融合蛋白IFN-ELP及其应用的制作方法

本发明属于生物医药领域，具体涉及融合蛋白IFN-ELP及其应用。
背景技术：
：干扰素-α2(IFN-α2)具有抗病毒复制、抗肿瘤增殖和免疫调节作用，已被成功用于治疗病毒性疾病(如乙型肝炎、丙型肝炎、尖锐湿疣等)和相关癌症(如白血病、肾癌、恶性黑色素瘤、多发性硬化症等)。但是，IFN经系统注射给药后容易被体内蛋白酶降解和肾排出，循环半衰期非常短，需要频繁给药以维持较高的血药浓度，从而导致严重毒副作用，同时给患者带来沉重的经济负担。用聚乙二醇(PEG)修饰IFN-α2，能有效改善其药代动力学，改善药物分布，提高其疗效。然而，目前的PEG化干扰素存在如反应产率低、结合位点和偶联化学计量难以控制、生物活性严重降低等弊端。现有技术中通过融合人血清白蛋白能够有效延长干扰素循环半衰期并有效控制修饰位点，但活性保持仅有1％，且临床试验效果并不明显。因此，研发反应条件温和、步骤简单、快速、高效的位点特异性修饰方法对干扰素及其他药用蛋白质尤为重要。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题是如何使蛋白质药物在生物体内的半衰期延长和/或活性保持率增加。为解决上述问题，本发明首先提供了一种融合蛋白，所述融合蛋白是如下b1)或b2)的蛋白质：b1)含有功能蛋白和弹性蛋白样多肽的融合蛋白；所述弹性蛋白样多肽，可为如下a1)—a8)中的任一种：a1)具有一个以上单拷贝乙的多肽，每个单拷贝乙中具有一个以上单拷贝甲；所述单拷贝甲的氨基酸序列为XGVPG，X代表一个脯氨酸残基以外的任意氨基酸残基；a2)所述a1)中，每个单拷贝乙中具有10个所述单拷贝甲；a3)所述a2)中，所述单拷贝乙如序列表序列2的第202位至第251位所示；a4)所述a1)中，所述弹性蛋白样多肽具有9个所述单拷贝乙；a5)所述a4)中，每个单拷贝乙中具有10个所述单拷贝甲；a6)所述a5)中，所述单拷贝乙如序列表序列2的第202位至第251位所示；a7)所述a6)中，所述弹性蛋白样多肽如序列表序列2的第202位至第651位所示；a8)所述a6)中，所述弹性蛋白样多肽如序列表序列2的第202位至第653位所示；b2)将b1)的N端或C端连接标签得到的带标签蛋白质。上述任一所述功能蛋白可为如下c1)-c20)中的任一种：c1)干扰素-α2；c2)序列表的序列2第1位至第166位所示的干扰素-α2；c3)干扰素-α；c4)干扰素；c5)胰高血糖素样肽-1及其衍生物；c6)水蛭素；c7)胰岛素；c8)单克隆抗体；c9)血液因子；c10)生长激素；c11)白介素；c12)生长因子；c13)治疗性疫苗；c14)降钙素；c15)肿瘤坏死因子；c16)酶；c17)选自医药、农业、科研以及其它工业领域相关的蛋白、小肽或抗体；c18)集落刺激因子；c19)瘦素；c20)c1)-c19)任一所述功能蛋白经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由其衍生的功能蛋白。上述任一所述融合蛋白中，所述弹性蛋白样多肽和所述功能蛋白的位置关系可为如下d1)、d2)或d3)：d1)所述弹性蛋白样多肽位于所述功能蛋白的上游或下游；d2)所述弹性蛋白样多肽融合于所述功能蛋白的C末端或N末端；d3)所述弹性蛋白样多肽插入所述功能蛋白中；所述弹性蛋白样多肽的插入位点可为远离所述功能蛋白的活性位点的位置或不干扰所述功能蛋白的活性位点的位置。上述任一所述融合蛋白中，所述融合蛋白的氨基酸序列如序列表序列2的第1位至第651位或序列表序列2的第1位至第653位所示。上述任一所述融合蛋白在制备产品中的应用也属于本发明的保护范围；所述产品的功能为抑制肿瘤细胞增殖和/或治疗肿瘤。所述抑制肿瘤细胞增殖具体可为抑制人Burkitt’sB淋巴瘤细胞和/或人卵巢癌细胞(OVCAR-3)增殖。所述治疗肿瘤可为治疗由人Burkitt’sB淋巴瘤细胞和/或人卵巢癌细胞(OVCAR-3)引起的肿瘤。本发明还提供了一种产品，所述产品的活性成分为上述任一所述融合蛋白。编码上述任一所述融合蛋白的核酸分子也属于本发明的保护范围。所述产品可为药物。所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。上述核酸分子中，编码所述干扰素-α2的核苷酸序列可如序列表序列1的第5209位至第5706位所示；编码所述弹性蛋白样多肽的核苷酸序列可如序列表序列1的第5812位至第7161位或序列表序列1的第5812位至第7167位或序列表序列1的第5812位至第5961位所示。上述核酸分子中，所述核酸分子可为如下e1)-e10)任一所示的DNA分子：e1)核苷酸序列含有序列表的序列1第5812位至第7161位所示的DNA分子；e2)核苷酸序列含有序列表的序列1第5812位至第7167位所示的DNA分子；e3)核苷酸序列含有序列表的序列1第5812位至第5961位所示的DNA分子；e4)核苷酸序列含有序列表的序列1第5209位至第5706位和序列表序列1的第5812位至第7161位所示的DNA分子；e5)核苷酸序列含有序列表的序列1第5209位至第5706位和序列表序列1的第5812位至第7167位所示的DNA分子；e6)核苷酸序列含有序列表的序列1第5209位至第5706位和序列表序列1的第5812位至第5961位所示的DNA分子；e7)核苷酸序列可如序列表的序列1第5209位至第7161位所示的DNA分子；e8)核苷酸序列可如序列表的序列1第5209位至第7167位所示的DNA分子；e9)与e1)-e8)中任一限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述融合蛋白的DNA分子；e10)在严格条件下与e1)-e8)中任一限定的核苷酸序列杂交，且编码所述融合蛋白的DNA分子。含有上述任一所述核酸分子的表达盒、表达载体、重组微生物或转基因细胞系也属于本 发明的保护范围。本发明还提供了一种制备半衰期延长和/或生物活性保持率增加的蛋白质药物的方法。本发明所提供的制备半衰期延长和/或生物活性保持率增加的蛋白质药物的方法，包括如下步骤：在功能蛋白中引入弹性蛋白样多肽，得到半衰期延长和/或生物活性保持率增加的蛋白质药物；所述弹性蛋白样多肽可融合于所述功能蛋白的C末端或N末端，或所述弹性蛋白样多肽位于所述功能蛋白的上游或下游，或所述弹性蛋白样多肽插入所述功能蛋白中；所述弹性蛋白样多肽的插入位点可为远离所述功能蛋白的活性位点的位置或不干扰所述功能蛋白的活性位点的位置；上述方法中，所述弹性蛋白样多肽，是如下a1)—a8)中的任一种：a1)具有一个以上单拷贝乙的多肽，每个单拷贝乙中具有一个以上单拷贝甲；所述单拷贝甲的氨基酸序列为XGVPG，X代表一个脯氨酸以外的任意氨基酸残基；a2)所述a1)中，每个单拷贝乙中具有10个所述单拷贝甲；a3)所述a2)中，所述单拷贝乙如序列表序列2的第202位至第251位所示；a4)所述a1)中，所述弹性蛋白样多肽具有9个所述单拷贝乙；a5)所述a4)中，每个单拷贝乙中具有10个所述单拷贝甲；a6)所述a5)中，所述单拷贝乙如序列表序列2的第202位至第251位所示；a7)所述a6)中，所述弹性蛋白样多肽如序列表序列2的第1位至第651位所示；a8)所述a6)中，所述弹性蛋白样多肽如序列表序列2的第1位至第653位所示。上述方法中，所述功能蛋白是如下c1)-c20)中的任一种：c1)干扰素-α2；c2)序列表序列2的第1位至第166位所示的干扰素-α2；c3)干扰素-α；c4)干扰素；c5)胰高血糖素样肽-1及其衍生物；c6)水蛭素；c7)胰岛素；c8)单克隆抗体；c9)血液因子；c10)生长激素；c11)白介素；c12)生长因子；c13)治疗性疫苗；c14)降钙素；c15)肿瘤坏死因子；c16)酶；c17)选自医药、农业、科研以及其它工业领域相关的蛋白、小肽或抗体；c18)集落刺激因子；c19)瘦素；c20)c1)-c19)任一所述功能蛋白经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由其衍生的功能蛋白。上述任一所述干扰素可为干扰素α、干扰素β、干扰素γ或干扰素λ。实验证明，以本发明所提供的融合蛋白IFN-ELP作为蛋白质药物，可使生物活性保持率增加、体内半衰期延长、体内平均存留时间延长，并有效抑制肿瘤。同时，本发明所提供的一种制备半衰期延长和/或生物活性保持率增加的蛋白质药物的方法为修饰蛋白药物以提高药物稳定性、改善药物代谢动力学和增强治疗功效的新方法。附图说明图1为反相转变循环技术(Inversetransitioncycling，ITC)纯化原理。图2显示了通过ITC纯化获得IFN-ELP。图3为ELP合成及纯化过程。图4为IFN合成及纯化过程。图5为MALDI-TOF分析IFN-ELP和IFN的分子量。图6为DLS分析IFN-ELP和IFN的水合半径。图7为酶标仪分析IFN-ELP和ELP的相转变温度测定。图8为CD分析IFN-ELP和IFN的二级结构。图9为MTT法测定IFN-ELP和IFN的体外生物活性。图10为利用DAS软件中房室消除模型分析IFN-ELP和IFN的药物代谢动力学参数。图11为IFN-ELP和IFN在组织中的分布情况。图12为IFN-ELP、ELP和IFN抑制肿瘤生长情况。图13为裸鼠注射IFN-ELP、ELP、IFN或生理盐水后的生存曲线。图14为裸鼠注射IFN-ELP、ELP、IFN或生理盐水后的肿瘤生长实物图。图15为裸鼠注射IFN-ELP、ELP、IFN或生理盐水后的体重变化情况。图16为裸鼠注射IFN-ELP、ELP、IFN或生理盐水后乳酸脱氢酶、肌酸激酶同工酶、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、肌酐和尿素氮等生理指标变化情况。图17为裸鼠注射IFN-ELP、ELP、IFN或生理盐水后红细胞、白细胞、血红蛋白和血小板等生理指标变化情况。具体实施方式下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中的质粒pET-25b(+)为生工生物工程(上海)股份有限公司产品。下述实施例中的TB培养基按照如下方法配置：向900mL水中加入蛋白胨12g、酵母提取物24g和甘油4mL，充分溶解后121℃高压灭菌15min，灭菌后的混合液冷却至60℃，然后加入100mL灭菌的含170mmol/LKH2PO4和0.72mol/LK2HPO4的水溶液。下述实施例中的人Burkitt’sB淋巴瘤细胞和人卵巢癌细胞(OVCAR-3)均购自中国科学院肿瘤细胞库。下述实施例中的RMPI-1640培养基为Gibco公司产品。下述实施例中的雄性SD大鼠为北京维通利华实验动物技术有限公司产品。雄性SD大鼠在下文中简称大鼠。下述实施例中的雌性无胸腺(Nude)裸鼠为北京维通利华实验动物技术有限公司产品。雌性无胸腺(Nude)裸鼠在下文中简称裸鼠。下述实施例中，通过反相转变循环技术(Inversetransitioncycling,ITC)提纯获得纯化的IFN-ELP。利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF)、酶标仪、动态光散射(DLS)、圆二色谱(CD)等分析手段表征IFN-ELP和IFN的分子量、相变温度、水合半径和二级结构等物理化学性能。选用人Burkitt’sB淋巴瘤细胞，测试IFN-ELP和IFN的体外生物活性，即其体外抗肿瘤细胞增殖的能力；使用大鼠模型，测试IFN-ELP和IFN在体内的药物代谢动力学，利用DAS3.0药物代谢动力学分析软件计算出药物代谢动力学参数；建立裸鼠肿瘤模型，测试IFN-ELP和IFN的抗肿瘤效果和药物分布。下述实施例中的定量实验，如无特殊说明均设置三次重复，结果取平均值。实施例1、IFN-ELP和转肽酶Sortase的原核表达和纯化一、重组质粒pET-25b-IFN-ELP的制备人工合成重组质粒pET-25b-IFN-ELP(双链环形质粒)。重组质粒pET-25b-IFN-ELP的核苷酸序列如序列表序列1所示。重组质粒pET-25b-IFN-ELP中具有一个表达盒A。表达盒A的核苷酸序列如序列表序列1的自5’末端第5121至7314位所示，其中自5’末端第5121至5140位为T7启动子，第5209至5706位为干扰素-α2的编码基因，第5728 至5745位为转肽酶A的识别区域，第5812至7161位为弹性蛋白样多肽的编码基因，第7265至7314位为T7终止子。干扰素-α2在下文中简称IFN。弹性蛋白样多肽在下文中简称ELP。表达盒A表达的蛋白为IFN-ELP，在下文中简称IFN-ELP。IFN的氨基酸序列如序列表序列2的第1位至第166位所示。ELP的氨基酸序列如序列表序列2的第202位至第651位所示。IFN-ELP的氨基酸序列如序列表序列2的第1位至第651位所示。二、重组质粒pET-25b-Sortase的制备人工合成序列表序列3所示的DNA分子，编码序列表序列4所示的转肽酶Sortase。将pET-25b(+)的NdeI识别序列和EcoRI识别序列间的DNA替换为序列表的序列3所示的双链DNA分子，保持pET-25b(+)的其它序列不变，得到重组质粒pET-25b-Sortase。重组质粒pET-25b-Sortase表达序列表序列4所示的转肽酶Sortase。转肽酶Sortase在下文中简称为SrtA。三、蛋白的表达和纯化1、ELP-ELP的表达和纯化将重组质粒pET-25b-IFN-ELP导入大肠杆菌感受态Rosetta-gami(DE3)pLysS(Novagen公司产品)，得到含有pET-25b-IFN-ELP的重组大肠杆菌，将该重组大肠杆菌命名为Rosetta/pET-25b-IFN-ELP。按照下述步骤进行ELP-ELP的表达和纯化：(1)将Rosetta/pET-25b-IFN-ELP单克隆接种于50mL含100μg/mL氨苄青霉素的TB培养基，37℃、250rpm振荡培养8小时得到培养菌液1；将培养菌液1以1：20(体积比)接种到1L含100μg/mL氨苄青霉素的TB培养基中，200rpm振荡培养5h，得到培养菌液2；向培养菌液2中加入IPTG，使IPTG在体系中的浓度为0.4mmol/L，18℃、200rpm振荡培养16h，得到培养菌液3。(2)将上述步骤(1)得到的培养菌液3收集于离心瓶，以3000g离心力离心5min，收集菌体得到菌体1。(3)用冰冷pH7.4、10mMPBS缓冲液重悬步骤(2)得到的菌体1，4℃超声破碎(超声功率50W，超声时间30min，5S破碎10S间隙)，得到菌体破碎液。(4)将步骤(3)得到的菌体破碎液4℃、14000g离心15分钟，得到上清液1。(5)向步骤(4)得到的上清液1加入2mL10％(体积百分含量)聚乙烯亚胺水溶液，离心15分钟，得到上清液2。(6)反相转变循环技术(Inversetransitioncycling，ITC)第一次纯化：向步骤(5)得到的上清液2中加入NaCl，使NaCl在体系中的浓度为3mol/L，37℃充分溶解后，14000g离心15分钟，去上清A，得到沉淀1；用预冷的pH7.4、10mMPBS缓冲液溶解沉淀1，离心，得到上清液3。(7)反相转变循环技术(Inversetransitioncycling，ITC)第二次纯化：向步骤(6)得到的上清液3中加入NaCl，使NaCl在体系中的浓度为3mol/L，37℃充分溶解后，14000g离心15分钟，去上清B，得到沉淀2；用预冷的pH7.4、50mMTris·HCl缓冲液溶解沉淀2，离心，得到上清液4。上清液4中含有IFN-ELP，因此命名为IFN-ELP溶液。将上清液4进行SDS-PAGE，测定IFN-ELP的纯度。用NanoDrop2000分光光度计测定上清液4中IFN-ELP的浓度。反相转变循环技术(Inversetransitioncycling，ITC)纯化原理见图1。IFN-ELP的表达与纯化见图2(图2中，1为步骤(3)的菌体破碎液，2为步骤(6)的上清A，3为步骤(6)的沉淀1，4为步骤(7)的上清B，5为步骤(7)的沉淀2，6为蛋白标准品。结果表明，通过ITC纯化后，上清液4中目的蛋白IFN-ELP的纯度＞95％，IFN-ELP的产率达到250mg/L培养菌液3。2、SrtA的表达和纯化(1)将上述步骤1中的重组质粒pET-25b-IFN-ELP替换为重组质粒pET-25b-Sortase，其它同步骤1的(1)，得到培养菌液4。(2)同步骤1的(2)。(3)同步骤1的(3)。(4)同步骤1的(4)，得到上清液,6。(5)向步骤(4)得到的上清液6加入2mL10％(体积百分含量)聚乙烯亚胺水溶液，离心15分钟，得到上清液7。(6)将10mL上清液7经0.45μm滤膜过滤后上样至镍亲和层析柱(HisTrapHP5mL，GE公司)，先用40mL平衡缓冲液(pH7.4、10mMPBS，500mMNaCl，5％甘油，10mM咪唑)洗脱，然后用20mL洗脱液(pH7.4、10mMPBS，500mMNaCl，5％甘油，500mM咪唑)进行洗脱，收集用洗脱液进行洗脱得到的过柱后溶液，然后将过柱后溶液经脱盐柱(HiPrep26/10Desalting)除去咪唑，同时置换到pH7.4、50mMTris·HCl缓冲液中，获得SrtA溶液(即含有SrtA的pH7.4、50mMTris·HCl缓冲液)。将SrtA溶液进行SDS-PAGE，测定SrtA的纯度。用NanoDrop2000分光光度计测定上述纯化样品中SrtA的浓度。结果表明，SrtA溶液中SrtA的纯度＞95％，产率达到200mg/L培养菌液4。实施例2、IFN和ELP的获得获得IFN和ELP的步骤如下：1、取实施例1的步骤三的2制备的100μMSrtA溶液10mL，加入CaCl2并使其浓度为10mM，得到溶液。2、取实施例1的步骤三的1中制备的200μMIFN-ELP溶液10mL，向其中加入5mM三甘氨酸(sigma公司产品)，然后与10mL步骤1得到的溶液混合，室温反应过夜，得到混合液1。将混合液1用pH7.4、10mMPBS缓冲液经HiPrep26/10Desalting脱盐柱(GE公司产品)去除小分子杂质得到溶液，得到混合液2。3、完成步骤2后，将混合液2在AKTA蛋白纯化系统(AKTAPurifier10，GE公司产品)上经阴离子交换层析(HiTrapCaptoQ5mL)纯化得到ELP溶液。阴离子交换层析的参数：阴离子交换层析柱为HiTrapCaptoQ5mL；先用平衡缓冲液(pH4.5、20mM醋酸溶液)洗脱柱子，然后上样10mL混合液2，用洗脱液进行洗脱(洗脱过程：A液为pH4.5、20mM醋酸水溶液，B液为1MNaCl水溶液，洗脱液由A液和B液组成，使用流动相B逐渐递增、流动相A逐渐递减的线性洗脱条件，具体如下：在0-10min内，流动相中A液的体积百分含量由100％匀速降至0％。检测波长为280nm。收集洗脱体积60mL-65mL的过柱后溶液，即为ELP溶液。经HiPrep26/10Desalting脱盐柱(GE公司产品)置换到 含150mMNaCl的pH7.4、50mMTris·HCl缓冲液中。4、完成步骤2后，将混合液2在AKTA蛋白纯化系统(AKTAPurifier10，GE公司产品)上经阴离子交换层析(HiTrapCaptoQ5mL)纯化得到IFN溶液。阴离子交换层析的参数：阴离子交换层析柱为HiTrapCaptoQ5mL；先用平衡缓冲液(pH7.4、20mMTris·HCl)洗脱柱子，然后上样10mL混合液2，用洗脱液进行洗脱(洗脱过程：A液为pH7.4、20mMTris·HCl水溶液，B液为1MNaCl水溶液，洗脱液由A液和B液组成，使用流动相B逐渐递增、流动相A逐渐递减的线性洗脱条件，具体如下：在0-10min内，流动相中A液的体积百分含量由100％匀速降至0％。检测波长为280nm。收集洗脱体积90mL-100mL的过柱后溶液，即为IFN溶液。经HiPrep26/10Desalting脱盐柱(GE公司产品)置换到含150mMNaCl的pH7.4、50mMTris·HCl缓冲液中。实验结果见图3、图4。图3(图3中A为采用阴离子交换柱从混合液2中纯化ELP的色谱图，其中UV监测线性洗脱得到目标产物ELP；图3中B为纯化ELP过程中的SDS-PAGE分析结果，其中1为蛋白标准品，2为混合液1，3为混合液2，4为流穿液，5为收集洗脱体积43mL-50mL得到的洗脱蛋白IFN，6为收集洗脱体积52mL-58mL得到的洗脱蛋白IFN-ELP和IFN，7为收集洗脱体积60mL-65mL得到的洗脱蛋白ELP，8为收集洗脱体积70mL-80mL得到的洗脱蛋白SrtA，9为实施例1步骤1制备的上清液4)为ELP合成及纯化过程。图4(图4中A为采用阴离子交换柱从混合液2中纯化IFN的色谱图，其中UV监测线性洗脱得到目标产物IFN；图4中B为纯化IFN过程中的SDS-PAGE分析结果，其中M为蛋白标准品，1为实施例1步骤2制备的SrtA溶液，2为实施例1步骤1制备的上清液4，3为混合液1，4为收集洗脱体积0mL-40mL得到的流穿蛋白ELP和SrtA，5为收集洗脱体积90mL-100mL得到的洗脱蛋白IFN)为IFN合成及纯化过程。实施例3、IFN-ELP的物理化学表征1、分子量测定用基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱(MALDI-TOF)测定上述步骤获得的IFN-ELP、IFN和ELP的分子量，仪器为4800PlusMALDI-TOF/TOFTM分析仪(ABSCIEX)，具体测定方法及步骤参见仪器自带说明书。结果表明(图5)，通过SrtA催化和阴离子交换柱(AEX)纯化获得IFN、ELP和IFN-ELP。IFN-ELP的分子量测定结果为58236.1，IFN的分子量测定结果为20338.1，均与理论值基本一致。2、水合半径用pH7.4、10mMPBS缓冲液溶解待测蛋白(IFN-ELP或IFN)，然后经0.22μm孔径滤膜过滤得到待测样品。将待测样品在MalvernZetasizerNanoZS90纳米粒径电位分析仪上用动态光散射(DLS)方法(WeipingGao,etal.InsitugrowthofaPEG-likepolymerfromtheCterminusofaninteinfusionproteinimprovespharmacokineticsandtumoraccumulation.ProcNatlAcadSciUSA.2010Sep21；107(38):16432-7.)测量待测蛋白(IFN-ELP或IFN)的水合半径。具体测量步骤参见仪器自带说明书。DLS测试使用的是MalvernZetasizerNano-zs90。数据处理使用软件Zetasizersoftware6.32。结果表明(图6)，IFN的水合半径为2.2nm，IFN-ELP的水合半径为9.9nm。3、相转变温度运用浊度法测定相转变温度，具体步骤为：用pH7.4、10mMPBS缓冲液溶解待测蛋白(IFN-ELP或ELP)至待测蛋白在体系中的浓度为1mg/mL，然后用酶标仪(MolecularDevices公司产品)测定其在35-55℃(以0.5℃/min线性递增)范围内的OD350值。当待测蛋白的OD350值达到上述温度范围内OD350值最大值的一半时的温度即为相转变温度。结果表明(图7)，ELP的相转变温度为47.8℃，IFN-ELP的相转变温度为45.3℃。4、二级结构运用圆二色性色谱分析测得待测蛋白(IFN-ELP或IFN)的二级结构，具体步骤为：用水溶解待测蛋白(IFN-ELP或IFN)至待测蛋白在体系中的浓度为0.18mg/mL，然后用圆二色光谱仪(AppliedPhotophysics有限公司)在200-260nm波长范围内进行紫外扫描分析。结果表明(图8)，IFN-ELP和IFN在200-260nm波长范围内的圆二色性色谱分析都呈现出同样的208/222nm双峰曲线，均为典型的α螺旋结构。IFN-ELP与IFN的曲线重叠良好，表明在IFN上修饰ELP后二级结构没有明显影响。实施例4、IFN-ELP的体外生物活性测定采用MTT方法测定待测蛋白(IFN-ELP或IFN)的体外生物活性。具体步骤如下：1、在含10％(体积百分比)FBS、50U/mL盘尼西林和50μg/mL链霉素的RMPI-1640培养基中培养人Burkitt’sB淋巴瘤细胞(简称DaudiB)获得细胞悬浮液。2、取待测蛋白用含10％(体积百分比)FBS、50U/mL盘尼西林和50μg/mL链霉素的RMPI-1640培养基稀释，得到浓度不同的待测蛋白溶液。3、取96孔细胞培养板，每孔加入50μL步骤1获得的细胞悬浮液(每孔约104个细胞)，然后加入步骤2配置的待测蛋白溶液(每孔50μL，使待测蛋白在孔中的浓度为1、2、5、10、20、50、100、1000或10000pg/mL)，5％CO2、37℃培养72h，然后加入MTT溶解液(Promega公司产品)，3h后，采用酶标仪检测490nm处的吸光值。在96孔细胞培养板中设置阳性对照孔，每个阳性对照孔加入50μL步骤1获得的细胞悬浮液和50μL含10％(体积百分比)FBS、50U/mL盘尼西林和50μg/mL链霉素的RMPI-1640培养基。在96孔细胞培养板中设置阴性对照孔，每个阴性对照孔加入100μL含10％(体积百分比)FBS、50U/mL盘尼西林和50μg/mL链霉素的RMPI-1640培养基。采用酶标仪检测阴性对照孔和阳性对照孔490nm处的吸光值。以待测蛋白在孔中的浓度为横坐标，相对活性为纵坐标，比较待测蛋白处理后DaudiB细胞增殖的程度。相对活性根据下述公式计算：相对活性(100％)＝(待测蛋白溶液在490nm处的吸光值-阴性对照在490nm处的吸光值)/(阳性对照在490nm处的吸光值-阴性对照在490nm处的吸光值)*100％。实验结果见表1和图9。结果表明，IFN-ELP的半抑制浓度(IC50)为32.82pg/mL，相对活性为41％；IFN的半抑制浓度(IC50)为13.51pg/mL，相对活性为100％。结果表明，IFN经ELP修饰后并没有严重降低IFN体外生物的活性。表1.IFN和IFN-ELP的体外抗细胞增殖活性测定样品IC50(pg/mL)相对活性(％)IFN13.51100融合蛋白IFN-ELP32.8241实施例5、IFN-ELP的药物代谢动力学测试IFN-ELP或IFN的药物代谢动力学测试具体步骤如下：1、将6只8周龄体重为250g左右的雄性SD大鼠随机分成两组(每组3只)，分别处理如下：IFN组：尾静脉注射IFN，注射剂量为125μg/kg体重；IFN-ELP组：尾静脉注射IFN-ELP，注射剂量为125μg/kg体重。2、完成步骤1中的注射后开始计时，处理不同时间(IFN-ELP组时间点为1min，5min，15min，30min，1h，3h，6h，24h，48h，72h，96h，IFN组时间点为1min，5min，15min，30min，1h，3h，6h，24h)后的雄性SD大鼠分别用异氟烷麻醉，然后经眼内眦静脉用收集管取血0.3mL(收集管提前用肝素钠(江苏万邦生化医药股份有限公司产品)浸润并烘干)，室温静置1h，4℃、3000×g离心收集上层血浆，保存于-80℃低温冰箱。3、完成步骤2后，用人IFN-α2ELISA试剂盒(PBLinterferonsource公司产品)测定步骤2中各雄性SD大鼠血浆中的IFN浓度。测定方法和步骤按自带说明书进行。4、完成步骤3后，利用DAS软件进行数据分析。利用DAS软件中房室消除模型分析IFN-ELP和IFN的药物代谢动力学参数，结果表明(表2和图10)：1、IFN的半衰期为0.3h，在给药几分钟后，血液中干扰素的浓度迅速下降到初始剂量的50％以下，给药24h后，干扰素残留浓度不足干扰素初始浓度的0.1％；IFN-ELP的半衰期为8.57h，其在血液中干扰素的浓度是逐渐减少的，给药72h后，干扰素残留浓度仍有干扰素初始浓度的10％以上。2、IFN-ELP的体内平均滞留时间(MRT0-∞)是IFN的体内平均滞留时间(MRT0-∞)的11.3倍。3、IFN-ELP的药时曲线面积(AUC)是IFN的药时曲线面积(AUC)的32.9倍。表明，与IFN相比，IFN-ELP的半衰期和体内平均存留时间明显延长，药时曲线面积显著增加，生物利用率显著提高。表2.IFN和IFN-ELP的药物代谢动力学数据分析参数IFNIFN-ELPT1/2(h)0.30±0.038.57±3.88MRT0-∞(h)0.97±0.3310.93±2.84AUC(106pg/mL·h)0.20±0.036.58±0.75实施例6、IFN-ELP在组织中的分布情况IFN-ELP或IFN在组织中的分布情况具体步骤如下：1、将RMPI-1640培养基和BDMatrigelMatrix(Corning公司产品)等体积混得到混合物1。2、将在含有10％FBS、50U/mL盘尼西林和50g/mL链霉素的RMPI-1640培养基中培养的人卵巢癌细胞(OVCAR-3)用胰蛋白酶消化剥离，经pH7.4、10mMPBS缓冲液洗涤后，用步骤1得到的混合物1重悬，得到重悬液。3、将步骤2得到的重悬液接种与18只裸鼠左后肢股骨处背部皮下，接种量均为重悬液0.2mL(约5×106个细胞)/只，30天后6只裸鼠均形成大小约200mm3的实体瘤肿块。将6只裸鼠随机分成IFN组和IFN-ELP组，每组各9只。4、向步骤4中IFN-ELP组的裸鼠尾静脉注射IFN-ELP，IFN组的裸鼠尾静脉注射IFN。注射剂量均为10μg/20g体重。5、完成步骤4后，将IFN-ELP或IFN处理不同时间(2h、6h、或24h)后的裸鼠通过颈 椎脱臼法处死，收集心脏、肾脏、肝脏、脾脏、肺脏、胰腺、胃、肌肉、小肠、血浆和肿瘤等组织器官。6、将步骤5收集的组织器官(心脏、肾脏、肝脏、脾脏、肺脏、胰腺、胃、肌肉、小肠、血浆或肿瘤)用提取缓冲液破碎后，离心，得到上清提取液。提取缓冲液的溶质及其浓度为：1mMEDTA、0.5％TritonX-100、0.5％脱氧胆酸钠、1mMPMSF，1％(体积百分比)蛋白酶抑制剂混合物(Sigma-Aldrich公司产品)和1％磷酸酶抑制剂混合物(Sigma-Aldrich公司产品)；溶剂为pH7.4、10mMPBS缓冲液。7、用人IFN-α2ELISA试剂盒(PBLinterferonsource公司产品)定量测定步骤6中上清提取液中的IFN的浓度，测定方法和步骤按自带说明书进行，进一步得到步骤5组织器官(心脏、肾脏、肝脏、脾脏、肺脏、胰腺、胃、肌肉、小肠、血浆或肿瘤)中的IFN的浓度。结果表明(图11)，IFN-ELP组的裸鼠注射IFN-ELP处理不同时间(2h、6h、或24h)后，IFN在心脏、肾脏、肝脏、脾脏、肺脏、胰腺、胃、肌肉、小肠、血浆和肿瘤中均能够有效累积。尤其是在肿瘤中，IFN-ELP组肿瘤中干扰素的浓度和IFN组肿瘤中干扰素的浓度相比，注射2h为29倍，注射6h为66倍，注射24h为21倍。表明，IFN-ELP能够有效利用增强通透和滞留效应，使干扰素在肿瘤组织中聚集、在血液循环中半衰期延长，从而提高干扰素在体内的生物利用度和抗肿瘤功效。实施例7、IFN-ELP体内抗肿瘤活性测试IFN-ELP体内抗肿瘤活性测试具体步骤如下：1、取实施例6中经步骤1和2制备的重悬液，接种于26只裸鼠左后肢股骨处背部皮下，接种量为重悬液0.2mL(约5×106个细胞)/只，30天后，26只裸鼠均形成大小约40mm3的实体瘤肿块。2、将26只裸鼠随机分成四组，分别为IFN-ELP组(7只)、IFN组(7只)、ELP组(6只)和生理盐水组(6只)。3、向步骤2中IFN-ELP组的裸鼠尾静脉注射IFN-ELP，IFN组的裸鼠尾静脉注射IFN，ELP组的裸鼠尾静脉注射ELP，注射剂量均为60μg/20g体重。向步骤2中的生理盐水组的裸鼠尾静脉注射生理盐水，注射等体积生理盐水。各组均为每三天注射一次，直至生理盐水组、IFN组和ELP组的裸鼠全部死亡。在本实验中裸鼠死亡包括自然死亡和安乐处死，安乐处死是指裸鼠肿瘤生长超过1000mm3或体重下降超过15％，被注射巴比妥钠类药物处死。上述步骤3的实验过程中，每三天测量各组裸鼠的体重和肿瘤体积；每15天通过眼球取血，测量乳酸脱氢酶、肌酸激酶同工酶、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、肌酐、尿素氮、红细胞、白细胞、血小板、血红蛋白等基本生理指标。实验结果表明(图12、图13和图14)，实验期间，生理盐水组和ELP组的裸鼠的肿瘤体积逐渐增大，注射第39天生理盐水组和ELP组的裸鼠肿瘤体积均超过1000mm3，生存中值仅为34.5天和36天；实验期间，IFN组的裸鼠的肿瘤体积也逐渐增大，注射第45天IFN组的裸鼠肿瘤体积也超过1000mm3，生存中值为42天，没有体现明显的抗肿瘤活性；实验期间，IFN-ELP组的裸鼠的肿瘤体积基本没有变化，生存中值为87天。表明，IFN-ELP能够有效地抑制肿瘤的生长，具有非常好的体内抗肿瘤活性。实验结果还表明，实验期间，IFN-ELP组的裸鼠体重略有增加(图15)，表明IFN-ELP对 裸鼠没有明显的副作用。实验结果表明(图16和图17)，实验期间，与生理盐水组、IFN组和ELP组的裸鼠相比，IFN-ELP组的裸鼠的乳酸脱氢酶、肌酸激酶同工酶、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、肌酐、尿素氮、红细胞、白细胞、血小板、血红蛋白等基本生理指标没有显著差别。表明IFN-ELP不会对裸鼠体内器官造成明显毒性。以本发明所提供的融合蛋白IFN-ELP作为蛋白质药物，可使生物活性保持率增加、体内半衰期延长、体内平均存留时间延长，并有效抑制肿瘤。同时，本发明所提供的一种制备半衰期延长和/或生物活性保持率增加的蛋白质药物的方法为修饰蛋白药物以提高药物稳定性、改善药物代谢动力学和增强治疗功效的新方法。当前第1页1 2 3