一步的实施方案中，计算机脚本例如是一个或多个计算机程序、计算机应用或计算机模块。在更进一步的实施方案，通过细胞或多细胞体的打印后融合来形成三维组织结构，这类似于早期形态发生中的自组装现象。
[0053]尽管有许多方法可以用来将细胞、多细胞聚集体和/或它们的层布置在生物相容性表面上以产生三维结构，包括手动放置，但通过自动化的、计算机辅助的机器(例如生物打印机)来放置是有利的。采用这种技术递送细胞或多细胞体的优点包括:快速、精确和可再现地放置细胞或多细胞体以产生构建体，该构建体表现出具有各种组成的细胞、多细胞聚集体和/或它们的层的计划的或预先确定的取向或图案。优点还包括确定的高细胞密度，同时使细胞破坏减至最小。
[0054]在 一些实施方案中，生物打印方法是连续的和/或基本连续的。连续生物打印方法的非限制性实例是:经由连接到生物墨水储存器的分配末端(例如，注射器、毛细管等)从生物打印机分配生物墨水。在进一步的非限制性实施方案中，连续生物打印方法是按功能单元的重复图案(pattern)分配生物墨水。在各个实施方案中，重复功能单元具有任何适宜的几何形状，包括例如:圆形、正方形、矩形、三角形、多边形和不规则的几何形状。在进一步的实施方案中，生物打印的功能单元的一个重复图案包括一个层，相邻地生物打印(例如堆叠)多个层以形成工程化组织或器官。在各个实施方案中，相邻地生物打印(例如堆叠)了 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个或更多个层，以形成工程化组织或器官。
[0055]在一些实施方案中，生物打印的功能单元以棋盘格状图案重复。“棋盘格状图案”是没有向该平面填充重叠和空隙的图形平面。图7A显示任选地重复以产生图7B所示的棋盘格状图案的功能单元的实例。作为非限制性的实例，连续和/或棋盘格状生物打印的优点包括提高的生物打印组织的生产率。另一个非限制性的示例性优点是不需要将生物打印机与先前沉积的生物墨水元件对齐。连续生物打印还有利于从大型生物墨水储存器打印较大的组织，任选地使用注射器机构。
[0056]在各个实施方案中，连续生物打印中的方法包括:独立地或相对于彼此优化和/或平衡诸如打印高度、泵速、机扑速度或其组合的参数。在一个实例中，用于沉积的生物打印机头速度为3mm/s,第一层的分配高度为0.5mm,而后面每个层的分配高度增加0.4mm0在一些实施方案中，该分配高度与生物打印机分配末端的直径基本相等。不受限制地，适宜的和/或最佳的分配距离不会导致材料变平或附着到分配针上。在各个实施方案中，生物打印机分配末端具有约 20、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、100(^111或更大的内径，包括其中的增量。在各个实施方案中，生物打印机的生物墨水储存器具有约 0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70 、75、80、85、90、95、100立方厘米或更大的容积，包括其中的增量。在一些实施方案中，当系统中的残余压力积累较低时，该泵速是适宜的或最佳的。在一些实施方案中，有利的泵速取决于储存器的横截面积与分配针之间的比例，该比例越大，则需要越低的泵速。在一些实施方案中，适宜的和/或最佳的打印速度使得能够沉积均匀的线，而不影响材料的机械完整性。
[0057]本文中公开的发明包括商业方法。在一些实施方案中，本文中公开的技术和方法的速度和可放大性用来设计、构建和操作用于生产供植入使用的工程化组织和/或器官的工业和/或商业设施。在进一步的实施方案中，工程化的组织和/或器官例如作为用于体内用途(例如组织损伤、组织疾病和/或器官衰竭的医学治疗)的材料、工具和试剂盒进行生产、储存、分发、上市、宣传并销售。在其它实施方案中，工程化的组织和/或器官例如作为用于体外用途(例如，科学和/或医学研究)的材料、工具和试剂盒进行生产、储存、分发、上市、宣传并销售。在进一步的实施方案中，工程化的组织和/或器官被保持在细胞培养环境中并在科学和/或医学研究中使用。
工程化的组织和器官
[0058]在某些实施方案中，本文公开了包含一个或多个层的、工程化的可植入组织和/或器官，其中至少一个层包含肌细胞。在一些实施方案中，该一个或多个层的特征在于其在使用时、在生物打印(本文描述的技术)时或在使用和生物打印时基本无支架。在进一步的实施方案中，该一个或多个层和/或该工程化组织或器官基本上由细胞材料组成。在一些实施方案中，该一个或多个层适合于在充分成熟后植入脊椎动物受试者中。在一些实施方案中，该一个或多个层成熟到针对脊椎动物受试者的植入就绪状态。
[0059]在一些实施方案中，该工程化的组织和器官基本上由细胞材料组成。在各个进一步的实施方案中，该工程化组织和器官的包含细胞的部分在构建时由30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99、99.5,99.9 和 100% (包括其中的增量)的细胞材料组成。在其它各个实施方案中，该工程化组织和器官的包含细胞的部分在使用时由30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99、99.5、99.9 和 100% (包括其中
的增量)的细胞材料组成。在一些实施方案中，该工程化组织是凝聚和/或粘附的细胞聚集体。在一些实施方案中，使用前去除非细胞组分。在进一步的实施方案中，通过物理、化学或酶的手段去除非细胞组分。在一些实施方案中，一部分非细胞组分在使用时仍与细胞组分相关联。在一些实施方案中，非细胞组分选自:水凝胶、表面活性剂多元醇、热响应性聚合物、透明质酸盐、藻酸盐、胶原蛋白或其它生物相容性天然或合成聚合物。
[0060]该工程化组织任选地模拟任何人或哺乳动物组织。示例性组织包括上皮组织、结缔组织、肌肉组织、神经组织等。在一些实施方案中，该工程化器官是加入结构单元中以发挥共同功能的组织的集合。该器官适当地模拟任何天然的人或哺乳动物器官。作为非限制性的实例，示例性器官包括气管、支气管、食道、胃、肠、结肠、胆囊、子宫、输卵管、输尿管、膀胱、尿道、淋巴管等，包括它们的部分。
[0061]在一些实施方案中，该工程化的组织和器官是可植入的。在进一步的实施方案中，可植入的组织和器官是生物相容的，这意味着它们对所接触的生物体造成的伤害或毒性风险有限。在一些实施方案中，植入包括将组织或器官插入或移植到受试者中。在进一步的实施方案中，插入和/或移植通过手术进行。在其它实施方案中，植入包括将组织或器官附着到受试者中。适当地植入本文所公开的组织和器官持续不同时间。在一些实施方案中，适当地植入该组织和/或器官，作为非限制性的实例，暂时、半永久和永久地植入。在一些实施方案中，植入的组织和/或器官随时间推移被吸收、并入或溶解。在其它实施方案中，植入的组织和/或器官保留独特的形式持续一段时间。
[0062]该工程化的组织和器官适合于植入任何有需要的脊椎动物受试者。在各个实施方案中，作为非限制性的实例，脊椎动物受试者包括人类受试者、脊椎动物兽医学受试者和那些被归类为哺乳纲(哺乳动物)、鸟纲(鸟类)、爬行纲(爬行动物)、两栖纲(两栖动物)、硬骨鱼纲(硬骨鱼类)、软骨鱼纲(软骨鱼类)、无颚类脊椎动物(无颚鱼类)等的受试者。
[0063]在各个实施方案中，工程化的组织和器官适合于植入任何需要例如创伤修复、组织修复、组织增大、组织置换和/或器官置换的脊椎动物受试者中。在一些实施方案中，该工程化组织用于创伤修复或组织修复。例如，工程化的片用于暂时或永久地修复因受伤而受损的人皮肤。在一些实施方案中，该工程化组织用于组织增大。例如，工程化的片用于暂时或永久地修补或修复人膀胱或胃的肌肉壁中的缺陷。在一些实施方案中，该工程化组织用于组织置换。例如，工程化的片或管用于暂时或永久地修复或置换一段人小肠的壁。在一些实施方案中，该工程化器官用于器官置换。例如，工程化的管用于暂时或永久地置换因异位妊娠而受损的人输卵管。在一些实施方案中，工程化的管状结构用于创建与器官系统的新的连接；例如，含平滑肌的管可用于从胃肠系统或肾脏穿过体壁延伸连接，以使得能够在某些疾病状态下收集废物。在其它实施方案中，工程化的管状结构用于延伸某些天然组织(例如，食道、肠、结肠等)的长度，以消除或减轻本质上是先天性的特定疾病(例如，短肠综合征等)或由于其它疾病或损伤而发生的特定疾病。
[0064]在各个实施方案中，该工程化的可植入组织和器官是任何合适的形状。在一些实施方案中，选择形状以模拟特定的天然组织或器官。
[0065]在一些实施方案中，含肌细胞层或整个工程化组织或器官基本为片的形式或包含片的形式。在进一步的实施方案中，片是基本平面的形式，其具有一系列合适的几何形状，作为非限制性的实例，包括平面正方形、矩形、多边形、圆形、椭圆形或不规则形。生物打印的片具有广泛的合适的尺寸。在一些实施方案中，选择尺寸以有助于特定用途，作为非限制性的实例，包括创伤修复、组织修复、组织增大、组织置换和工程化器官构建。在进一步的实施方案中，选择尺寸以有助于在特定受试者中的特定用途。例如，在一个实施方案中，生物打印出片以修复特定人类受试者的含肌肉的组织中的特定缺陷。
[0066]在各个实施方案中，该工程化的可植入组织和器官是任何合适的大小。在一些实施方案中，工程化的组织和器官(包括生物打印的那些)的大小随时间推移而变化。在进一步的实施方案中，生物打印的组织或器官在生物打印之后由于例如细胞迁移、细胞死亡、细胞粘附介导的压缩或其它形式的收缩而收缩或压缩。在其它实施方案中，生物打印的组织或器官在生物打印之后由于例如细胞迁移、细胞生长和增殖、细胞成熟或其它形式的扩张而生长或扩张。
[0067]在一些实施方案中，生物打印的片在生物打印时为至少150μπι厚。在各个实施方案中，生物打印的片为约 10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500μπι 厚或更厚，包括其中的增量。在进一步的各个实施方案中，生物打印的片的特征在于其长度、宽度或二者为约 50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950UOOOym或更多，包括其中的增量。在其它各个实施方案中，生物打印的片的特征在于其长度、宽度或二者为约 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100mm或更多，包括其中的增量。在其它各个实施方案中，生物打印的片的特征在于其长度、宽度或二者为约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、IOOcm 或更多，包括其中的增量。参见例如，实施例6 (和图1)、实施例7 (和图2)、实施例9 (和图3a和3b)、实施例10(和图4a和4b) ο
[0068] 在一些实施方案中，含肌细胞层或整个工程化组织或器官基本为管的形式或包含管的形式。在进一步的实施方案中，管基本是轧制板或中空圆柱体。在一些实施方案中，生物打印的管用于构建工程化的器官。在进一步的实施方案中，生物打印的管用于构建工程化的输尿管、泌尿导管、输卵管、子宫、气管、支气管、淋巴管、尿道、肠、结肠、食道或其一部分。在进一步的实施方案中，本文所公开的管不是血管(blood vessel)或血管(vasculartube)。生物打印的管具有广泛合适的尺寸。在一些实施方案中，选择尺寸以有助于特定用途，作为非限制性的实例，包括创伤修复、组织修复、组织增大、组织置换、工程化器官的构建和器官置换。在进一步的实施方案中，选择尺寸以有助于在特定受试者中的特定用途。例如，在一个实施方案中，生物打印出管以修复特定人类受试者的淋巴管的特定段。在一些实施方案中，生物打印的管的特征在于其在生物打印时具有至少150 μ m厚的管壁。在各个实施方案中，生物打印的管的壁为约 10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500μπι厚或更厚，包括其中的增量。在一些实施方案中，该生物打印的管的特征在于在生物打印时具有至少约250 μ m的内径。在各个实施方案中，生物打印的管的内径为约50、60、70、80、90、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、600、700、800、900、1000 μ m或更多，包括其中的增量。在其它各个实施方案中，生物打印的管的内径为约 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、
27、28、29、30mm或更多，包括其中的增量。在一些实施方案中，生物打印的管的长度为约1、
2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30mm或更多，包括其中的增量。在其它实施方案中，生物打印的管的长度为约1、2、3、4、5、
6、7、8、9、10、ll、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30cm 或更多，包括其中的增量。参加例如实施例13(和图6)。
[0069]在一些实施方案中，含肌细胞层或整个工程化组织或器官基本为囊的形式或包含囊的形式。在进一步的实施方案中，囊基本是具有至少一个封闭端的轧制板或中空圆柱体(例如，袋子、杯子、中空体、气囊等)。在一些实施方案中，囊是旨在用于容纳摄入材料、胚胎及相关流体、体液或身体废物的可扩张结构，并且具有至少一个用于输入的开口以及至少一个用于输出的开口。在一些实施方案中，生物打印的囊用于增大现有的器官或组织。在其它实施方案中，生物打印的囊用于置换现有的器官或组织。在进一步的实施方案中，生物打印的囊用于构建工程化的胃、膀胱、子宫、胆囊或其一部分。生物打印的囊具有广泛合适的尺寸。在一些实施方案中，选择尺寸以有助于特定用途，作为非限制性的实例，包括创伤修复、组织修复、组织增大、组织置换、工程化器官的构建和器官置换。在进一步的实施方案中，选择尺寸以有 助于在特定受试者中的特定用途。例如，在一个实施方案中，生物打印出囊以增大或置换特定人类受试者的膀胱。在一些实施方案中，生物打印的囊的特征在于在生物打印时具有至少150 μ m厚的壁。在各个实施方案中，生物打印的囊的壁是约10、15、
20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、50(^111厚或更厚，包括其中的增量。
[0070]在一些实施方案中，可植入组织或器官用于科学和/或医学研究。合适的科学和/或医学研究包括体内和体外研究。在进一步的实施方案中，本文所述的工程化组织和/或器官用于体外研究用途，作为非限制性的实例，包括疾病建模、药物发现和药物筛选。
MM
[0071]在一些实施方案中，本文公开了包含一种或多种细胞类型的工程化的可植入组织和器官。在一些实施方案中，该工程化的组织和器官包括至少一个含肌细胞层。因此，在一些实施方案中，该细胞包括肌细胞(例如，平滑肌细胞、骨骼肌细胞、心肌细胞)。在进一步的实施方案中，该含肌细胞层还包括其它细胞类型，如本文所公开的那些细胞类型(例如，成纤维细胞、内皮细胞等)。在一些实施方案中，该工程化的组织和器官包括被分配到含肌细胞层的至少一个表面上的、除肌细胞以外的细胞。在进一步的实施方案中，作为非限制性的实例，被分配到含肌细胞层的至少一个表面上的细胞包括内皮细胞、神经细胞、周细胞、成纤维细胞、组织特异性上皮细胞、软骨细胞、骨骼肌细胞、心肌细胞、骨来源的细胞、软组织来源的细胞、间皮细胞、组织特异性基质细胞、干细胞、祖细胞及其组合。
[0072]在一些实施方案中，任何脊椎动物细胞适合于包括在该工程化的可植入组织和器官中。在进一步的实施方案中，作为非限制性的实例，该细胞是:收缩或肌肉细胞(例如，骨骼肌细胞、心肌细胞、平滑肌细胞和成肌细胞)、结缔组织细胞(例如，骨细胞、软骨细胞、成纤维细胞以及分化为成骨细胞、软骨细胞或淋巴组织的细胞)、骨髓细胞、内皮细胞、皮肤细胞、上皮细胞、乳腺细胞、血管细胞、血细胞、淋巴细胞、神经细胞、许旺细胞、胃肠细胞、肝细胞、胰细胞、肺细胞、气管细胞、角膜细胞、泌尿生殖细胞、肾细胞、生殖细胞、脂肪细胞、实质细胞、周细胞、间皮细胞、基质细胞、未分化的细胞(如胚细胞、干细胞和祖细胞)、内胚层来源的细胞、中胚层来源的细胞、外胚层来源的细胞和它们的组合。
[0073]在一个实施方案中，该细胞是平滑肌细胞。在另一个实施方案中，该细胞是平滑肌细胞与至少一种其它细胞类型的组合。在一些实施方案中，该其它细胞类型是成纤维细胞。在一些实施方案中，该成纤维细胞为该工程化的组织提供结构和生物支撑。在又另一个实施方案中，该其它细胞类型是内皮细胞。在一些实施方案中，该内皮细胞有助于该工程化组织的血管化和/或微血管化。在再一个实施方案中，该细胞是平滑肌细胞、成纤维细胞和内皮细胞。在包括超过一种细胞类型的实施方案中，所述细胞类型以多种合适的比例存在，其实例如本文所述。
[0074]在一些实施方案中，该细胞是成体的、分化的细胞。在进一步的实施方案中，“分化的细胞”是在分离时具有与例如肌细胞、成纤维细胞或内皮细胞一致的组织特异性表型的细胞，其中从分离时到使用时都保持着组织特异性表型(或显示该表型的潜能)。在其它实施方案中，该细胞是成体的、未分化的细胞。在进一步的实施方案中，“未分化的细胞”是不具有或已经丧失例如肌细胞、成纤维细胞或内皮细胞的明确组织特异性性状的细胞。在一些实施方案中，未分化的细胞包括干细胞。在进一步的实施方案中，“干细胞”是表现出潜能和自我更新的细胞。干细胞包括但不限于:全能干细胞、多能干细胞、多潜能细胞、寡能细胞、单能细胞和祖细胞。在各个实施方案中，干细胞是胚胎干细胞、成体干细胞、羊膜干细胞和诱导性多能干 细胞。在其它实施方案中，该细胞是成体的分化细胞与成体的未分化细胞的混合物。
[0075]在一些实施方案中，该平滑肌细胞是人类平滑肌细胞。在一些实施方案中，作为非限制性的实例，合适的平滑肌细胞来源于包括以下组织的组织:血管、淋巴管、消化道的组织、泌尿生殖道的组织、脂肪组织、呼吸道的组织、生殖系统的组织、骨髓和脐带组织。在一些实施方案中，其它(非平滑肌)细胞组分源自感兴趣的靶组织。在其它实施方案中，其它(非平滑肌)细胞组分源自除感兴趣的靶组织以外的组织。在进一步的实施方案中，一些或所有的细胞是由哺乳动物脂肪抽吸物的基质血管部分培养的。参见实施例1。
[0076]在各个实施方案中，基于特定的目的或目标来选择、配置、处理或调整细胞的细胞类型和/或来源。在一些实施方案中，一种或多种特定的细胞类型来源于两个或更多个不同的人供体。在一些实施方案中，一种或多种特定的细胞类型来源于特定的脊椎动物受试者。在进一步的实施方案中，一种或多种特定的细胞类型来源于特定的哺乳动物受试者。在更进一步的实施方案中，一种或多种特定的细胞类型来源于特定的人类受试者。
培养细胞的方法
[0077]在本发明的工程化组织中使用的细胞类型以本领域已知的任何方式适当地培养。细胞和组织培养方法是本领域已知的，并且例如描述在Freshney, R.，Culture ofAnimal Cells:A Manual of Basic Techniques, Wiley (1987)中，为了这些信息通过引用将其内容并入本文。在 Doyle, A.，Griffiths, J.B.，Newell, D.G.，(编)Cell and TissueCulture:Laboratory Procedures, Wiley (1998)中也描述了适合与本发明一起使用的普通哺乳动物细胞培养技术、细胞系和细胞培养系统，为了这些信息通过引用将其内容并入本文。[0078]适合于培养中的哺乳动物细胞的生长条件是本领域公知的。例如参见实施例1。细胞培养基通常包括必需营养物和任选的附加成分，例如生长因子、盐、矿物质、维生素等，它们是根据所培养的细胞类型而选择的。任选地选择特定的成分来加强细胞生长、分化和特异性蛋白质的分泌等。通常，标准的生长培养基包括Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)，低葡萄糖及110mg/L丙酮酸盐和谷氨酰胺，补充1-20%的胎牛血清(FBS)、牛血清或人血清和100U/mL青霉素、0.lmg/mL链霉素是适当的，如同本领域技术人员公知的各种其它标准培养基。优选地，细胞在无菌条件下、在1-21% O2和优选3-5% CO2的气氛中、在接近或达到细胞来源动物体温的温度下培养。例如，人类细胞优选在约37°C下培养。
[0079]细胞任选地与细胞分化剂一起培养，以诱导细胞沿着期望的路线分化。例如，细胞任选地与生长因子、细胞因子等一起培养。在一些实施方案中，术语“生长因子”指蛋白质、多肽或多肽的复合物，包括细胞因子，它们是由细胞产生的，并且影响其自身和/或多种相邻的或远处的其它细胞。一般而言，生长因子或者发育性地或者响应于众多生理学或环境刺激影响特定类型的细胞的生长和/或分化。一些但不是全部生长因子是激素。示例性的生长因子是胰岛素、胰岛素样生长因子(IGF)、神经生长因子(NGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、角质形成细胞生长因子(KGF)、成纤维细胞生长因子(FGFs，包括碱性FGF(bFGF))、血小板衍生生长因子O3DGFs,包括TOGF-AA和TOGF-AB)、肝细胞生长因子(HGF)、转化生长因子α (TGF-α)、转化生长因子β (TGF-β，包括TGFβ I和TGFβ 3)、表皮生长因子(EGF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、白细胞介素-6 (IL-6)、IL-8 等。除了其它地方外，在Molecular Cell Biology, Scientific AmericanBooks, Darnell 等人编，1986 !Principles of Tissue Engineering,第二版，Lanza 等人编，Academic Press, 2000中讨论了生长因子。本领域技术人员将会理解:在本文描述的条件培养基中的任何及所有培养物衍生的生长因子都在本发明的范围内。
生物墨水和多细胞聚集体
[0080]在某些实施方案中，本文公开了包含一个或多个层的、工程化的可植入组织和/或器官，其中至少一个层包含肌细胞。在一些实施方案中，该一个或多个层和/或该工程化组织或器官基本上由细胞材料组成。在进一步的实施方案中，除肌细胞以外的细胞被分配到该一个或多个层的至少一个表面上。在一些实施方案中，该一个或多个层在使用时基本无支架。
[0081]在一些实施方案中，通过从生物打印机沉积或挤出生物墨水来生物打印细胞和/或层。在一些实施方案中，“生物墨水”包括包含多个细胞的液体、半固体或固体组合物。在一些实施方案中，生物墨水包含液体或半固体的细胞溶液、细胞悬浮液或细胞浓缩物。在进一步的实施方案中，细胞溶液、悬浮液或浓缩物包含液体或半固体(例如粘性的)支持物和多个细胞。在更进一步的实施方案中，该支持物是合适的细胞营养培养基，例如本文中描述的那些。在一些实施方案中，生物墨水包含半固体或固体的多细胞聚集体或多细胞体。在进一步的实施方案中，通过如下步骤产生生物墨水:1)以预先确定的比例，将多个细胞或细胞聚集体与生物相容性液体或凝胶混合，以形成生物墨水；和2)使该生物墨水致密化，以产生具有期望的细胞密度和粘度的生物墨水。在一些实施方案中，通过离心作用、切向流过滤(“TFF”)或其组合来实现生物墨水的致密化。在一些实施方案中，生物墨水的致密化产生了可挤出的组合物，从而允许形成多细胞聚集体或多细胞体。在一些实施方案中，“可挤出的”是指能够通过被迫(例如在压力下)穿过喷嘴或孔口(例如，一个或多个洞或管)而成形。在一些实施方案中，生物墨水的致密化是由细胞生长到合适的密度而引起的。该生物墨水所需的细胞密度会随着所使用的细胞和要产生的组织或器官而改变。在一些实施方案中，该生物墨水的细胞是凝聚和/或粘附的。在一些实施方案中，“凝聚(cohere) ”、“凝聚的(cohered) ”和“凝聚(cohesion) ”指将细胞、多细胞聚集体、多细胞体和/或它们的层结合起来的细胞-细胞粘附性质。在一些实施方案中，该术语可以与“融合(fuse)”、“融合的(fused)”和“融合(fusion)”互换使用。在一些实施方案中，该生物墨水另外包含支持材料、细胞培养基(或其补充物)、细胞外基质(或其组分)、细胞粘着剂、细胞死亡抑制剂、抗凋亡剂、抗氧化剂、挤出化合物和它们的组合。
[0082]在各个实施方案中，该细胞是任何合适的细胞。在进一步的各个实施方案中，该细胞是脊椎动物细胞、哺乳动物细胞、人类细胞或它们的组合。在一些实施方案中，在本文公开的方法中使用的细胞类型取决于要产生的构建体或组织的类型。在一些实施方案中，该生物墨水包含一种类型的细胞(也被称为“均质”或“单型”生物墨水)。在一些实施方案中，该生物墨水包含超过一种类型的细胞(也被称为“异质”或“多型”生物墨水)。
[0083]在各个实施方案中，生物墨水在制备该生物墨水时包含30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99、99.5,99.9 和 100% (包括其中的增量)的细胞材料。在各个实施方案中，生物墨水在将该生物墨水用于生物打印时包含30、35、40、45、50、
55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99、99.5、99.9 和 100% (包括其中的增量)的细胞材料。
细胞培养基
[0084]在一些实施方案中，该生物墨水包含细胞培养基。该细胞培养基是任何合适的培养基。在各个实施方案中，作为非限制性的实例，合适的细胞培养基包括:DulbeCC0磷酸盐缓冲盐水、Earle平衡盐、Hanks平衡盐、Tyrode盐、Alsever溶液、Gey平衡盐溶液、Kreb' s-Henseleit改良缓冲系、Kreb’ s-Ringer碳酸氢盐缓冲系、Puck盐水、Dulbecco改良Eagle培养基、Dulbecco改良Eagle培养基/营养F_12Ham、营养混合物F_10Ham(Ham’ sF-10)、培养基199、基本必需培养基Eagle、RPM1-1640培养基、Ames培养基、BGJb培养基(Fitton-Jackson 改良)、Click 培养基、CMRL-1066 培养基、Fischer 培养基、Glascow 基本必需培养基(GMEM)、Iscove 改良 Dulbecco 培养基(IMDM)、L-15 培养基(Leibovitz)、McCoy5A改良培养基、NCTC培养基、Swim S-77培养基、Waymouth培养基、WiIIiam培养基E或它们的组合。在一些实施方案中，该细胞培养基得到改良或补充。在一些实施方案中，该细胞培养基进一步包含白蛋白、硒、转铁蛋白、胎球蛋白、糖、氨基酸、维生素、生长因子、细胞因子、激素、抗生素、脂质、脂质载体、环糊精、富血小板血浆或它们的组合。
细胞外基质
[0085]在一些实施方案中，该生物墨水进一步包含细胞外基质或其衍生物的一种或多种组分。在一些实施方案中，“细胞外基质”包括由细胞产生并从细胞中转运到细胞外隙内的蛋白质，在细胞外隙中它们作为支持物将组织保持在一起、提供拉伸强度和/或促进细胞信号传导。细胞外基质组分的实例包括但不限于:胶原蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白、透明质酸盐、弹性蛋白和蛋白聚糖。例如，在某些情况下，该多细胞聚集体含有多种ECM蛋白质(例如，明胶、纤维蛋白原、纤维蛋白、胶原蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白、弹性蛋白和蛋白聚糖)。在一些实施方案中，ECM组分或ECM组分的衍生物被加入到用于形成多细胞聚集体的细胞浆料中。在进一步的实施方案中，加入到细胞浆料中的ECM组分或ECM组分的衍生物是从人类或动物源纯化的，或者通过本领域已知的重组方法产生的。或者，该ECM组分或ECM组分的衍生物是由细长细胞体内的细胞自然分泌的，或者用于形成该细长细胞体的细胞通过任何本领域已知的合适方法进行遗传操作，以改变一种或多种ECM组分或ECM组分的衍生物和/或一种或多种细胞粘附分子或细胞-基底粘附分子(例如，选择素、整合素、免疫球蛋白和粘附素)的表达水平。在一些实施方案中，ECM组分或ECM组分的衍生物促进细胞在多细胞聚集体中的凝聚。例如，在一些实施方案中，将明胶和/或纤维蛋白原适当地加入到细胞浆料中，该浆料用于形成多细胞聚集体。在进一步的实施方案中，通过加入凝血酶将纤维蛋白原转变为纤维蛋白。
[0086]在一些实施方案中，该生物墨水进一步包含促进细胞粘附的试剂。
[0087]在一些实施方案中，该生物墨水进一步包含抑制细胞死亡(例如，坏死、凋亡或自体吞噬)的试剂。在一些实施方案中，该生物墨水进一步包含抗凋亡剂。抑制细胞死亡的试剂包括但不限于:小分子、抗体、肽、肽体或它们的组合。在一些实施方案中，抑制细胞死亡的试剂选自:抗-TNF试剂、抑制白细胞介素活性的试剂、抑制干扰素活性的试剂、抑制GCSF(粒细胞集落刺激因子)活性的试剂、抑制巨噬细胞炎性蛋白活性的试剂、抑制TGF-B(转化生长因子B)活性的试剂、抑制MMP(基质金属蛋白酶)活性的试剂、抑制胱天蛋白酶活性的试剂、抑制MAPK/JNK信号级联活性的试剂、抑制Src激酶活性的试剂、抑制JAK(Janus激酶) 活性的试剂或它们的组合。在一些实施方案中，该生物墨水包含抗氧化剂。
挤出化合物
[0088]在一些实施方案中，该生物墨水进一步包含挤出化合物(即，改变生物墨水的挤出性质的化合物)。挤出化合物的实例包括但不限于:凝胶、水凝胶、肽水凝胶、基于氨基酸的凝胶、表面活性剂多元醇(例如Pluronic F-127或PF-127)、热响应性聚合物、透明质酸盐、藻酸盐、细胞外基质组分(及其衍生物)、胶原、其它生物相容性天然或合成聚合物、纳米纤维和自组装的纳米纤维。
[0089]已经以各种方式定义了凝胶，有时被称作胶状物。例如，《美国药典》将凝胶定义为由小无机粒子组成的悬浮液或被液体互相渗透的大有机分子组成的半固体体系。凝胶包括单相或两相体系。单相凝胶由均匀分布在整个液体中的有机大分子组成，其分布方式使得在分散的大分子和液体之间不存在明显的边界。某些单相凝胶是由合成大分子(例如卡波姆)或由天然树胶(例如西黄蓍胶)制备的。在一些实施方案中，单相凝胶通常是水性的，但是也可以利用醇和油来制备。两相凝胶由小离散微粒的网络组成。
[0090]在某些情况下，凝胶被分类为亲水的或疏水的。在某些实施方案中，疏水凝胶的基质由液体石蜡与聚乙烯，或用胶态二氧化硅，或铝或锌皂胶凝的脂肪油组成。相反，亲水凝胶的基质一般由用合适的胶凝剂(例如，西黄蓍胶、淀粉、纤维素衍生物、羧乙烯基聚合物和硅酸镁铝)胶凝的水、甘油或丙二醇组成。在某些实施方案中，本文中公开的组合物或装置的流变学是假塑性、塑性、触变性或膨胀性的。
[0091]适宜的水凝胶包括衍生自胶原、透明质酸盐、纤维蛋白、藻酸盐、琼脂糖、壳聚糖及其组合的水凝胶。在其它实施方案中，适宜的水凝胶是合成聚合物。在进一步的实施方案中，适宜的水凝胶包括衍生自聚(丙烯酸)或其衍生物、聚(环氧乙烷)及其共聚物、聚(乙烯醇)、聚磷腈及其组合的水凝胶。在各个具体实施方案中，限制材料选自:水凝胶、NovoGel ?、琼脂糖、藻酸盐、明胶、Matrigel?、透明质酸、泊洛沙姆、肽水凝胶、聚(异丙基正聚丙烯酰胺)、聚乙二醇二丙烯酸酯(PEG-DA)、甲基丙烯酸羟乙酯、聚二甲基硅氧烷、聚丙烯酰胺、聚(乳酸)、硅、丝或它们的组合。
[0092]在一些实施方案中，基于水凝胶的挤出化合物是热可逆凝胶(也称为热响应性凝胶或热凝胶)。在一些实施方案中，合适的热可逆水凝胶在室温下不是液体。在具体实施方案中，合适的水凝胶的胶凝温度(Tgel)为约10°C、1TC、12°C、13°C、14°C、15°C、16°C、17 °C ,18 °C >19 °C >20 °C >21 °C >22 °C >23 °C >24 °C >25 °C >26 °C >27 °C >28 °C、29 °C、30 °C、31 °C、32°C、33°C、34°C、35°C、36°C、37°C、38°C、39°C、40°C，包括其中的增量。在某些实施方案中，合适的水凝胶的Tgel为约10°C至约40°C。在进一步的实施方案中，合适的水凝胶的Tgel为约20°C至约30°C。在一些实施方案中，本文所述的生物墨水(例如，包含水凝胶、一种或多种细胞类型和其它添加剂等)在室温下不是液体。在一些实施方案中，合适的热可逆水凝胶在哺乳动物的体温下不是液体。在具体的实施方案中，合适的水凝胶的胶凝温度(Tgel)为约 22°C、23°C、24t:、25t:、26t:、27t:、28t:、29t:、3(rCt:、3rC、32t:、33t:、34 °C >35 °C >36 °C >37 °C >38 °C >39 °C >40 V、41 °C >41 °C >43 °C >44 °C >45 °C >46 °C >47 °C >48 V、49°C、50°C、51°C、52°C，包括其中的增量。在某些实施方案中，合适的水凝胶的Tgel为约22 °C至约52 °C。在进一步的实施方案中，合适的水凝胶的TgeI为约32°C至约42°C。在一些实施方案中，本文所述的生物墨水(例如，包含水凝胶、一种或多种细胞类型和其它添加剂等)在哺乳动物的体温下不是液体。在具体的实施方案中，本文所述的生物墨水的胶凝温度(Tgel)为约 10°C、约 151:、约201:、约251:、约301:、约351:、约401:、约451:、约501:、约55°C，包括其中的增量。在具体实施方案中，本文所述的生物墨水的Tgel是约10°C至约15°C。在另一具体实施方案中，本文所述的生物墨水的Tgel是约15°C至约20°C。在另一具体实施方案中，本文所述的生物墨水的Tgel是约20°C至约25°C。在另一具体实施方案中，本文所述的生物墨水的Tgel是约25°C至约30°C。在另一具体实施方案中，本文所述的生物墨水的Tgel是约30°C至约35°C。在另一具体实施方案中，本文所述的生物墨水的Tgel是约35°C至约40°C。在另一具体实施方案中，本文所述的生物墨水的Tgel是约40°C至约45°C。在另一具体实施方案中，本文所述的生物墨水的Tgel是约45°C至约50°C。
[0093]当并入水溶液中时，由聚氧化丙烯和聚氧化乙烯组成的聚合物形成热可逆的凝胶。在生物打印机装置中可以保持的温度下，这些聚合物具有从液态变为凝胶态的能力。该液态至凝胶态的相变取决于聚合物的浓度和溶液中的成分。
[0094]泊洛沙姆407 (Pluronic F-127或PF-127)是由聚氧化乙烯-聚氧化丙烯共聚物组成的非离子表面活性剂。其它泊洛沙姆包括188 (F-68级)、237 (F-87级)、338 (F-108级)。泊洛沙姆的水溶液在酸、碱和金属离子的存在下是稳定的。PF-127是通式E106P70E106的可商购的聚氧化乙烯-聚氧化丙烯三嵌段共聚物，具有13000的平均摩尔质量。在一些实施方案中，该聚合物采用增强聚合物的胶凝性质的合适的方法进一步纯化。它含有大约70%的氧化乙烯，这解释了它的亲水性。它是泊洛沙姆ABA嵌段共聚物系列中的一种。PF-127具有良好的增溶能力、低毒性，因此被认为是合适的挤出化合物。
[0095]在一些实施方案中，通过任何所述的手段来测量本文中提出的水凝胶和生物墨水的粘度。例如，在一些实施方案中，采用LVDV-1I+CP Cone Plate粘度计和Cone SpindleCPE-40来计算水凝胶和生物墨水的粘度。在其它实施方案中，采用Brookfield(轴和杯)粘度计来计算水凝胶和生物墨水的粘度。在一些实施方案中，本文中中提及的粘度范围是在室温下测量的。在其它实施方案中，本文中提及的粘度范围是在体温下(例如，在健康人的平均体温下)测量的。
[0096]在进一步的实施方案中，该水凝胶和/或生物墨水的特征在于具有约500至
I,000，000 厘泊、约 750 至 I, 000，000 厘泊、约 1000 至 I, 000，000 厘泊、约 1000 至 400，000厘泊、约2000至100，000厘泊、约3000至50，000厘泊、约4000至25，000厘泊、约5000至20，000厘泊或约6000至15，000厘泊的粘度。
[0097]在一些实施方案中，该生物墨水包含细胞和适合于连续生物打印的挤出化合物。在具体实施方案中，该生物墨水具有约1500mPa.s的粘度。在一些实施方案中，PluronicF-127和细胞材料的混合物适合于连续生物打印。在进一步的实施方案中，这样的生物墨水通过以下步骤制备:通过在冷(4°C )磷酸盐缓冲盐水(PBS)中连续混合48小时溶解Pluronic F-127粉末至30% (w/v)。Pluronic F-127也适当地溶解在水中。任选地采用标准无菌细胞培养技术将细胞培养和扩充。在一些实施方案中，例如将该细胞在200g下沉淀，并重悬浮在30% Pluronic F-127中。在进一步的实施方案中，将细胞抽吸到附着在生物打印机上的储存器中，并使之在约10至约25°C的胶凝温度下固化。在生物打印之前生物墨水的胶凝是 任选的。生物墨水，包括包含Pluronic F-127的生物墨水，任选地作为液体分配。
[0098]在各个实施方案中，Pluronic F-127的浓度是具有合适的粘度和/或细胞毒性的任意值。在一些实施方案中，Pluronic F-127的合适的浓度能够在生物打印时支撑重量同时保持其形状。在一些实施方案中，Pluronic F-127的浓度为约10%、约15%、约20%、约25%、约30%、约35%、约40%、约45%或约50%。在一些实施方案中，Pluronic F-127的浓度为约30%至约40%，或者约30%至约35%。
[0099]在一些实施方案中，在使用之前除去生物墨水的非细胞组分(例如，挤出化合物等)。在进一步的实施方案中，非细胞组分例如是:水凝胶、肽水凝胶、基于氨基酸的凝胶、表面活性剂多元醇、热响应性聚合物、透明质酸盐、藻酸盐、胶原或其它生物相容性天然或合成聚合物。在更进一步的实施方案中，通过物理、化学或酶手段除去非细胞组分。在一些实施方案中，在使用时，一部分非细胞组分仍与细胞组分相关联。
[0100]在一些实施方案中，预处理细胞，以增加细胞相互作用。例如，为了在生物墨水成形之前增强细胞-细胞相互作用，任选地在离心之后在离心管内培养细胞。进一步举例来说，细胞任选地暴露于促进细胞-细胞间相互作用的分子或试剂，诸如调节离子平衡的那些分子或试剂。
示例性的细胞比例
[0101]在一些实施方案中，用于构建组织层的生物墨水包含多细胞体，该多细胞体进一步包含肌细胞(例如，平滑肌细胞、骨骼肌细胞和/或心肌细胞)和一种或多种其它细胞类型。在进一步的实施方案中，肌细胞与其它细胞组分的比例为任何合适的比例。在更进一步的实施方案中，肌细胞与其它细胞组分的比例为约90:10至约60:40。在具体的实施方案中，该多细胞体包含肌细胞和内皮细胞，并且肌细胞与内皮细胞的比例为约85:15。在另一具体实施方案中，该多细胞体包含平滑肌细胞和内皮细胞，并且平滑肌细胞与内皮细胞的比例为约70:30。
[0102]在一些实施方案中，用于构建组织层的生物墨水包含多细胞体，该多细胞体进一步包含肌细胞和成纤维细胞。在进一步的实施方案中，肌细胞与成纤维细胞的比例为任何合适的比例。在更进一步的实施方案中，肌细胞与成纤维细胞的比例为约90:10至约60:40。
[0103]在一些实施方案中，用于构建组织层的生物墨水包含多细胞体，该多细胞体进一步包含肌细胞、成纤维细胞和内皮细胞。在进一步的实施方案中，肌细胞、成纤维细胞和内皮细胞的比例为任何合适的比例。在更进一步的实施方案中，肌细胞与成纤维细胞和内皮细胞的比例为约70:25:5。
细胞的自分选(self-sorting)
[0104]在一些实施方案中，用于形成构建体或组织的多细胞聚集体包含将要包括在工程化组织或器官中的所有细胞类型(例如，肌细胞和一种或多种其它细胞类型)；在这样的实例中，每个细胞类型迁移到合适的位置(例如，在成熟期间)，以形成工程化组织或器官。在其它的实施方案中，用于形成结构的多细胞聚集体包括比将要包括在工程化组织中的所有细胞类型要少的细胞类型。在一些实施方案中，每个类型的细胞均匀分布在多细胞聚集体中，或组织的区域或层中。在其它实施方案中，每个类型的细胞定位在多细胞聚集体内的特定区域或组织的区域或层中。
[0105]例如，在以合 适的比例(例如，85:15、70:30等)包含平滑肌细胞和内皮细胞的工程化平滑肌片的情况下，相邻的、生物打印的凝聚多型圆柱形生物墨水单元融合在一起。在成熟期间，内皮细胞在某种程度上定位在构建体的外围，并形成胶原。例如，参见图l、2、3a和4b。进一步举例来说，在以合适的比例(例如，70:25:5等)包含平滑肌细胞、成纤维细胞和内皮细胞的生物打印的平滑肌补片的情况下，生物打印的多型圆柱形生物墨水单元融合在一起，并且内皮细胞在某种程度上定位在构建体的外围。在一些实施方案中，细胞类型在构建体内的定位模拟了体内或离体哺乳动物组织的分层结构。在一些实施方案中，通过应用一个或多个细胞层加速、增强或增加了细胞的分选或自分选。例如，在一些实施方案中，用包含平滑肌细胞和其它细胞类型(如内皮细胞和/或成纤维细胞)的多型生物墨水生物打印的构建体，进一步在该构建体的一个或多个表面上施加一层第二细胞类型。在进一步的实施方案中，施加一层第二细胞类型的结果是细胞在多型生物墨水中的空间分选的增加。
预形成的支架
[0106]在一些实施方案中，本文公开了工程化的可植入组织和器官，其不含或基本不含任何预形成的支架。在进一步的实施方案中，“支架”是指合成的支架，例如聚合物支架和多孔水凝胶；非合成的支架，例如预形成的细胞外基质层、死细胞层和脱细胞的组织；以及任何其它类型的预形成支架，它对于工程化组织和/或器官的物理结构而言是必要的，并且不从该组织和/或器官除去。在进一步的实施方案中，脱细胞的组织支架包括脱细胞的天然组织或以任意方式由培养的细胞产生的脱细胞的细胞材料；例如，使之死亡或者脱细胞的细胞层，留下它们在活着时产生的ECM。
[0107]在一些实施方案中，该工程化的可植入组织和器官不利用任何预形成的支架，例如，来形成该组织、该组织的任何层或者形成该组织的形状。作为非限制性的实例，本发明的工程化组织不利用任何预形成的合成支架(例如聚合支架)、预形成的细胞外基质层或任何其它类型的预形成支架。在一些实施方案中，该工程化的组织和器官在使用时基本不含任何预形成的支架。在进一步的实施方案中，该组织和器官在使用时含有可检测到但是痕量或微量的支架，例如，小于总组合物的约2.0%。在更进一步的实施方案中，痕量或微量的支架不足以影响该组织的长期行为或者妨碍其主要生物功能。在另外的实施方案中，在打印之后，通过物理、化学或酶方法除去支架组分，从而产生不含或基本不含支架组分的工程化组织。在更进一步的实施方案中，该工程化的可植入组织和器官含有基于体积多达约70%的生物相容性支架。在更进一步的实施方案中，该工程化的可植入组织和器官在使用时含有基于体积多达约50%的生物相容性支架。
[0108]在一些实施方案中，本文公开的不含或基本不含预形成支架的工程化可植入组织和器官，与用某些其它组织工程方法开发的那些形成鲜明对比，后者中第一步先形成支架材料，然后第二步将细胞接种到支架上。细胞随后增殖，以填充并呈现支架的形状。在一个方面，本文中描述的生物打印方法允许产生活的且有用的组织，其基本不含预形成的支架。在另一方面，在一些实施方案中，利用限制材料将本发明的细胞保持在期望的三维形状中。该限制材料至少在以下事实上与支架是不同的:限制材料是暂时的和/或可以从细胞和/或组织除去。
含肌细胞层
[0109]在某些实施方案中，本文公开了包含一个或多个层的工程化的可植入组织和器官，其中该工程化组织或器官的至少一个层包含肌细胞。在一些实施方案中，该工程化的可植入组织和器官包含至少一层肌肉。合适的包含肌细胞和/或肌肉的层包括细胞材料。在各个实施方案中，合适的含肌细胞层在构建时具有约25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99、99.5,99.9和100% (包括其中的增量)的细胞材料的组成。在其它各个实施方案中，合适的含肌细胞层在使用时具有约25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99、99.5,99.9 和 100% (包括其中的增量)的细胞材料的组成。在一些实施方案中，包含肌细胞的一个或多个层包含具有三维几何形状的融合的细胞元件。在进一步的实施方案中，包含肌细胞的一个或多个层是生物打印的。
[0110]在一些实施方案中，含肌细胞层包括平滑肌。在一些实施方案中，含肌细胞层包括骨骼肌。在一些实施方案中，含肌细胞层包括心肌。在一些实施方案中，含肌细胞层(除肌细胞之外)还包括任何类型的哺乳动物细胞，诸如本文所述的那些。在各个进一步的实施方案中，所述层包括 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20 种或更多种其它细胞类型。在一些实施方案中，该工程化的组织和器官包括源自一名或多名特定人类受试者的一种或多种细胞类型。在各个实施方案中，该工程化的组织和器官包括源自2、3、4、5、6、7、8、9、10名或更多名特定人类受试者的细胞类型。在其它实施方案中，一种或多种特定的细胞类型源自特定的脊椎动物受试者。在进一步的实施方案中，一种或多种特定的细胞类型源自特定的哺乳动物受试者。在再进一步的实施方案中，一种或多种特定的细胞类型源自特定的人类受试者。
[0111]在一些实施方案中，平滑肌层包括平滑肌细胞和内皮细胞。实施例3说明了由人主动脉平滑肌细胞和人主动脉内皮细胞组成的圆柱形生物墨水的制作，而实施例5说明了由从人脂肪抽吸物的基质血管组分培养的平滑肌细胞和内皮细胞组成的生物墨水的制作。实施例6说明了此类圆柱体的生物打印和融合，从而形成平滑肌补片。在其它实施方案中，平滑肌层包括平滑肌细胞和成纤维细胞。在又一些其它实施方案中，平滑肌层包括平滑肌细胞、内皮细胞和成纤维细胞。实施例4说明了由人主动脉平滑肌细胞、人皮肤成纤维细胞和人主动脉内皮细胞组成的多型生物墨水的制作。在一些实施方案中，平滑肌层的细胞彼此“凝聚”或“粘附”。在进一步的实施方案中，凝聚或粘附是指能使细胞、多细胞聚集体、多细胞体和/或它们的层结合在一起的细胞-细胞粘附性质。
[0112]该工程化的可植入组织和器官包括任何合适的层数。在各个实施方案中，该工程化的组织和器官包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15层或更多层。在一些实施方案中，层是生物打印的，并且具有由多细胞体(例如，细长的、圆柱状的或带状体)的放置、图案或取向所限定的取向。在进一步的实施方案中，工程化组织或器官包括超过一层，并且每一层的特征在于其相对于一个或多个其它层具有特定的取向。在各个实施方案中，一个或多个层相对于相邻层具有包括旋转的取向，其中该旋转是约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175或180度，或其中的增量。在其它实施方案中，所有层的取向基本相似。
[0113]合适的层的特征在于具有任何合适的厚度。在各个实施方案中，合适的层在构建时的厚度为约 10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、 380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、750、800、850、900、950、1000μπι 或更多，包括其中的增量。在其它各个实施方案中，合适的层在使用时的厚度为约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、750、800、850、900、950、1000μ m 或更多，包括其中的增量。
[0114]合适的含肌细胞层的特征在于具有任何合适的厚度。在各个实施方案中，合适的含肌细胞层在构建时的厚度为约 10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、750、800、850、900、950、1000 μ m或更多，包括其中的增量。在其它各个实施方案中，合适的含肌细胞层在使用时的厚度为约 10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、750、800、850、900、950、100(^111或更多，包括其中的增量。
[0115]在一些实施方案中，含肌细胞层基本为片的形式或包含片的形式。在进一步的实施方案中，生物打印的肌肉片用于构建工程化的组织或器官。在再进一步的实施方案中，生物打印的肌肉片用于手术构建全部或部分肌肉壁。在再进一步的实施方案中，生物打印的肌肉片用于手术构建全部或部分胃肠壁、泌尿道壁或气道壁。在再进一步的实施方案中，生物打印的肌肉片用于手术构建全部或部分膀胱、胃、肠、食道、尿道、子宫、输尿管或其一部分。在再进一步的实施方案中，生物打印的肌肉片用于手术构建全部或部分膀胱壁、胃壁、肠壁、食道壁、尿道壁、子宫壁、输尿管壁或其一部分。
[0116]在一些实施方案中，含肌细胞层基本为管的形式或包含管的形式。在进一步的实施方案中，生物打印的肌肉管用于构建工程化的器官。在再进一步的实施方案中，生物打印的肌肉管用于构建工程化的输尿管、泌尿导管、肝门十二指肠肠导管、输卵管、子宫、气管、支气管、淋巴管、尿道、肠、结肠、食道或其一部分。在一些实施方案中，本文所公开的管不是血管。
[0117]在一些实施方案中，含肌细胞层基本为囊的形式或包含囊的形式。在进一步的实施方案中，生物打印的肌肉囊用于构建工程化的器官。在再进一步的实施方案中，生物打印的肌肉囊用于构建工程化的胃、膀胱、子宫、胆囊或其一部分。
除肌细胞以外的细胞
[0118]在一些实施方案中，本文所公开的工程化的可植入组织和器官包括至少一个含肌细胞层。在进一步的实施方案中，本文所公开的工程化的可植入组织和器官包括至少一个含肌肉和/或肌细胞的层。在再进一步的实施方案中，本文所公开的工程化的可植入组织和器官包括至少一个含平滑肌和/或平滑肌细胞的层。在再进一步的实施方案中，本文所公开的工程化的可植入组织和器官包括至少一个含骨骼肌和/或骨骼肌细胞的层。在再进一步的实施方案中，本文所公开的工程化的可植入组织和器官包括至少一个含心肌和/或心肌细胞的层。在进一步的 实施方案中，该工程化的可植入组织和器官包括除肌细胞以外的细胞。在一些实施方案中，除肌细胞以外的细胞并入含肌细胞层中。在各个进一步的实施方案中，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15种或更多种类型的细胞并入含肌细胞层中。在一些实施方案中，除肌细胞以外的细胞被分配到含肌细胞层的至少一个表面上。在各个进一步的实施方案中，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15种或更多种类型的细胞被分配到含肌细胞层上。在又进一步的各个实施方案中，除肌细胞以外的细胞被分配到含肌细胞层的1、2、3、4个或更多个表面上。
[0119]在一些实施方案中，被分配到含肌细胞层的至少一个表面上的细胞包括任何类型的哺乳动物细胞，如本文所述的那些哺乳动物细胞。在一些实施方案中，被分配的细胞包括源自一名或多名特定人类受试者的一种或多种细胞类型。在各个实施方案中，被分配的细胞包括源自2、3、4、5、6、7、8、9、10名或更多名特定人类受试者的细胞类型。在其它实施方案中，一种或多种特定的细胞类型源自特定的脊椎动物受试者。在进一步的实施方案中，一种或多种特定的细胞类型源自特定的哺乳动物受试者。在再进一步的实施方案中，一种或多种特定的细胞类型源自特定的人类受试者。
[0120]在一些实施方案中，除肌细胞以外的细胞以细胞层的形式被分配到肌肉的一个或多个表面上。在进一步的实施方案中，被分配的细胞层包含细胞单层。在进一步的实施方案中，该单层是铺满的。在其它实施方案中，单层不是铺满的。在一些实施方案中，除肌细胞以外的细胞以一个或多个细胞片的形式被分配到肌肉的一个或多个表面上。在各个实施方案中，细胞片的厚度为约 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 个或更多个细胞，包括其中的增量。在其它各个实施方案中，细胞片为约10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、50(^111厚或更厚，包括其中的增量。在一些实施方案中，除肌细胞以外的细胞以融合的细胞聚集体的形式被分配到肌肉的一个或多个表面上。在进一步的实施方案中，融合之前，作为非限制性的实例，该细胞聚集体具有基本球形的、细长的、基本圆柱形的和带状的形状。在各个实施方案中，融合的细胞聚集体形成约10、15、20、25、30、35、40、
45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500 μ m厚或更厚的层，包括其中的增量。
[0121]在一些实施方案中，该工程化的组织和器官包括被分配到含肌肉层的一个或多个表面上的第二种非肌细胞类型。实施例7说明了平滑肌补片的构建，包括生物打印人血管平滑肌细胞聚集体(例如，圆柱体)，随后在SMC构建体的上表面上生物打印内皮细胞层。实施例8说明了平滑肌补片的构建，包括生物打印人主动脉平滑肌细胞聚集体(例如，圆柱体)，随后通过向SMC构建体上沉积特异性定位的内皮细胞悬浮液的液滴，来实现向上表面施加一层第二细胞类型。在一些实施方案中，该工程化的组织和器官包括被分配到平滑肌层的一个或多个表面上的第三细胞类型，诸如成纤维细胞。
[0122]实施例9说明了平滑肌补片的构建，包括将人主动脉平滑肌细胞聚集体(例如，圆柱体)直接生物打印到由第二细胞类型(例如，成纤维细胞)构成的层上，随后将第三细胞类型(例如，内皮细胞)施加到上表面上。顶部细胞层是通过向平滑肌层上沉积特异性定位的细胞悬浮液液滴而施加的。实施例9的程序产生包含凝聚的平滑肌细胞的组织、该平滑肌细胞的一个表面上的一层成纤维细胞和该平滑肌细胞的相对表面上的一层内皮细胞。
[0123]除肌细胞以外的细胞通过任何合适的技术被分配到一个或多个含肌细胞层之中和/或之上。合适的沉积技术包括那些能够递送略微受控的量或体积的细胞，而基本不对它们造成损伤的技术。在各个实施方案中，作为非限制性的实例，合适的沉积技术包括喷涂、喷墨、涂抹、浸涂、移植、接种、注射、分层、生物打印及其组合。
[0124]除肌细胞以外的细胞在制作过程中任意合适的时间被分配到一个或多个含肌细胞层上。在一些实施方案中，该细胞基本上在制作或构建肌肉的同时(例如，同时、随即等)进行分配。在其它实施方案中，该细胞在肌肉制作或构建之后进行分配。在各个进一步的实施方案中，该细胞在肌肉制作或构建1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90或更多分钟(包括其中的增量)之后进行分配。在其它各个实施方案中，该细胞在肌肉制作或构建1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、24、48或更多小时(包括其中的增量)之后进行分配。在又一些其它各个实施方案中，该细胞在肌肉制作或构建1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多天(包括其中的增量)后进行分配。在一些实施方案中，该细胞在一个或多个含肌细胞层成熟期间进行分配。
述
[0125]在一些实施方案中，本文公开了制备包含含肌细胞层的可植入组织或器官的方法。在进一步的实施方案中，该方法包括将含肌细胞的生物墨水生物打印成形式，并且将该生物墨水融合成凝聚的细胞结构。在再进一步的实施方案中，该可植入组织或器官在使用时基本不含任何预形成的支架。在各个实施方案中，该肌细胞是平滑肌细胞、骨骼肌细胞和/或心肌细胞。在一些实施方案中，该方法生成了基本不含任何预形成的支架的、含细胞的工程化组织和器官。
[0126]制备包含肌细胞的生物墨水
[0127]在一些实施方案中，该方法包括制备包含肌细胞的生物墨水。在一些实施方案中，该方法包括制备包含肌细胞的凝聚的多细胞聚集体。在一些实施方案中，该方法包括制备进一步包含其它细胞类型的凝聚的多细胞聚集体。在进一步的实施方案中，该方法包括制备进一步包含内皮细胞的凝聚的多细胞聚集体。例如，参见实施例3和5。在一些实施方案中，该方法包括制备进一步包含成纤维细胞的凝聚的多细胞聚集体。例如，参见实施例4。
[0128]存在多种制备包含具有本文所述特性的多细胞聚集体的生物墨水的方式。在一些实施方案中，从含有多个活细胞或具有所需细胞密度和粘性的细胞浆料制造多细胞聚集体。在进一步的实施方案中，将该细胞浆料成形为所需的形状和通过成熟(例如孵育)形成的多细胞体。在一些实施方案中，该多细胞聚集体基本上是圆柱形的。在一些实施方案中，该多细胞聚集体基本上是球形的。在其它实施方案中，该工程化组织是由具有一系列形状的多细胞聚集体构建的。在具体实施方案中，通过将包括多个活细胞的细胞浆料成形为细长形状(例如圆柱体)来产生细长的多细胞体。在进一步的实施方案中，将细胞浆料在受控环境中孵育，以使细胞彼此粘附和/或凝聚，以形成细长的多细胞体。在另一个具体实施方案中，通过在将细胞保持为三维形状的装置中，将包括多个活细胞的细胞浆料成形来制备多细胞体。在进一步的实施方案中，将细胞浆料在受控环境中孵育，同时将其保持为三维形状充分的时间，以在平表面上产生具有足以支撑其自身的凝聚力的多细胞体。
[0129]在各个实施方案中，通过如下步骤来提供细胞浆料:(A)混合(一种或多种细胞类型的)细胞或细胞聚集体与生物相容性凝胶或液体，例如细胞培养基(例如，以预先确定的比例)，以产生细胞悬浮液；和(B)将该细胞悬浮液致密化，以产生具有所需细胞密度和粘度的细胞浆料。在各个实施方案中，通过多种方法来实现致密化，例如通过将由细胞培养获得的特定细胞悬浮液浓缩，以获得所需的细胞浓度(密度)、粘度和细胞浆料所需的稠度。在具体的实施方案中，将来自细胞培养的相对较稀的细胞悬浮液离心设定的时间，以获得在能够在模具中成形的沉淀物中的细胞浓度。切向流过滤(“TFF”)是细胞浓缩或致密化的另一个合适的方法。在一些实施方案中，将化合物与细胞悬浮液合并，以提供所需的挤出性质。作为非限制的实例，合适的化合物包括:表面活性剂多元醇、胶原、水凝胶、MatrigeI?、纳米纤维、自组装纳米纤维、明胶、纤维蛋白原等。
[0130]在一些实施方案中，通过将多个活细胞与组织培养基混合并使活细胞致密化(例如通过离心)来产生细胞浆料。任选地通过如下步骤来包括一种或多种ECM组分(或ECM组分的衍生物):将细胞沉淀物重悬浮在一种或多种含有ECM组分(或ECM组分的衍生物)的生理学可接受的缓冲液中，并将所得细胞悬浮液再次离心以形成细胞浆料。
[0131]在一些实施方案中，进一步加工所需的细胞浆料的细胞密度随着细胞类型而改变。在进一步的实施方案中，细胞之间的相互作用决定了细胞浆料的性质，并且不同的细胞类型在细胞密度与细胞-细胞相互作用之间将具有不同的关系。在更进一步的实施方案中，在细胞浆料成形之前，任选地预处理该细胞，以增加细胞相互作用。例如，为了在细胞浆料成形之前增强细胞-细胞相互作用，任选地在离心之后在离心管内培养细胞。
[0132]在各个实施方案中，采用多种方法来使细胞浆料成形。例如，在特定实施方案中，将细胞浆料手工模塑或压制(例如，在浓缩/致密化之后)，以获得所需的形状。进一步举例来说，将细胞浆料吸收(例如，抽吸)到仪器如微量吸液管(例如，毛细吸管)中，这使细胞浆料成形，以符合该仪器的内表面。微量吸液管(例如毛细吸管)的横截面形状备选地是圆形的、正方形的、矩形的、三角形的或其它非圆形的横截面形状。在一些实施方案中，通过沉积，使细胞浆料在预形成的模具如塑料模具、金属模具或凝胶模具中成形。在一些实施方案中，采用离心浇铸或连续浇铸来使细胞浆料成形。
[0133]在一些实施方案中，单独的或与细长细胞体结合的基本为球形的多细胞聚集体也适合于建造本文中所述的组织和器官。通过多种方法适宜地产生球形聚集体，包括:自组装、使用模具和悬滴法。在进一步的实施方案中，产生基本为球形的多细胞聚集体的方法包括以下步骤:1)提供具有所需细胞密度和粘度的、含有多个预先选择的细胞或细胞聚集体的细胞浆料；2)将该细胞浆料处理成圆柱形状；3)将圆柱体切割成相等的片段；4)将该片段在旋转摇床上放置过夜；和5)通过成熟形成基本为球形的多细胞聚集体。
[0134]在一些实施方案中，部分粘附和/或凝聚的细胞浆料从成形装置(例如，毛细吸管)转移到允许向细胞供应营养物和/或氧气的第二成形装置(例如，模具)，同时它们在第二成形装置中保持额外的成熟时间。允许向细胞供应营养物和氧气的合适的成形装置的一个例子是用于制造多个多细胞聚集体(例如，基本相同的多细胞聚集体)的模具。进一步举例来说，这样的模具包括由抵抗细胞向基质中的迁移或向内生长并且抵抗细胞对基质的粘着的材料制成的生物相容性基质。在各个实施方案中，该基质适当地由Teflon?(PTFE)、不锈钢、琼脂糖、聚乙二醇、玻璃、金属、塑料或凝胶材料(例如水凝胶)和类似的材料制成。在一些实施方案中，还适当地配置模具，以允许向细胞浆料供应组织培养基(例如通过将组织培养基分配到模具的顶部上)。
[0135]因此，在使用第二成形装置的实施方案中，将部分粘附和/或凝聚的细胞浆料从第一成形装置(例如，毛细吸管)转移到第二成形装置(例如，模具)。在进一步的实施方案中，将部分粘附和/或凝聚的细胞 浆料由第一成形装置(例如，毛细吸管)转移到模具的凹槽中。在更进一步的实施方案中，在成熟期(其中模具与保留于其中的细胞浆料一起在受控环境中孵育，以使细胞浆料中的细胞进一步彼此粘附和/或凝聚，以形成多细胞聚集体)之后，细胞的凝聚力将足够强大，从而允许用工具(例如，毛细吸管)拾取所得的多细胞聚集体。在更进一步的实施方案中，该毛细吸管适宜地是生物打印机或类似装置的打印头的一部分，其可以操作，以自动地将多细胞聚集体放置在三维构建体中。
[0136]在一些实施方案中，多细胞聚集体的横截面形状和尺寸基本对应于第一成形装置和任选的用于制备该多细胞聚集体的第二成形装置的横截面形状和尺寸，并且本领域技术人员将能够选择具有适当横截面形状、横截面积、直径和长度的适当的成形装置，其适合于产生具有以上讨论的横截面形状、横截面积、直径和长度的多细胞聚集体。
[0137]在一些实施方案中，配制生物墨水，以使其能够采用能一步成形并分配生物墨水的自动化的、计算机辅助的三维原型系统进行生物打印。在一些实施方案中，用于一步成形和分配的生物墨水的配制包括加入挤出化合物。
将生物墨水生物打印成形式
[0138]在一些实施方案中，该方法包括将生物墨水生物打印成形式。生物打印是本文所描述的方法。许多三维形式是合适的并且能够通过生物打印而产生。在各个实施方案中，作为非限制性的实例，合适的形式包括片、管和囊，所有这些在本文中进一步描述。在一些实施方案中，生物打印出该形式，其具有适合于用工程化的可植入组织或器官来置换、部分置换或增大天然组织或器官的尺寸。在进一步的实施方案中，生物打印出该形式，其具有适合于置换、部分置换或增大特定受试者中的特定组织或器官的尺寸。
[0139]如本文所述，在各个实施方案中，生物墨水包含具有许多合适的形状和尺寸的多细胞聚集体。在一些实施方案中，多细胞聚集体是细长的，具有数种合适的横截面形状中的任一种，作为非限制性的实例，包括圆形、椭圆形、正方形、三角形、多边形和不规则形状。在进一步的实施方案中，多细胞聚集体是细长的，并且是圆柱体的形式。在一些实施方案中，细长的多细胞聚集体具有类似的长度和/或直径。在其它实施方案中，细长的多细胞聚集体具有不同的长度和/或直径。在一些实施方案中，多细胞聚集体基本上是球形的。在一些实施方案中，工程化的组织包括基本为球形的多细胞聚集体，其尺寸基本上是类似的。在其它实施方案中，工程化的组织包括基本为球形的多细胞聚集体，其具有不同的尺寸。在一些实施方案中，不同形状和尺寸的工程化组织是通过布置各种形状和尺寸的多细胞体而形成的。
[0140]在一些实施方案中，将凝聚的多细胞聚集体放置在支持物上。在各个实施方案中，该支持物是任何合适的生物相容性表面。在更进一步的实施方案中，作为非限制性的实例，合适的生物相容性表面包括聚合材料、多孔膜、塑料、玻璃、金属、水凝胶及其组合。在一些实施方案中，该支持物用生物相容性物质涂覆，作为非限制性的实例，该生物相容性物质包括水凝胶、蛋白质、化学品、肽、抗体、生长因子或它们的组合。在一个实施方案中，该支持物涂覆有 NovoGeItm0
[0141]在一些实施方案中，一旦完成对凝聚的多细胞聚集体的放置，就将组织培养基倒在该构建体的顶 部。在进一步的实施方案中，组织培养基进入多细胞体之间的空间，以支持多细胞体中的细胞。
[0142]在一些实施方案中，该生物打印的形式是片。在进一步的实施方案中，片是基本为平面的形式，其具有一系列合适的几何形状，作为非限制性的实例，包括平面正方形、矩形、多边形、圆形、椭圆形或不规则形状。生物打印的片具有广泛合适的尺寸。在一些实施方案中，选择尺寸以有助于特定用途，作为非限制性的实例，包括创伤修复、组织修复、组织增大、组织置换和工程化器官构建。在进一步的实施方案中，选择尺寸以有助于在特定受试者中的特定用途。例如，在一个实施方案中，生物打印出片以修复特定人类受试者的器官或组织的肌肉壁中的特定创伤或缺陷。在一些实施方案中，生物打印的片在生物打印时为至少150 μ m厚。在各个实施方案中，生物打印的片是约10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500 μ m或更厚，包括其中的增量。在进一步的各个实施方案中，生物打印的片的特征在于其长度、宽度或二者为约50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000 μ m或更多，包括其中的增量。在其它各个实施方案中，生物打印的片的特征在于其长度、宽度或二者为约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、IOOmm 或更多，包括其中的增量。在其它各个实施方案中，生物打印的片的特征在于其长度、宽度或二者为约1、2、
3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、IOOcm或更多，包括其中的增量。参见例如实施例6 (和图1)、实施例7 (和图2)、实施例9(和图3a及3b)、实施例10(和图4a及4b)。
[0143]在一些实施方案中，该生物打印的形式是管。在进一步的实施方案中，管基本是轧制板或中空圆柱体。在一些实施方案中，生物打印的管用于构建工程化的器官。在进一步的实施方案中，生物打印的管用于构建工程化的输尿管、泌尿导管、输卵管、子宫、气管、支气管、淋巴管、尿道、肠、结肠或食道。在其它实施方案中，生物打印的管用于延伸诸如食道、肠、结肠或尿道的天然管状组织的长度。在其它实施方案中，生物打印的管用于创建新的连接以充当导管或旁路，例如泌尿导管，或例如肝门十二指肠肠旁路。在进一步的实施方案中，本文所公开的管不是血管。生物打印的管具有广泛合适的尺寸。在一些实施方案中，选择尺寸以有助于特定用途，作为非限制性的实例，包括创伤修复、组织修复、组织增大、组织置换、工程化器官的构建和器官置换。在进一步的实施方案中，选择尺寸以有助于在特定受试者中的特定用途。例如，在一个实施方案中，生物打印出管以修复或置换特定人类受试者的淋巴管的特定节段。在一些实施方案中，生物打印的管的特征在于其在生物打印时具有至少150 μ m厚的管壁。在各个实施方案中，生物打印的管的壁是约10、15、20、25、30、35、
40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、50(^111或更厚，包括其中的增量。在一些实施方案中，该生物打印的管的特征在于其在生物打印时具有至少约250 μ m的内径。在各个实施方案中，生物打印的管的内径为约 50、60、70、80、90、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、600、700、800、900、100(^111或更多，包括其中的增量。在其它各个实施方案中，生物打印的管的内径为约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30mm或更多，包括其中的增量。在一些实施方案中，生物打印的管的长度为约 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、
21、22、23、24、25、26、27、28、29、30mm或更长，包括其中的增量。在其它实施方案中，生物打印的管的长度为约 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、
24、25、26、27、28、29、30cm或更长，包括其中的增量。参见例如实施例13(和图6)。
[0144]在一些实施方案中，该生物打印的形式是囊。在进一步的实施方案中，囊基本上是具有至少一个封闭端的轧制板或中空圆柱体(例如，袋子、杯子、中空体、气囊等)。在一些实施方案中，生物打印的囊用于增大、修复或置换包含肌肉的组织或器官。在进一步的实施方案中，生物打印的囊用于构建工程化的胃、膀胱、子宫或胆囊的全部或部分。生物打印的囊具有广泛合适的尺寸。在一些实施方案中，选择尺寸以有助于特定用途，作为非限制性的实例，包括创伤修复、组织修复、组织增大、组织置换、工程化器官的构建和器官置换。在进一步的实施方案中，选择尺寸以有助于在特定受试者中的特定用途。例如，在一个实施方案中，生物打印出囊以置换特定人类受试者的膀胱。在一些实施方案中，生物打印的囊的特征在于其在生物打印时具有至少150 μ m厚的壁。在各个实施方案中，生物打印的囊的壁是约 10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、50(^111或更厚，包括其中的增量。
生物墨水的融合
[0145] 在一些实施方案中，该方法包括将生物墨水融合成凝聚的细胞结构。在进一步的实施方案中，孵育促进了包含多细胞聚集体的生物墨水的融合。在进一步的实施方案中，孵育允许多细胞聚集体粘附和/或凝聚以形成组织或器官。在一些实施方案中，在细胞培养环境(例如，培养皿、细胞培养瓶、生物反应器等)中，多细胞聚集体凝聚以形成组织。在进一步的实施方案中，在具有适合于促进包括在多细胞聚集体中的细胞类型生长的条件的环境中，多细胞聚集体凝聚以形成组织。在一个实施方案中，在约37°C下，在含有约5% CO2,含有约1% -21% O2的湿润气氛中，在含有促进粘附和/或凝聚的因子和/或离子的细胞培养基的存在下，孵育多细胞聚集体。
[0146]在各个实施方案中，孵育具有任何合适的持续时间。在进一步的各个实施方案中，孵育具有约 20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180 或更多分钟的持续时间，包括其中的增量。在进一步的各个实施方案中，孵育具有约1、2、3、4、5、6、
7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、36、48 或更多小时的持续时间，包括其中的增量。在进一步的各个实施方案中，孵育具有约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、
13、14、15、16、17、18、19、20或更多天的持续时间，包括其中的增量。有几种因素影响多细胞聚集体凝聚以形成组织所需的时间，作为非限制性的实例，包括细胞类型、细胞类型的比例、培养条件和添加剂如生长因子的存在。
将细胞施加到生物打印的形式之中或之上
[0147]在一些实施方案中，该方法进一步包括将细胞施加到生物打印的形式之中或之上。许多方法和技术适合于施加细胞。在各个进一步的实施方案中，将细胞例如生物打印、喷涂、涂抹、浸涂、移植、接种、注射、分层或生物打印到形式之中或之上。例如，在一些实施方案中，施加细胞包括用细胞的悬浮液、片、单层或融合的聚集体来涂覆肌肉构建体的一个或多个表面。在各个实施方案中，涂覆该肌肉构建体的1、2、3、4个或更多个表面。
[0148]在一些实施方案中，施加细胞包括生物打印融合多细胞聚集体的附加层。在其它实施方案中，施加一层细胞包括生物打印、喷涂或喷墨细胞的溶液、悬浮液或液体浓缩物。在进一步的实施方案中，合适的细胞悬浮液包含约IxlO4至约IxlO6个细胞/μ L。在再进一步的实施方案中，合适的细胞悬浮液包含约IxlO5至约1.5x10s个细胞/yL。在进一步的实施方案中，施加细胞包括将细胞悬浮液以空间分布的液滴的形式直接分配到组织构建体的一个或多个表面上。在再进一步的实施方案中，施加细胞包括将细胞悬浮液以喷雾的形式直接分配到组织构建体的一个或多个表面上。在各个实施方案中，细胞层在构建过程中的任意时间进行施加。在一些实施方案中，生物打印之后立即(例如，最多10分钟)将一个或多个细胞层施加到平滑肌构建体的一个或多个外表面。在其它实施方案中，生物打印之后(例如，10分钟之后)施加一个或多个层。在又一些其它实施方案中，在构建体的成熟期间施加一个或多个层。
[0149]任何类型的细胞都适合于以凝聚的多细胞聚集体的形式通过生物打印进行施加。此外，任何类型的细胞都适合于以悬浮液、溶液或浓缩物的液滴的形式通过沉积进行施加，或以悬浮液、溶液或浓缩物的形式通过喷涂进行施加。在一些实施方案中，将成纤维细胞施加到平滑肌构建体的一个或多个外表面上。在其它实施方案中，将内皮细胞施加到平滑肌构建体的一个或多个外表面上。在进一步的实施方案中，将一层内皮细胞施加到平滑肌构建体的一个或多个外表面上，并且将一层成纤维细胞施加到该构建体的一个或多个独特的表面上。
[0150]实施例7说明了用凝聚的平滑肌细胞聚集体生物打印的平滑肌构建体，该平滑肌细胞聚集体进一步涂覆有由内皮细胞浓缩物(例如，1-1.5xl05个细胞/μ I)组成的第二细胞类型。实施例7的技术产生包含SMC的平滑肌构建体。参见例如图2。
[0151]实施例8说明了用凝聚的人主动脉平滑肌细胞聚集体生物打印的平滑肌构建体。进一步地，由悬浮液中的人主动脉内皮细胞组成的第二细胞类型作为2.5μ L的液滴从生物打印机分配到生物打印的平滑肌细胞层之上。
[0152]在一些实施方案中，该方法进一步包括在支持物上培养细胞层的步骤。在这类实施方案中，施加细胞在某些情况下包括放置平滑肌构建体的一个或多个表面使其与预先存在的细胞层直接接触。在进一步的实施方案中，将构建体直接生物打印到培养的细胞层或细胞单层上。生物相容性支持物上任何类型的培养细胞层都是合适的。在一些实施方案中，将多细胞聚集体生物打印到内皮细胞层上。在其它实施方案中，将多细胞聚集体生物打印到成纤维细胞层上。在进一步的实施方案中，该细胞层与生物打印的构建体的多细胞聚集体粘附和/或凝聚。
[0153]实施例9说明了与实施例8相同的构建体的构建；然而，该构建体被生物打印到支持物上，该支持物上已经预先培养了铺满的人皮肤成纤维细胞单层。实施例9的技术产生包含SMC的平滑肌构建体，其具有包含内皮细胞层和成纤维细胞层二者的附加层。参见例如图3a和3bο
用于增加工程化组织的存活力的额外步骤
[0154]在一些实施方案中，该方法进一步包括在生物打印之后但在植入之前增加工程化组织或器官的存活力的步骤。在进一步的实施方案中，这些步骤包括:通过限制材料的暂时或半永久性的网格，提供该组织或器官与营养培养基之间的直接接触。在一些实施方案中，该组织被束缚 在多孔或间隙材料中。该工程化组织的至少一些细胞直接接近营养物增加了该工程化组织的存活力。
[0155]在进一步的实施方案中，用于增加工程化组织的存活力的额外和任选的步骤包括:1)任选地在放置凝聚的多细胞聚集体之前，布置限制材料的基底层；2)任选地布置限制材料的周界；3)在限定的几何形状内生物打印该组织的细胞；和4)布置限制材料的细长体(例如，圆柱体、带状体等)，按照图案覆盖初生组织，该图案在限制材料中引入间隙，例如网格、网孔或格子。例如，参见实施例12和图5。
[0156]许多限制材料适合用于本文描述的方法中。在一些实施方案中，水凝胶是示例性的限制材料，其具有一种或多种有利的性质，包括:非附着的、生物相容的、可挤出的、可生物打印的、非细胞的、具有合适的强度以及不溶于水性条件。在一些实施方案中，适宜的水凝胶是天然聚合物。在一个实施方案中，该限制材料由NovoGel?组成。在进一步的实施方案中，合适的水凝胶包括衍生自表面活性剂多元醇的水凝胶如Pluronic F-127、胶原、透明质酸盐、纤维蛋白、藻酸盐、琼脂糖、壳聚糖、它们的衍生物或组合。在其它实施方案中，合适的水凝胶是合成聚合物。在进一步的实施方案中，合适的水凝胶包括衍生自聚(丙烯酸)或其衍生物、聚(环氧乙烷)及其共聚物、聚(乙烯醇)、聚磷腈及其组合的那些水凝胶。在各个具体实施方案中，该限制材料选自:水凝胶、NovoGel?、琼脂糖、藻酸盐、明胶、Matrigel?、透明质酸、泊洛沙姆、肽水凝胶、聚(异丙基正聚丙烯酰胺)、聚乙二醇二丙烯酸酯(PEG-DA)、甲基丙烯酸羟乙酯、聚二甲基硅氧烷、聚丙烯酰胺、聚(乳酸)、硅、丝或它们的组合。
[0157]在一些实施方案中，覆盖图案的间隙均匀地或基本均匀地围绕组织的表面分布。在其它实施方案中，该间隙不均匀地分布，从而使组织的细胞不均匀地暴露于营养物。在不均匀的实施方案中，利用对营养物的差异获取来影响组织的一种或多种性质。例如，在某些情况下，理想的是在生物打印的组织的一个表面上的细胞比在该生物打印的组织的另一表面上的细胞增殖更快。在一些实施方案中，任选地在不同的时间改变该组织的各个部分对营养物的暴露，以影响该组织向期望的终点的发育。
[0158]在一些实施方案中，在任何合适的时间除去限制材料，包括但不限于:生物打印之后立即(例如，在10分钟内)、在生物打印之后(例如，10分钟后)、在细胞基本上彼此凝聚之前、在细胞基本上彼此凝聚之后、在细胞产生细胞外基质之前、在细胞产生细胞外基质之后、恰在使用之前，等等。在各个实施方案中，通过任何合适的方法除去限制材料。例如，在一些实施方案中，将限制材料切除、从细胞上扯下、消化或溶解。
[0159]在一些实施方案中，该方法进一步包括使工程化组织在一个或多个侧面上经受由流体流动引起的剪切力的步骤。
具体的示例性实施方案
[0160]在某些实施方案中，本文公开了包含至少一个含肌细胞层的工程化组织和器官，其中该工程化组织或器官基本上由细胞材料组成并可植入脊椎动物受试者，并且其中该工程化组织或器官不是血管。在一些实施方案中，该组织或器官是囊、片或管，其中所述管不是血管。在一些实施方案中，肌肉层通过生物打印的细胞聚集体的融合而形成。在进一步的实施方案中，该肌肉层基本不含任何预形成的支架。在再进一步的实施方案中，该肌肉层不用预形成的支架成形。在一些实施方案中，该组织或器官基本上由能在生物打印后生成细胞外基质的细胞材料组成。在一些实施方案中，该肌肉层是平滑肌，并且在生物打印时为至少150 μ m厚。在进一步的实施方案中，该平滑肌层在生物打印时为至少约250 μ m。在进一步的实施方案中，该平滑肌层在生物打印时为至少约500 μ m厚。在一些实施方案中，该组织或器官进一步包含选自下组的细胞:内皮细胞、神经细胞、周细胞、成纤维细胞、组织特异性上皮细胞、软骨细胞、骨骼肌细胞、心肌细胞、骨来源的细胞、软组织来源的细胞、间皮细胞、组织特异性基质细胞、干细胞、祖细胞及其组合。在一些实施方案中，除平滑肌细胞以外的细胞被分配到该平滑肌层的至少一个表面上。在进一步的实施方案中，除平滑肌细胞以外的细胞被生物打印到该平滑肌层的至少一个表面上。在再进一步的实施方案中，该细胞选自:内皮细胞、神经细胞、周细胞、成纤维细胞、组织特异性上皮细胞、软骨细胞、骨骼肌细胞、心肌细胞、骨来源的细胞、软组织来源的细胞、间皮细胞、组织特异性基质细胞、干细胞、祖细胞及其组合。在一些实施方案中，除平滑肌细胞以外的细胞基本与生物打印该平滑肌层同时被分配到该平滑肌层上。在一些实施方案中，除平滑肌细胞以外的细胞在生物打印该平滑肌层之后被分配到该平滑肌层上。在一些实施方案中，除平滑肌细胞以外的细胞在该平滑肌层成熟期间被分配到该平滑肌层上。在一些实施方案中，除平滑肌细胞以外的细胞在该平滑肌层成熟之后被分配到该平滑肌层上。在一些实施方案中，除平滑肌细胞以外的细胞在生物打印该平滑肌层24小时以内被分配到该平滑肌层上。在一些实施方案中，除平滑肌细胞以外的细胞在生物打印该平滑肌层24小时之后被分配到该平滑肌层上。在一些实施方案中，除平滑肌细胞以外的细胞以一个或多个细胞层的形式被分配到该平滑肌层上。在一些实施方案中，除平滑肌细胞以外的细胞以小于约IOOym厚的细胞层的形式被分配到该平滑肌层上。 在其它实施方案中，除平滑肌细胞以外的细胞以大于约IOOym厚而小于约500 μ m厚的细胞层的形式被分配到该平滑肌层上。在一些实施方案中，成纤维细胞被分配到该平滑肌层之中或之上。在一些实施方案中，内皮细胞被分配到该平滑肌层之中或之上。在进一步的实施方案中，该内皮细胞是组织特异性的。在一些实施方案中，该平滑肌层基本是平面的。在进一步的实施方案中，该平面在生物打印时为至少150μπι厚。在再进一步的实施方案中，该组织是适用于创伤修复或组织增大的、包含平滑肌细胞的片或补片。在一些实施方案中，该平滑肌层为管状。在进一步的实施方案中，该管在生物打印时具有至少约150μπι的内径。在进一步的实施方案中，该管壁在生物打印时为至少150 μ m厚。在再进一步的实施方案中，该器官是输尿管或输尿管的一部分、泌尿导管或泌尿导管的一部分、膀胱或膀胱的一部分、输卵管或输卵管的一部分、子宫或子宫的一部分、气管或气管的一部分、支气管或支气管的一部分、淋巴管或淋巴管的一部分、尿道或尿道的一部分、肠或肠的一部分、结肠或结肠的一部分、食道或食道的一部分。在一些实施方案中，该管的内径和外径与相应的天然组织或器官的内径和外径基本相似。在一些实施方案中，该平滑肌层包含囊或囊的一部分。在进一步的实施方案中，该囊壁在生物打印时为至少150 μ m厚。在再进一步的实施方案中，该囊状器官是胃、膀胱、子宫、胆囊。在一些实施方案中，该囊的内外尺寸与相应的天然器官的尺寸基本相似。在一些实施方案中，生物打印出平滑肌层，其具有适合于用该工程化的可植入器官置换天然器官的尺寸。在一些实施方案中，生物打印出平滑肌层，其具有适合于用该工程化的可植入器官部分地置换天然器官的尺寸。在一些实施方案中，生物打印出平滑肌层，其具有适合于用该工程化的可植入器官部分增大天然器官的尺寸。在一些实施方案中，该包含平滑肌的管、片或囊在生物打印期间由非粘附的水凝胶限制材料所支撑。在进一步的实施方案中，生物打印后该非粘附的水凝胶限制材料仍与该包含平滑肌的管、片或囊相关联。在再进一步的实施方案中，在生物打印之后而在植入体内之前的某个时间点，该非粘附的水凝胶限制材料脱离包含平滑肌的管、片或囊。在进一步的实施方案中，非粘附性水凝胶将生物打印的细胞限制到合适的尺寸。在再进一步的实施方案中，该 非 粘附的水凝胶限制材料被配置成允许至少一些生物打印的细胞接触营养培养基。在一些实施方案中，该细胞包括成体分化细胞。在其它实施方案中，该细胞包括成体未分化细胞。在一些实施方案中，该平滑肌细胞是组织特异性的。在进一步的实施方案中，该平滑肌细胞是人主动脉平滑肌细胞或人脐静脉平滑肌细胞。在一些实施方案中，该平滑肌细胞源自人脂肪抽吸物。在一些实施方案中，该组织或器官包含源自人脂肪抽吸物的另外的非平滑肌细胞类型。在一些实施方案中，该细胞源自特定的脊椎动物受试者。在一些实施方案中，选择该细胞以模拟特定的疾病状态。在一些实施方案中，该组织或器官选自:尿道、泌尿导管、输尿管、膀胱、输卵管、子宫、气管、支气管、淋巴管、食道、胃、胆囊、小肠、大肠和结肠。
[0161]在某些实施方案中，本文公开了工程化的组织和/或器官在脊椎动物受试者中的植入，其中该组织和器官包含至少一个平滑肌层，其中该工程化的组织或器官基本上由细胞材料组成，并且其中该工程化的组织或器官不是血管。
[0162]在某些实施方案中，本文公开了制备包含平滑肌组织的可植入组织或器官的方法，该方法包括:制备包含平滑肌细胞的生物墨水；将该生物墨水生物打印成形式；并且将该生物墨水融合成凝聚的细胞结构，其中该可植入组织或器官不是血管。在一些实施方案中，该可植入组织或器官基本不含任何预形成的支架。在一些实施方案中，该平滑肌细胞分离自哺乳动物受试者的天然平滑肌组织。在一些实施方案中，该平滑肌细胞分化自祖细胞。在一些实施方案中，该平滑肌细胞由组织样品生成。在进一步的实施方案中，该组织样品是脂肪抽吸物。在一些实施方案中，该形式成熟约2小时至约10天。在进一步的实施方案中，成熟发生在一段长达4周的时间内。在一些实施方案中，该形式是片。在其它实施方案中，该形式是囊。在又一些其它实施方案中，该形式是在生物打印时内径为约0.15mm或更大的管，其中该管不是血管。在一些实施方案中，该生物墨水进一步包含选自下组的细胞:内皮细胞、神经细胞、周细胞、成纤维细胞、组织特异性上皮细胞、非血管平滑肌细胞、软骨细胞、骨骼肌细胞、心肌细胞、骨来源的细胞、软组织来源的细胞、间皮细胞、组织特异性基质细胞、干细胞、祖细胞及其组合。在一些实施方案中，该方法进一步包括将细胞生物打印、喷涂、涂抹、涂敷、浸涂、移植、接种、注射或分层到生物打印的形式之中或之上的步骤。在一些实施方案中，该方法进一步包括将细胞生物打印、喷涂、涂抹、涂敷、浸涂、移植、注射、接种或分层到凝聚的细胞结构之中或之上的步骤。在一些实施方案中，该方法进一步包括生物力学或生物化学调节生物打印的形式以使其朝目标应用方向成熟的步骤。
[0163]在某些实施方案中，本文公开了用于制备可植入的工程化器官的工程化组织，其中所述组织包含至少一个平滑肌层；其中所述至少一个平滑肌层包含具有三维几何形状的融合细胞元件，并且其中该组织不是血管。在一些实施方案中，该至少一个平滑肌层是生物打印的。在进一步的实施方案中，该组织基本不含任何预形成的支架。在一些实施方案中，该三维几何形状被非粘附性材料或模具所限制。在一些实施方案中，该组织进一步包含选自下组的细胞:内皮细胞、神经细胞、周细胞、成纤维细胞、组织特异性上皮细胞、非血管平滑肌细胞、软骨细胞、骨骼肌细胞、心肌细胞、骨来源的细胞、软组织来源的细胞、间皮细胞、组织特异性基质细胞、干细胞、祖细胞及其组合。在一些实施方案中，除平滑肌细胞以外的细胞被分配到该平滑肌层的至少一个表面上。在进一步的实施方案中，除平滑肌细胞以外的细胞被生物打印到该平滑肌层的至少一个表面上。在再进一步的实施方案中，该除平滑肌细胞以外的细胞选自:内皮细胞、神经细胞、周细胞、成纤维细胞、组织特异性上皮细胞、非血管平滑肌细胞、软骨细胞、骨骼肌细胞、心肌细胞、骨来源的细胞、软组织来源的细胞、间皮细胞、组织特异性基质细胞、干细胞、祖细胞及其组合。在一些实施方案中，该细胞层在生物打印时为至少150 μ m厚。在一些实施方案中，该组织附着到组织培养相容性表面上。在一些实施方案中，该组织适合于植入脊椎动物受试者中。在一些实施方案中，本文中公开了工程化的组织培养系统，其包含基于细胞的三维元件和暂时的或可移除的限制材料，其中该限制材料允许细胞与培养基之间直接接触。在一些实施方案中，该工程化的、基于细胞的三维元件是生物打印的。在进一步的实施方案中，该工程化的、基于细胞的三维元件不含任何预形成的支架。在一些实施方案中，该限制材料具有至少一个以下特征:基本上不粘附于细胞；是生物相容的；是可挤出的；是非细胞的；具有足够的强度，以提供对细胞的支持；和不溶于水性条件。在进一步的实施方案中，该限制材料不是塑料，不是玻璃，且不是陶瓷。在一些实施方案中，该限制材料是水凝胶。在进一步的实施方案中，该限制材料是NovoGel?。在进一步的实施方案中，该限制材料包括如下的一种或多种:琼脂糖、聚乙二醇二丙烯酸酯(PEG-DA)、透明质酸、明胶、泊洛沙姆、甲基丙烯酸羟乙酯、肽水凝胶、Matrigel?、聚二甲硅氧烷、硅、丝、聚丙烯酰胺、聚乳酸、表面活性剂多元醇和藻酸盐。在一些实施方案中，该细胞和/或限制材料的至少一种从生物打印机挤出。在进一步的实施方案中，在限制材料中存在间隙，并且其中营养培养基能够通过该间隙接触细胞。在更进一步的实施方案中，该间隙为约100μπι至约30mm宽。在一些实施方案中，该间隙围绕该结构不均匀地分布，从而使该组织的细胞不均匀地暴露于营养物。在一些实施方案中，其中该组织至少约10%的表面积暴露于适合于与营养培养基接触的间隙。在一些实施方案中，该限制材料覆盖在细胞上，作为至少一个细长的元件。在进一步的实施方案中，限制材料的细长元件具有约100μπι至约Imm的横截面厚度。在一些实施方案中，在限制材料的细长元件之间存在间隙。在一些实施方案中，当从生物打印机挤出该限制材料时，在细长元件之间留下间隙。在其它实施方案中，将至少一些限制材料从系统中除去，以提供间隙。在一些实施方案中，限制材料的细长材料是基本上平行的，并且该间隙是细长的。在一些实施方案中，限制材料的细长元件被布置在网格中。在一些实施方案中，限制材料的细长元件将该结构附着在支承面上。在一些实施方案中，该系统适合于运送。在一些实施方案中，生物打印的细胞包含以下中的至少一种:平滑肌细胞、内皮细胞、成纤维细胞和上皮细胞。在一些实施方案中，该营养培养基包含以下中的至少一种:氧(O2)、碳源、氮源、生长因子、盐、矿物质、维生素、血清、抗生素、化学品、蛋白质、核酸、药物化合物和抗体。
[0164]在某些实施方案中，本文中公开了工程化的活组织，其包含三维的包含细胞的元件，通过水凝胶固定在合适的位置，其中该水凝胶作为圆柱体或带状体被分配到所述包含细胞的元件上，在该圆柱体或带状体之间存在间隙，细胞通过该间隙接近营养物，并且其中该水凝胶可从该组织移除。
[0165]在某些实施方案中，本文中公开了用于增加工程化组织的存活力的方法，包括:通过暂时的或半永久性的网格，在该组织与营养培养基之间提供直接接触，其中该组织不含任何预形成的支架。在一些实施方案中，通过暂时的或半永久性的网格在该组织与培养基之间提供直接接触的步骤包括:将所述组织束缚在多孔或间隙材料中。在进一步的实施方案中，该孔或间隙为约100μπι至约30_宽。在进一步的实施方案中，该多孔或间隙材料是水凝胶。在更进一步的实施方案中，该多孔或间隙材料是琼脂糖。在一些实施方案中，工程化组织的存活力在体外增加。在一些实施方案中，构成工程化组织的至少部分细胞的存活力得到延长。在进一步的实施方案，该细胞的存活力延长I天或以上。在一些实施方案中，该至少一种营养物选自:碳源、氮源、生长因子、盐、矿物质、维生素、血清、抗生素、蛋白质、核酸、药物化合物和抗体。在一些实施方案中，至少一种营养物是氧(O2)。在进一步的实施方案中，该多孔或间隙水凝胶限制材料旨在提供在一个或多个表面上对营养物的暴露具有差异的生物打印的细胞。
[0166]在某些实施方案中，本文中公开了制备组织培养系统的方法，包括如下步骤:在生物相容性基质上建立包含细胞的三维元件；并分配限制材料以覆盖该包含细胞的三维元件，其中该覆盖的限制材料允许该细胞的至少一部分与生长培养基接触。
[0167] 在某些实施方案中，本文中公开了制备组织培养系统的方法，包括如下步骤:在表面上分配限制材料的周界；在该周界内分配细胞；并分配限制材料以覆盖该细胞，其中该覆盖的限制材料允许该细胞的至少一部分与生长培养基接触。在一些实施方案中，限制材料的分配是通过生物打印完成的。在一些实施方案中，该方法包括或进一步包括将该系统在合适的培养基中培养，以使生物打印的细胞构建体成熟。
实施例[0168]下面的具体实施例应解释为仅是说明性的，而不是以任何方式限制公开内容的其它部分。无需进一步详尽说明，相信本领域技术人员基于本文的描述能够最大限度地利用本发明。
实施例1一细胞培养
[0169]平滑肌细朐
[0170]将原代人主动脉平滑肌细胞(HASMC；GIBCO/Invitrogen Corp., Carlsbad, CA)在补充有10 %胎牛血清(FBS)、100U/mL青霉素、0.lmg/mL链霉素、0.25 μ g/mL两性霉素B、0.01M HEPES(均来自 Invitrogen Corp.，Carlsbad, CA)、50mg/L 脑氛酸、50mg/L 甘氛酸、20mg/L丙氨酸、50mg/L抗坏血酸和3 μ g/L CuS04(全部来自Sigma, St.Louis, MO)的低葡萄糖 Dulbecco 改良 Eagle 培养基(DMEM ；Invitrogen Corp., Carlsbad, CA)中，在 37°C和5% CO2下维持并扩充。在所有的研究中使用传代4-8代的HASMC的铺满培养物。
[0171]内皮细胞
[0172]将原代人主动脉内皮细胞(HAEC;GIBC0/Invitrogen Corp., Carlsbad, CA)在补充有10%FBS、ly g/mL氢化可的松、10ng/mL人表皮生长因子、3ng/mL碱性成纤维细胞生长因子、10 μ g/mL肝素、100U/mL青霉素、0.lmg/mL链霉素和0.25 μ g/mL两性霉素B(均来自Invitrogen Corp., Carlsbad, CA)的培养基 I" (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA)中维持并扩充。细胞在37°C和5% CO2下，在明胶(来自猪血清，Sigma, St.Louis, MO)包被的、组织培养物处理的烧瓶中 生长。在所有的研究中使用传代4-8代的HAEC的铺满培养物。
[0173]成纤维细朐
[0174]将原代人皮肤成纤维细胞(HDF；GIBC0/Invitrogen Corp., Carlsbad, CA)在补充有2 % FBS、1 μ g/mL氢化可的松、lOng/mL人表皮生长因子、3ng/mL碱性成纤维细胞生长因子、10 μ g/mL肝素、100U/mL青霉素和0.lmg/mL链霉素(均来自InvitrogenCorp., Carlsbad, CA)的培养基 106 (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA)中，在 37°C和 5% CO2下维持并扩充。在所有的研究中使用传代4-8代的HDF的铺满培养物。
[0175]来自人脂肪抽吸物的SVF的SMC样细胞
[0176]从胶原酶消化脂肪抽提物后分离的细胞的附着部分产生SMC样细胞。此消化产生了被称作基质血管组分(SVF)的一群细胞。任选地将SVF的细胞接种到标准组织培养塑料上，并通过合适的培养条件进一步选择贴壁细胞。将来自脂肪组织抽吸物的SVF的SMC样细胞在补充有10%胎牛血清(FBS)、100U/mL青霉素、0.lmg/mL链霉素、0.25 μ g/mL两性霉素 Β、0.01M HEPES(均来自 Invitrogen Corp.，Carlsbad, CA)、50mg/L 脑氛酸、50mg/L 甘氛酸、20mg/L丙氨酸、50mg/L抗坏血酸和3 μ g/L CuSO4 (均来自Sigma, St.Louis, MO)的高葡萄糖 Dulbecco 改良 Eagle 培养基(DMEM ；Invitrogen Corp., Carlsbad, CA)中，在 37°C和5% CO2下维持并扩充。在所有的研究中使用传代3-8代的SVF-SMC的铺满培养物。
[0177]来自人脂肪抽吸物的SVF的EC
[0178]将来自基质血管组分(SVF)的内皮细胞在生长培养基中维持并扩充，该培养基通常用于生长真正(bona fide)内皮细胞(EC)的原代分离物。具体而言，将SVF-EC维持在补充有10%FBS、ly g/mL氢化可的松、10ng/mL人表皮生长因子、3ng/mL碱性成纤维细胞生长因子、1(^8/11^肝素、10(^/1^青霉素和0.lmg/mL链霉素的M199中。使细胞在37°C和5%CO2下，在组织培养基处理的烧瓶中生长。在所有的研究中使用传代3-8代的SVF-EC的铺满培养物。
实施例2 — NovoGel?溶液和模具
[0179]2%矛口 4% (w/v)NovoGeI11 溶液的吿l|备
[0180]将Ig 或 2g(分别对应 2%或 4% )的 NovoGeI?(Organovo, San Diego, CA)溶于5OmL Dulbecco 憐酸盐缓冲盐水(DPBS ;Invitrogen Corp., Carlsbad, CA)中。简言之，将DPBS和NovoGel?在恒定搅拌下在加热板上加热到85°C,直至NovoGel?完全溶解。通过蒸汽灭菌法将NovoGel?溶液在125°C下灭菌25分钟。NovoGel?溶液保持于液相，只要温度维持在65.5°C以上。低于这个温度会发生相变，NovoGel?溶液的粘度增加，并且NovoGel?形成固体凝胶。
[0181]NovoGel?模具的制备
[0182]采用适配IOcm培养皿的TeflonS模具，制造用于孵育圆柱形生物墨水的NovoGel?模具。简言之，将丨erkm_模具使用70%乙醇溶液预灭菌，并使该模具经受45分钟紫外线照射。将灭菌的模具放在IOcm培养皿(VWR International LLC, WestChester, PA)的上方，并牢固地附接。将这个组装体(Teflon:?模具+培养皿)垂直保持，并将45mL预加温的无菌2% NovoGel?溶液倒入Teflon?摸具与培养皿之间的间隙。随后，将该组装体在室温下水平放置I小时，以使NovoGel?完全胶凝。在胶凝以后，取出Teflon?印制物，并用DPBS冲洗两次NovoGel?模具。然后，向NovoGel?模具加入17.5mL
的HASMC培养基，用于孵育多型圆柱形生物墨水。
实施例3 — HASMC-HAEC多型圆柱形生物墨水的制造
[0183] 为了制备多型圆柱形生物墨水，单独收集HASMC和HAEC，随后以预先确定的比例混合。简言之，从铺满的培养瓶中除去培养基，并用DPBS(lml/15cm2生长面积)冲洗细胞。通过在胰蛋白酶(lml/15cm2生长面积；Invitrogen Corp., Carlsbad, CA)存在下孵育10分钟，使细胞从培养瓶的表面上脱离。采用0.15%胰蛋白酶来分离HASMC，而采用0.1%胰蛋白酶来分离HAEC。在孵育后,将合适的培养基加入到培养瓶中(2X体积,相对于胰蛋白酶体积)。将细胞悬浮液在200g下离心6分钟，随后完全除去上清液。将细胞沉淀物重悬浮于各自的培养基中，并利用血细胞计数器计数。将适当体积的HASMC和HAEC合并，以产生含有15% HAEC和其余85% HASMC (基于总细胞群的％)的多型细胞悬浮液。将该多型细胞悬浮液在200g下离心5分钟，随后完全除去上清液。将多型细胞沉淀物重悬浮于6mL的HASMC培养基中，并转移到20mL玻璃小瓶(VWR International LLC, West Chester, PA)中，随后在定轨摇床上以150rpm在37°C和5% CO2下孵育60分钟。这使得细胞彼此聚集，并开始细胞-细胞粘附。在孵育后，将细胞悬浮液转移到15mL离心管中，并在200g下离心5分钟。在除去上清液培养基之后，将该细胞沉淀物重悬浮于400 μ I的HASMC培养基中，并用移液管上下吸取几次，以确保所有的细胞簇被打破。将细胞悬浮液转移到放置在15mL离心管中白勺 0.5mL 微量离心管(VWR International LLC, West Chester, PA)中，随后在 2000g 下离心4分钟，以形成高度致密并压紧的细胞沉淀物。将上清液培养基吸出，并通过抽吸将细胞转移到毛细管(0D1.5mm, ID0.5mm, L75mm ;Drummond Scientific C0., BroomalI, PA)中，以产生50mm长的圆柱形生物墨水。在37°C和5% CO2下，将毛细管中的细胞浆料在HASMC培养基中孵育20分钟。随后，使用随毛细管提供的柱塞，将圆柱形生物墨水从毛细管中挤出到NovoGel?模具(例如，参见实施例2)(覆盖有HASMC培养基)的凹槽中。将圆柱形生物墨水在37°C和5% CO2下孵育24小时。
实施例4一HASMC-HDF-HAEC多型圆柱形生物墨水的制作
[0184]为了制备多型圆柱形生物墨水，单独收集HASMC、HDF和HAEC，随后以预先确定的比例(例如，70:25:5的HASMC:HDF:HAEC比例)混合。简言之，从铺满的培养瓶中除去培养基，并用DPBS(lmL/10cm2生长面积)冲洗细胞。通过在胰蛋白酶(lmL/15cm2生长面积；Invitrogen Corp., Carlsbad, CA)存在下孵育10分钟,使细胞从培养瓶的表面上脱离。采用0.15%胰蛋白酶来分离HASMC和HDF，而采用0.1 %胰蛋白酶来分离HAEC。在孵育后，将合适的培养基加入到培养瓶(2X体积,相对于胰蛋白酶体积)中。将细胞悬浮液在200g下离心6分钟，随后完全除去上清液。将细胞沉淀物重悬浮于各自的培养基中，并利用血细胞计数器计数。将适当体积的HASMC、HDF和HAEC合并，以产生多型细胞悬浮液。将该多型细胞悬浮液在200g下离心5分钟，随后吸出上清液。将多型细胞沉淀物重悬浮于6mL的HASMC培养基中，并转移到20mL玻璃小管(VWR International LLC, West Chester, PA)中，随后在定轨摇床上以150rpm在37°C和5% CO2下孵育60分钟。这使得细胞彼此聚集，并开始细胞-细胞粘附。在孵育后，将细胞悬浮液转移到15mL离心管中，并在200g下离心5分钟。在除去上清液培养基之后，将细胞沉淀物重悬浮于400 μ I的HASMC培养基中，并用移液管上下吸取几次，以确保所有的细胞簇被打破。将该细胞悬浮液转移到放置在15mL离心管中白勺 0.5mL 微量离心管(VWR International LLC, West Chester, PA)中，随后在 2000g 下离心4分钟，以形成高度致密并压紧的细胞沉淀物。将上清液培养基吸出，并通过抽吸将细胞转移到毛细管(0D1.5mm, ID0.266mm, T,75mm ；Drummond Scientific C0., BroomalI, PA)中，以产生50mm长的圆柱形生物墨水。在37°C和5% CO2下，将毛细管中的细胞浆料在HASMC培养基中孵育20分钟。随后，使用 随毛细管提供的柱塞，将圆柱形生物墨水从毛细管中挤出到NovoGel?模具(覆盖有HASMC培养基)的凹槽中。将圆柱形生物墨水在37°C和5%CO2下孵育6至24小时。
实施例5 — SVF-SMC-SVF-EC多型圆柱形生物墨水的制造
[0185]为了制备多型圆柱形生物墨水，单独收集SVF-SMC和SVF-EC，随后以预先确定的比例混合。简言之，从铺满的培养瓶中除去培养基，并用DPBS(lmL/5cm2生长面积)冲洗细胞。通过在TrypLE (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA)存在下孵育5-10分钟,使细胞从培养瓶的表面上脱离。在孵育后，将合适的培养基加入到培养瓶中来猝灭酶活性。将细胞悬浮液在200g下离心6分钟，随后完全除去上清液。将细胞沉淀物重悬浮于各自的培养基中，并利用血细胞计数器计数。将适当体积的SVF-SMC和SVF-EC合并，以产生含有15% SVF-EC和其余85% SVF-SMC (基于总细胞群的％ )的多型细胞悬浮液。将多型细胞悬浮液在200g下离心5分钟，随后完全除去上清液。将多型细胞沉淀物重悬浮于6mL的SVF-SMC培养基中，并转移到20mL玻璃小管(VWR International LLC, West Chester, PA)中，随后在定轨摇床上以150印111在371:和5%0)2下孵育60分钟。这使得细胞彼此聚集，并开始细胞-细胞粘附。在孵育后，将细胞悬浮液转移到15mL离心管中，并在200g下离心5分钟。在除去上清液培养基之后，将细胞沉淀物重悬浮于400 μ I的SVF-SMC培养基中，并用移液管上下吸取几次，以确保所有的细胞簇被打破。将细胞悬浮液转移到放置在15mL离心管中的0.5mL微量离心管(VWR International LLC, West Chester, PA)中，随后在 2000g 下离心 4 分钟,以形成高度致密并压紧的细胞沉淀物。将上清液培养基吸出，并通过抽吸将细胞转移到毛细管(0D1.25mm, ID0.266mm, L75mm ;Drummond Scientific C0., BroomalI, PA)中，以产生50mm长的圆柱形生物墨水。在37°C和5% CO2下，将毛细管中的细胞浆料在SVF-SMC培养基中孵育20分钟。随后，使用随毛细管提供的柱塞，将圆柱形生物墨水从毛细管中挤出到NovoGel?模具(覆盖有SVF-SMC培养基)的凹槽中。将圆柱形生物墨水在37°C和5% CO2下孵育6至12小时。
实施例6—生物打印包含血管SMC和EC混合物的血管壁节段
[0186]利用NovoGen MMX Bioprinter? (Organovo, Inc.San Diego, CA),将血管壁构建体生物打印到预先用1.5mL2% (w/v) NovoGel?包被的6孔培养板的孔中。用人血管平滑肌细胞(SMC)和人内皮细胞(EC)的混合物(SMC:EC比例为85:15或70:30)制备细胞生物墨水圆柱体。通过将细胞沉淀物(SMC = EC)吸至内径(ID)SOOym或266μπι的玻璃微毛细管中，来产生生物墨水圆柱体。随后，将生物墨水圆柱体挤出到覆盖有合适培养基的NovoGel?模具中。在生物打印之前，将圆柱形生物墨水保持6至18小时。使用含有SMC和EC混合物的圆柱体。在这些实验中，将圆柱体内的EC分选到圆柱体的外围，导致形成由EC覆盖并含有富SMC构建体壁的构建体。该过程导致形成含有由SMC和EC覆盖物组成的壁的平滑肌构建体。使用生物打印方案将该构建体生物打印在培养孔的中心，并且向培养孔填充合适的培养基，并将构建体返回到培养箱中以供成熟和评价。生物打印后，用适量的培养基(例如，对于6孔板的I个孔是4mL)覆盖该构建体。总之，本实施例描述了血管SMC和EC用于在标准尺寸多孔组织培养板中生物打印小规模平滑肌构建体的用途。所得平滑肌构建体的特征在于一个或多个EC外层和主要包含或仅包含SMC的内壁。
实施例7—生物打印包含人血管SMC与EC覆盖物的血管壁节段 [0187]利用NovoGen MMX Bioprinter? (Organovo, Inc.San Diego, CA),将血管壁构建体生物打印到预先用1.5mL2% (w/v) NovoGel?所覆盖的6孔培养板的孔中。用人血管平滑肌细胞(SMC)制备细胞生物墨水圆柱体。通过将细胞沉淀物(SMC)吸至内径(ID)为500 μ m或266 μ m的玻璃微毛细管中来产生生物墨水。随后，将生物墨水圆柱体挤出到覆盖有合适培养基的NovoGel?模具中。在生物打印之前，将该圆柱形生物墨水保持6至18小时。将EC-浓缩物(1-1.5x10s个细胞/μ I)直接生物打印到之前生物打印的SMC结构的上方。该过程导致形成含有由SMC和EC覆盖物组成的壁的平滑肌构建体。使用生物打印方案将该构建体生物打印在培养孔的中心。生物打印后，用适量的培养基(例如，对于6孔板的I个孔是4mL)覆盖该构建体，并将其返回到培养箱中用于成熟和评价。总之，本实施例描述了血管SMC和EC用于在标准尺寸多孔组织培养板块中生物打印平滑肌构建体的用途。所得平滑肌构建体的特征在于EC的外层和主要包含或仅包含SMC的内壁。
实施例8—利用NovoGel?容纳生物打印包含用HAEC层化的HASMC的血管壁节段
[0188]使用NovoGen MMX Bioprinter?(Organovo, Inc., San Diego, CA),在 NovoGel?包
被的孔内或者直接向多孔板(例如6孔板)的(..:ormng# Transwelf?插入物上，生物打
印血管壁模拟节段。该过程包括下面三个阶段:
[0189]HASMC圆梓体的制各
[0190]对人主动脉平滑肌细胞(HASMC)的培养物进行胰蛋白酶化，之后在旋转震荡器上摇动60分钟。在摇动之后，将细胞收集、离心并吸至266或SOOym(ID)玻璃微毛细管中。最后，将细胞挤出到培养基覆盖的NovoGel?板内，并孵育至少6小时。
[0191]用HAEC层化的HASMC补片的牛物打印
[0192]就在生物打印补片(例如，节段)之前，对人主动脉内皮细胞(HAEC)培养物进行胰蛋白酶化、计数，之后以IxlO6个细胞/10 μ L培养基的工作浓度重悬浮于HAEC培养基中。将HAEC悬浮液置于将要用于对生物打印的补片进行层化的生物打印机中。在打印到多孔板的孔内的NovoGel?床上的情况下,生物打印第一层NovoGel?圆柱体。然后,在它的上方，利用NovoGel?棒来生物打印箱盒，使得内部空间为8mm长xl.25毫米宽。在上述孵育期结束时将成熟的HASMC圆柱体重新抽吸到微毛细管中，并装载到生物打印机上用于在该箱盒内打印。然后，通过生物打印机将悬浮液中的HAEC吸入干净的微毛细管中，并分配到打印的HASMC圆柱体的上方4次，接近所打印的补片的四个角。每滴的体积为2.5yL。在继续打印第三层之前，将该构建体孵育15-30分钟。最后，将第三层NovoGel?圆柱体打印在第二层的上方，以在顶部创建网格/网孔型结构。在打印到培养板的孔内部的Transwdl㈤插入物上的情况下，除去前面描述的第一层NovoGel?棒。随后，用合适的细胞培养基覆盖生物打印的构建体并进行孵育。
_3] 生物打印的构建体的成熟
[0194]将生物打印的构建体孵育I至7天，以使该构建体成熟，并为HAEC提供充足的时间，以在HASMC补片的上方形成均匀的薄单层。在某些实验中，使该三维肌细胞补片经受剪切力(即脉动流)。
实施例9一利用NovoGel?容纳向HDFa单层上生物打印包含用HAEC层化的HASMC的
血管壁节段
[0195]使用NovoGen MMX Bioprinter?(Organovo, Inc., San Diego, CA),直接向多孔板(例如6孔板)的Corning? Transwell?插入物上生物打印平滑肌构建体。该过程包括以下四个阶段:
[0196]HDFa? s 向TTranswellt?膜上的培养
[0197]以20000个细胞/cm2的密度，将人成体皮肤成纤维细胞(HDFa)接种到Transwell?,膜上,并培养至少6天。这使细胞附着、生长并变成在TransweU?膜上铺满的层。
[0198]HASMC圆梓体的制各
[0199]对人主动脉平滑肌细胞(HASMC)的培养物进行胰蛋白酶化，并在旋转震荡器上摇动60分钟。在摇动之后，将细胞收集、离心并吸到266或500 μ m(ID)玻璃微毛细管中。随后，将细胞挤出到培养基覆盖的NovoGel?板中，并孵育至少6小时。
[0200]用HAEC层化的HASMC补片的牛物打印
[0201] 就在生物打印补片(例如，节段)之前，对人主动脉内皮细胞(HAEC)培养物进行胰蛋白酶化、计数，之后以IxlO6个细胞/10 μ L培养基的工作浓度重悬浮于HAEC培养基中。将HAEC悬浮液置于将要用于对生物打印的补片进行层化的生物打印机中。完全吸出具有生长在TranswelI?膜上的HDFa’s的多孔板中的培养基，并将该板转移到生物打印机上。直接在该膜上的HDFa’s的上方，利用NovoGel?棒来生物打印箱盒，使得限定的空间为8mm长xl.25mm宽。在上述孵育期结束时将成熟的HASMC圆柱体重新抽吸到微毛细管中，并装载到生物打印机上用于在该箱盒内打印。然后，通过生物打印机将悬浮液中的HAEC吸到干净的微毛细管中，并分配到打印的HASMC圆柱体的上方4次，接近所打印的补片的四个角。每滴的体积为2.5 μ L。在继续打印顶部NovoGel?棒层之前，将该构建体孵育15-30分钟。最后，打印NovoGel?圆柱体的顶层，以创建网格/网孔型结构。随后，用合适的细胞培养基覆盖该生物打印的构建体并孵育。
[0202]生物打印的构建体的成熟
[0203]将生物打印的构建体孵育I至7天，以使该构建体成熟，并为HAEC提供充足的时间，以在HASMC补片的上方形成均匀的薄单层。
实施例10—生物打印包含HASMC和HAEC多型生物墨水的平滑肌构建体
[0204]使用NovoGen MMX Bioprinter?(Organovo, Inc., San Diego, CA),在 NovoGel?底板(100mm培养皿尺寸)上、在NovoGel?包被的孔内或者直接向多孔板(例如6孔板)的
Corning" Transweir插入物上生物打印平滑肌构建体。该过程包括以下三个阶段:
[0205]HASMC-HAEC多型牛物墨水的制各
[0206]对人主动脉平滑肌细胞(HASMC)和人主动脉内皮细胞(HAEC)的培养物进行胰蛋白酶化、计数，并以适当的量混合，以产生包含85:15或70:30比例的HASMC =HAEC的圆柱体。将该多型细胞悬浮液在旋转震荡器上摇动60分钟、收集并离心。将细胞吸入266或500 μ m(ID)玻璃微毛细管中，然后挤出到培养基覆盖的NovoGel?板内，并孵育至少6小时。
[0207]补片/三维平滑肌片的生物打印
[0208]在向多孔板的孔中或NovoGel?底板(100mm培养皿尺寸)上的NovoGel?床上打印的情况下，生物打印第一层NovoGel?圆柱体。然后,在它的上方,利用NovoGel?棒来生物打印箱盒，使得内部空间为8_长X1.25_宽。在上述孵育期结束时将成熟的多型圆柱形生物墨水重新抽吸到微毛细管中，并装载到生物打印机上用于在该箱盒内打印。最后，将第三层NovoGel?圆柱体打印在第二层的上方，其或者覆盖细胞的全部长度或者在顶部创建网格/网孔型结构。在向该板的孔内部的Transwell?插入物上打印的情况下，除去前面描述的第一层NovoGel?棒。随后，用合适的细胞培养基覆盖该生物打印的构建体并孵育，在孵育期间，挤出的生物墨水的邻接节段融合起来形成三维细胞补片。
[0209]生物打印的构建体的成熟
[0210]将包含HASMC-HAEC多型生物墨水的生物打印的构建体孵育I至7天，以使该构建体成熟，并向HAEC提供充足的时间以分选到该构建体的外围，从而产生具有包含第二细胞类型(在本实施例中是内皮细胞)的层的平滑肌构建体。在一些实验中，使该三维平滑肌补片经受剪切力(即脉动流)，以帮助HAEC分选过程。
实施例11一生物打印包含HASMC、HAEC和HDFa多型圆柱形生物墨水的血管壁节段
[0211]使用NovoGen MMX Bioprinter?(Organovo, Inc., San Diego, CA),在 NovoGel?底板(100mm培养皿尺寸)上、在NovoGel?包被的孔内或者直接向多孔板(例如6孔板)的
Coming? Transwe丨广插入物上生物打印平滑肌构建体。该过程包括以下三个阶段:
[0212]HASMC-HDFa-H AEC多型牛物墨水的制各
[0213]对HASMC、HAEC和HDFa的培养物进行胰蛋白酶化、计数，并以适当的量混合，以产生包含70:15:15比例的HASMC =HDPa =HAEC的圆柱形生物墨水。将该多型细胞悬浮液在旋转震荡器上摇动60分钟、收集并离心。将细胞吸入266或500 μ m(ID)的玻璃微毛细管中，然后挤出到培养基覆盖的NovoGel?板内，并孵育至少6小时。
[0214]补片/三维细胞片的生物打印
[0215]在向多孔板的孔中或NovoGel?底板(100mm培养皿尺寸)上的NovoGel?床上生物打印的情况下，生物打印第一层NovoGel?圆柱体。然后，在它的上方，利用NovoGel?棒来生物打印箱盒，使得内部空间为8mm长xl.25mm宽。在上述孵育期结束时将成熟的多型圆柱形生物墨水重新抽吸到微毛细管中，并装载到生物打印机上用于在该箱盒中打印。最后，将第三层NovoGel?圆柱体打印在第二层的上方，其或者覆盖细胞的全部长度或者在顶部创建网格/网孔型结构。在向该板的孔内部的TrunswdM插入物上打印的情况下，除去前面描述的第一层NovoGel?棒。随后，用合适的细胞培养基覆盖该生物打印的构建体并孵育，在孵育期间，细胞圆柱体的邻接节段融合起来形成三维细胞补片。
[0216]生物打印的构建体的成熟
[0217]将包含HASMC-HDFa-HAEC多型生物墨水的生物打印的构建体孵育I至7天，以使该构建体成熟，并向HAEC提供充足的时间来分选至该构建体的外围，从而产生具有代表其它细胞类型(在本实施例中是内皮细胞和成纤维细胞)的层的平滑肌构建体。在一些实验中，使该三维平滑肌构建体经受剪切力(即脉动流)，以帮助HAEC分选过程。
实施例12—用于空间限制构建体同时允许与培养基直接接触的水凝胶网格
[0218]利用NovoGen MMX Bioprinter?(Organovo, Inc., San Diego, CA),穿过三维平滑肌构建体的顶面的一部分来分配圆柱形水凝胶元件。该网格向生物打印的组织提供空间限制，并允许该构建体与周围培养基之间直接接触。首先，分配水凝胶基底层。其次，分配限定出8mm长xl.25mm宽的空间的水凝胶窗口。第三，在该水凝胶窗口内生物打印平滑肌生物墨水，以形成三维细胞片。并且，第四，分配水凝胶网格结构。在各个试验中，水凝胶元件的尺寸为直径约100 μ m至Imm,并且兀件之间的间距为大约100 μ m至10mm。
[0219]在一些试验中，将水凝胶元件沿着一个方向分配，以在平滑肌片的上方创建长的开放通道。在其它实验中，将水凝胶元件在多个方向上分配，以在片的上方创建开放区域的网格状图案。水凝胶由NovoGel?组成。任选地将该网格结构延长通过该结构，并延长到支持表面上，以允许施加额外的材料，从而将该结构附着到打印表面上。所得网格用来空间限制该构建体，但允许一些细胞构建体与周围的营养培养基直接接触。
实施例13—不使用合成聚合物或外源性细胞外基质来生物打印可植入管、片和囊
[0220]人平滑肌细胞(SMC)从天然SMC组织来源培养而得，或从脂肪组织的基质血管组分(SVF) 生成，并且用于生成生物墨水。该生物墨水包含自组装的细胞聚集体，直径为180-500 μ m,为球形或圆柱形的形式。将该生物墨水装载到NovoGen MMX生物打印机(Organovo, Inc., San Diego, CA)上，并用于逐层构建三维结构。在24-72小时内，生物打印的结构融合起来生成稳定的包含SMC的管或厚片。在某些情况下，引入成纤维细胞、内皮细胞或上皮细胞与SMC混合，或作为生物打印的构建体的特定层或组分。在一些实验中，在打印后施加内皮细胞或组织特异性上皮细胞的附加细胞层。在某些情况下，生物打印的构建体经历特定的生物力学或生物化学调节，以有助于构建体朝目标应用方向具体化(specification)。所得的构建体概括了人组织结构，并原位生成充足的细胞外基质，以致于它们能够作为实体组织进行处理和操作。
实施例14 一利用连续沉积生物打印的肝组织和多层棋盘格状几何形状
[0221]使用NovoGen MMX Bioprinter?(Organovo, Inc., San Diego, CA),利用连续沉积机理来生物打印工程化的肝组织。该肝组织的三维结构是基于以平面几何形状重复的功能单元，在这种情况下是六边形。该生物墨水由包封在挤出化合物(表面活性剂多元醇-PF-127)中的肝星形细胞和内皮细胞组成。
[0222]30% PF-127 的制各
[0223]利用PBS制备30%PF_127溶液(w/w)。利用保持在4°C下的磁力搅拌板，将PF-127粉末与冷却的PBS混合。完全溶解发生在大约48小时内。
[0224]细朐制各和牛物打印
[0225]将由82%肝星形细胞(SC)和18%人主动脉内皮细胞(HAEC)和人成体皮肤成纤维细胞(HDFa)组成的细胞悬浮液分到15mL管中，以便获得三个细胞浓度:50xl06个细胞/mL、100xl06个细胞/mL和200xl06个细胞/mL，接着进行离心。将每个细胞沉淀物重悬浮于30% PF-127中，并抽吸到生物打印机使用的3cc储存器中。采用510 μ m分配末端，将包封的细胞生物打印到PDMS底板上成为单一六边形(参见图7A)或六边形棋盘格状结构(参见图7B)。每个构建体接纳大约200 μ L的培养基，并在室温下孵育20分钟，以评价构建体的完整性。
[0226]多层牛物打印
[0227]对于六边形棋盘格状实验，生物打印高达(4个)连续层，结果形成具有更多细胞材料存在的更高结构。制作后，每个构建体最初接纳大约200 μ L的完全培养基，以评价构建体的完整性。将构建体在室温下孵育20分钟，之后浸入到20mL的完全培养基中。
[0228]结果
[0229]在含有10%胎牛血清的生长培养基(它溶解PF127)中培养18小时后，在生物打印的几何形状内含有的细胞彼此凝聚，足以产生组织的完整的组织邻接片，其保持了原始设计的几何图案(参见图7D)。图8中所示的是:在10%中性缓冲福尔马林中固定后，棋盘格状构建体的单个节段的H&E染色。发现细胞是活的、完整的，并且局限于它们原始打印的几何形状。
实施例15—多层生物打印的组织补片中的平面几何形状
[0230]如前所述使生物墨水形成圆柱形的、稳定的细胞聚集体，通常直径为250μπι或500 μ m。简而言之，细胞在典型的实验室条件下增殖，当细胞达到70% -80%汇合时，通过施加不含EDTA的0.1 %胰蛋白酶使它们从细胞培养表面脱离。胰蛋白酶化之后，细胞在含血清的培养基中洗涤一次、收集、计数并离心，以形成大细胞沉淀物。将细胞沉淀物或者抽吸到毛细管中生成均一的(即，单型的)生物墨水，或者重悬浮以创建使用者定义的细胞混合物(参见下面的表1)，产生异质的(即，多型的)复合生物墨水混合物。参见例如图9。以这种方式创建的生物墨水圆柱体任选地直接用于生物打印管状构建体。
[0231]表1
【权利要求】
1.一种包含一个或多个层的、活的三维工程化组织或器官，所述一个或多个层的特征在于以下的一项或多项:a)使用时基本无支架；和《生物打印的，所述一个或多个层适合于在充分成熟后植入脊椎动物受试者中；条件是所述工程化组织或器官的至少一个层包含肌细胞，并且所述工程化组织或器官不是血管。
2.如权利要求1所述的组织或器官，其中至少一个层包含多种细胞类型，所述细胞类型相对于彼此空间排列从而构建平面几何形状。
3.如权利要求2所述的组织或器官，其中至少一个层在制作时在其最小维度上为至少100 μ m 厚。
4.如权利要求1所述的组织或器官，其包含多个层，至少一个层在组成上或结构上与至少一个其它层不同，以构建层状几何形状。
5.如权利要求4所述的组织或器官，其中至少一个层在制作时在其最小维度上为至少100 μ m 厚。
6.如权利要求1所述的组织或器官，其中所述组织或器官是囊、片或管，其中所述管不是血管。
7.如权利要求1所述的组织或器官，其中所述组织或器官在使用时基本不含任何预形成的支架。
8.如权利要求1所述的组织或器官，其中所述组织或器官是生物打印的。
9.如权利要求1所述的组织或器官，其中所述一个或多个层生成细胞外基质。
10.如权利要求1所述的组织或器官，其中所述肌细胞是平滑肌细胞。
11.如权利要求1所述的组织或器官，其中所述肌细胞是骨骼肌细胞。
12.如权利要求1所述的组织或器官，其中所述肌细胞是心肌细胞。
13.如权利要求1所述的组织或器官，其中所述肌细胞来源于能够分化成肌细胞的干细胞或祖细胞。
14.如权利要求13所述的组织或器官，其中所述干细胞或祖细胞在制作之前、期间或之后分化成肌细胞。
15.如权利要求1所述的组织或器官，其进一步包含选自以下的细胞:内皮细胞、神经细胞、周细胞、成纤维细胞、组织特异性上皮细胞、软骨细胞、骨骼肌细胞、心肌细胞、骨来源的细胞、软组织来源的细胞、间皮细胞、组织特异性基质细胞、干细胞、祖细胞、内胚层来源的细胞、外胚层来源的细胞、中胚层来源的细胞及其组合。
16.如权利要求1所述的组织或器官，其中除肌细胞以外的细胞被分配到所述一个或多个层的至少一个表面上。
17.如权利要求16所述的组织或器官，其中除肌细胞以外的细胞被生物打印到所述一个或多个层的至少一个表面上。
18.如权利要求16所述的组织或器官，其中所述除肌细胞以外的细胞基本在所述一个或多个层制作的同时、在所述一个或多个层制作之后、在所述一个或多个层成熟期间或在所述一个或多个层成熟之后被分配到所述一个或多个层上。
19.如权利要求16所述的组织或器官，其中除肌细胞以外的细胞作为约I至约20个细胞厚的细胞层被分配到所述一个或多个层上。
20.如权利要求1所述的组织或器官，其中所述一个或多个层基本上是平面的。
21.如权利要求20所述的组织或器官，其中所述组织或器官是适用于创伤修复、组织置换或组织增大的含肌细胞的片或补片。
22.如权利要求1所述的组织或器官，其中所述一个或多个层基本上是管状的。
23.如权利要求22所述的组织或器官，其中所述组织或器官是输尿管、泌尿导管、肝门十二指肠肠导管、输卵管、子宫、气管、支气管、淋巴管、尿道、肠、结肠、食道或其一部分。
24.如权利要求1所述的组织或器官，其中所述一个或多个层基本上是囊。
25.如权利要求24所述的组织或器官，其中所述组织或器官是胃、膀胱、子宫或胆囊或其一部分。
26.如权利要求1所述的组织或器官，其中所述组织或器官选自:尿道、泌尿导管、肝门十二指肠肠导管、输尿管、膀胱、输卵管、子宫、气管、支气管、淋巴管、食道、胃、胆囊、肠和结肠。
27.如权利要求1所述的组织或器官在脊椎动物中的植入。
28.如权利要求1所述的组织或器官为了研究用途在培养物中的维持。
29.一种用于制备包含含肌细胞层的可植入组织或器官的方法，该方法包括: a.将包含肌细胞的生物墨水生物打印成形式；和 b.将所述生物墨水融合成凝聚的细胞结构； 条件是所述组织或器官能植入到脊椎动物受试者中，并且不是血管。
30.如权利要求29所述的方法，其中所述可植入的组织或器官在使用时基本不含任何预形成的支架。
31.如权利要求29所述的方法，其中所述肌细胞是平滑肌细胞。
32.如权利要求29所述的方法，其中所述肌细胞是骨骼肌细胞。
33.如权利要求29所述的方法，其中所述肌细胞是心肌细胞。
34.如权利要求29所述的方法，其中所述肌细胞分化自祖细胞。
35.如权利要求29所述的方法，其中所述肌细胞由组织样品产生。
36.如权利要求35所述的方法，其中所述组织样品是脂肪抽吸物。
37.如权利要求29所述的方法，其中所述形式是囊或片。
38.如权利要求29所述的方法，其中所述形式是在生物打印时内径为约0.15mm或更大的管，其中所述管不打算用作血管旁路移植物或动脉-静脉分流物。
39.如权利要求29所述的方法，其中所述生物墨水进一步包含选自以下的细胞:内皮细胞、神经细胞、周细胞、成纤维细胞、组织特异性上皮细胞、软骨细胞、骨骼肌细胞、心肌细胞、骨来源的细胞、软组织来源的细胞、间皮细胞、组织特异性基质细胞、干细胞、祖细胞、内胚层来源的细胞、外胚层来源的细胞、中胚层来源的细胞及其组合。
40.如权利要求29所述的方法，其进一步包括将权利要求39的细胞生物打印、喷涂、涂抹、涂敷、浸涂、移植、接种、注射或分层到权利要求29的生物打印的形式之中或之上的步骤。
41.如权利要求29所述的方法，其进一步包括将权利要求39的细胞生物打印、喷涂、涂抹、涂敷、浸涂、移植、注射、接种或分层到权利要求29的凝聚的细胞结构之中或之上。
42.一种包含一个或多个层的、活的三维工程化组织或器官，所述一个或多个层的特征在于以下的一项或多项:a)使用时基本无支架；和《生物打印的，所述一个或多个层成熟到针对脊椎动物受试者的植入就绪状态；所述工程化组织或器官基本上由细胞材料组成；条件是所述工程化组织或器官的至少一个层包含肌细胞，并且所述工程化组织或器官不是血管。
43.如权利要求42所述的组织或器官，其中至少一个层包含多种细胞类型，所述细胞类型相对于彼此空间排列从而构建平面几何形状。
44.如权利要求43所述的组织或器官，其中至少一个层在制作时在其最小维度上为至少100 μ m厚。
45.如权利要求42所述的组织或器官，其包含多个层，至少一个层在组成上或结构上与至少一个其它层不同，以构建层状的几何形状。
46.如权利要求45所 述的组织或器官，其中至少一个层在制作时在其最小维度上为至少100 μ m厚。
47.如权利要求42所述的组织或器官，其中所述组织或器官是囊、片或管，其中所述管不是血管。
48.如权利要求42所述的组织或器官，其中所述肌细胞是平滑肌细胞。
49.如权利要求42所述的组织或器官，其中所述肌细胞是骨骼肌细胞。
50.如权利要求42所述的组织或器官，其中所述肌细胞是心肌细胞。
51.如权利要求42所述的组织或器官，其进一步包含选自以下的细胞:内皮细胞、神经细胞、周细胞、成纤维细胞、组织特异性上皮细胞、软骨细胞、骨骼肌细胞、心肌细胞、骨来源的细胞、软组织来源的细胞、间皮细胞、组织特异性基质细胞、干细胞、祖细胞、内胚层来源的细胞、外胚层来源的细胞、中胚层来源的细胞及其组合。
52.如权利要求51所述的组织或器官，其中细胞被分配到所述至少一个层的至少一个表面上。
53.如权利要求52所述的组织或器官，其中细胞被生物打印到所述至少一个层的至少一个表面上。
54.如权利要求42所述的组织或器官在脊椎动物中的植入。
55.如权利要求42所述的组织或器官为了研究用途在培养物中的维持。
【文档编号】A61L27/54GK103930066SQ201280055554
【公开日】2014年7月16日 申请日期:2012年9月12日 优先权日:2011年9月12日
【发明者】基思·墨菲, 奇拉格·卡蒂瓦拉, 斯科特·多尔夫曼, 本杰明·谢佛德, 莎伦·普雷斯内尔 申请人:奥加诺沃公司