一种利用器官培养以增加成年神经组织中神经干细胞收获率的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物技术领域，尤其是一种利用器官培养以增加成年神经组织中神经干细胞收获率的方法。
【背景技术】
[0002]神经干细胞(neural stem cell，NSC)是可以分化成为任何一种神经细胞的多潜能干细胞。神经前体细胞(neural precursor cell，NPC)是初步分化的神经干细胞，只能分化成神经元。这两种细胞通常都被称为神经干细胞，在本发明中沿袭此称法，以求简洁。
[0003]主要源于本世纪的研宄结果表明:神经干细胞(neural stem cell，NSC)和神经前体细胞(neural precursor cell，NPC)不只存在于人的胚胎发育期，而且也有少量存在于成人的部分脑区和脊髓的中心部位。这些神经干细胞可以被从捐献的尸体中提取出来用于科学研宄和临床治疗。
[0004]现有技术是直接对成年的神经组织进行胰酶或木瓜蛋白酶消化，然后经过机械吹打使得组织分散。但是，由于成年神经组织含有大量的纤维为主的结缔组织成分，以及细胞间的紧密连接，都造成组织结构远比胚胎组织坚硬，使得酶消化作用差，进而机械吹打时组织不易分散，造成组织分散不完全和强力分散严重损伤细胞，因此获得的活细胞量极少(low yield)。
[0005]现有技术中存在因成年神经组织坚硬，酶消化作用差而导致的的活细胞获得率极低的技术难题，因此亟需一种新的方法来解决该技术难题。
[0006]通过检索，尚未发现与本发明专利申请相关的专利公开文献。
【发明内容】
[0007]本发明的目的克服现有技术的不足之处，提供一种方法简单、操作方便、获得率极高的利用器官培养以增加成年神经组织中神经干细胞收获率的方法。
[0008]为了实现上述目的，本发明所采用的的技术方案如下:
[0009]一种利用器官培养以增加成年神经组织中神经干细胞收获率的方法，所述方法包括器官培养和细胞培养两部分，所有操作都在无菌操作台里完成，具体步骤如下:
[0010]⑴器官培养:
[0011]解剖取材个人供体脊髓或脑区，横切断脊髓为2-3mm厚，然后进一步解剖显微镜下将神经组织切成2-3立方毫米的组织块，加磷酸缓冲盐水(PBS)清洗三次，然后转移到未涂覆的塑料平皿中，在37°C，5% 0)2水套式二氧化碳培养箱里培养7天，即得培养后神经组织；
[0012]其中，培养基的组成是DMEM和DMEM/F12加N2添加剂和B27添加剂，其中，DMHM和DMEM/F 12的质量比为1:1，培养基还包含10 μM N-乙酰半胱氨酸，10ng/ml碱性成纤维细胞生长因子和20ng/ml表皮生长因子，每两天作四分之三总培养基的换液；
[0013]⑵木瓜蛋白酶消化、吹打分散、贴壁分散细胞培养
[0014]①DMEM洗涤培养后神经组织一次，在10单位/毫升木瓜蛋白酶溶液中，37°C消化45分钟；
[0015]②加入4毫克/ml DNA酶后用吸管轻轻地吹打5_7次以分散组织；
[0016]③1000-2000转/分钟离心5_10分钟，加磷酸缓冲盐溶液清洗三次后，接种在多聚鸟氨酸被覆的细胞培养板中，在37°C，5% CO2水套式二氧化碳培养箱里培养，培养基的组成与上述器官培养的培养基相同；
[0017]④四小时后，当活细胞已经贴附在培养板上时，吸除所有培养基，包括细胞碎片，并清洗一遍后，加入新鲜培养基继续培养；
[0018]⑤每两天作总量四分之三培养基的换液，直至细胞长满培养板时，即得成年神经组织中神经干细胞。
[0019]而且，所述步骤⑵③中为在1000转/分钟离心5分钟。
[0020]本发明的优点和积极效果是:
[0021]1、本发明采取先将剪碎的成年神经组织在体外培养(称作器官培养，organotypicculture)，七天之后再进行木瓜蛋白酶消化和吹打分散，结果获得的活细胞量要高于直接酶消化的三倍以上(high yield)，这种促进的主要原因在于器官培养过程中结缔组织大量降解，明显地软化了组织，使得酶消化和吹打分散都更加容易和彻底；另外一个参与因素是神经干细胞在器官培养过程中大量的增殖，从而增加了干细胞的总数；本发明的另一个技术改进是在分散组织之后直接将细胞接种在多聚鸟氨酸(PLO)被覆的细胞培养板中，数小时后通过更换培养液来去除组织残渣(包括细胞碎片)，这样做就不经过梯度离心的费时繁琐步骤，也免除了大多数梯度离心溶液所带来的细胞毒性。
[0022]2、本发明方法较之于传统的直接使用木瓜蛋白酶消化所获得的活细胞量要高三倍以上，因为成人神经组织只含有很少量的神经干细胞，故而高收获率就更为关键，该方法可以应用于脑组织或脊髓组织。
【附图说明】
[0023]图1为本发明方法的操作工艺流程图；
[0024]图2为本发明方法和传统直接消化法的神经干细胞收获率的对比图。
【具体实施方式】
[0025]下面结合实施例，对本发明进一步说明；下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
[0026]本发明中所使用的试剂，如无特殊规定，均为本领域内常用试剂；本发明中所使用的方法，如无特殊规定，均为本领域内常用的方法。
[0027]本发明的原理如下:
[0028]本发明采取先将剪碎的成年神经组织在体外培养(称作器官培养，organotypicculture)，七天之后再进行木瓜蛋白酶消化和吹打分散。结果获得的活细胞量要高于直接酶消化的三倍以上(high yield)。这种促进的主要原因在于器官培养过程中结缔组织大量降解，明显地软化了组织，使得酶消化和吹打分散都更加容易和彻底。另外一个参与因素是神经干细胞在器官培养过程中大量的增殖，从而增加了干细胞的总数。本发明的另一个技术改进是在分散组织之后直接将细胞接种在多聚鸟氨酸(PLO)被覆的细胞培养板中。数小时后通过更换培养液来去除组织残渣(包括细胞碎片)。这样做就不经过梯度离心的费时繁琐步骤，也免除了大多数梯度离心溶液所带来的细胞毒性。
[0029]一种利用器官培养以增加成年神经组织中神经干细胞收获率的方法，所述方法包括器官培