一种检测磷脂混杂酶对肝癌细胞影响的检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及医药检测方法技术领域，尤其涉及一种磷脂混杂酶对肝癌细胞影响的 检测方法。
【背景技术】
[0002] 磷脂混杂酶 1(phospholipidscramblase1，PLSCR1)是一个分子量约为 35KD的 II型膜蛋白，其最初是基于其具有促进细胞膜内外层磷脂翻转的活性而从血红细胞及血小 板的细胞膜上被分离鉴定的。近年来的研宄发现，磷脂混杂酶1在多种肿瘤细胞中呈高表 达，例如结直肠癌，肝癌，卵巢癌等，其与肿瘤细胞的生长，增殖及细胞迀移密切相关，并且 磷脂混杂酶1的高表达与肿瘤的预后具有相关性。
[0003] 磷脂混杂酶1是一个新发现的钙离子依赖的膜蛋白，在磷脂酰丝氨酸及其他氨基 酸磷脂的跨膜运动中具有重要的作用，并且这些跨膜运动往往与一些生理、病理事件相关， 例如细胞损伤和细胞凋亡。有研宄报道，PLSCR1参与了肿瘤细胞的增殖运动。Kodigepalli KM等报道PLSCR1可以促进乳腺癌细胞的生长和增殖，并且在乳腺癌病人的癌组织及血清 中高表达，与乳腺癌的预后直接相关。KuoYB等也发现PLSCR1是结肠癌的一个肿瘤标志 物，在结肠癌组织中高表达，FanCW等发现抑制PLSCR1的表达可以显著抑制结肠癌的生长 和转移。最近的研宄也发现，PLSCR1还参与了血管生成素（Angiogenin)的细胞核定位，并 与细胞周期具有相关性。
【发明内容】
[0004] 为了研宄检测磷脂混杂酶对肝癌细胞的影响，本发明提出了一种新的检测磷脂混 杂酶对肝癌细胞影响的检测方法。
[0005] 本发明提出的一种检测磷脂混杂酶对肝癌细胞影响的检测方法：
[0006]A、细胞培养：将人肝癌细胞H印G2细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基中， 置5%C02的37°C培养箱中培养。
[0007] 优选的，所诉的人肝癌细胞H印G2细胞购自中国科学院上海细胞库。所述的胎牛 血清（FBS)和DMEM培养基均购自美国Gibco公司。
[0008]B、siRNA干扰PLSCR1的表达及稳转细胞系的构建：将PLSCR1及GAPDH抗体H印G2 细胞培养于含10 %FBS的DMEM培养液中至对数生长期，用0. 025 %的胰蛋白酶消化，按5x 105个细胞/ml接种于12孔板中，培养过夜后按照M0I20感染H印G2细胞，同时设立对照 组，48h后，将培养基换成含5yg/ml嘌呤霉素的新鲜培养基进行细胞筛选，以后隔天更换 含5yg/ml嘌呤霉素的新鲜培养基，10-12d后，0. 025%的胰蛋白酶消化细胞，将其按1个细 胞/100y1培养液接种于96孔板，1周后，挑选单克隆株，继续扩大培养。WesternBlot鉴 定阳性克隆株，并挑选生长良好的单克隆株冻存及用于后续实验；
[0009] 优选的，所述的干扰PLSCR1的siRNA慢病毒载体，PLSCR1抗体及GAPDH抗体均购 自美国SantaCruze公司；
[0010] 优选的，所述的〇. 025%胰蛋白酶和嘌呤霉素均购自美国Gibco公司。
[0011]C、细胞增殖及侵袭实验：将HepG2细胞培养于含10 %FBS的DMEM培养 液中，用〇? 025 %的胰蛋白酶分别消化对数生长期的PLSCRl-siRNA-IfepG2细胞、 Control-siRNA-IfepG2细胞及H印G2细胞，以每孔5x103个细胞接种于96孔培养板中，每孔 体积为100y1，各组细胞分别做6个复孔。将培养板放入37°C、5%C02培养箱中，48h后， 每孔加入MTT溶液（5mg/ml) 10y1，在37°C细胞培养箱中继续孵育4h，终止培养，小心吸弃 孔内培养上清液。每孔加入150ylDMS0,振荡lOmin，使结晶物充分溶解。选择490nm波 长，在酶联免疫检测仪上测定各孔吸收值，记录结果。
[0012] IfepG2细胞培养于含10 %FBS的DMEM培养液中，按照24孔比色法检测细胞侵袭 能力试剂盒（QCMTM24_WellColorimetricCellInvasionAssayKit(CHEMIC0N))的说 明书要求进行操作，用〇. 025%的胰蛋白酶分别消化对数生长期的PLSCRl-siRNA-HepG2细 胞、Control-siRNA-IfepG2细胞及H印G2细胞，将细胞按5x105个细胞/ml接种于小室， 48小时后，对细胞进行染色，在普通倒置显微镜下观察细胞迀移情况，并检测细胞裂解液在 560nm下的吸光值，对其定量。
[0013] D、病理标本采集及RNA抽提：选取定量的手术切除肝癌标本，每例标本均留取肿 瘤组织和距肿瘤边缘5cm以上的配对癌旁组织。手术标本离体后，于30min内液氮速冻，保 存于-80°C冰箱备用。所有病例均确诊为肝癌，临床资料完整，均未接受放化疗。
[0014] 优选的，所述的RNA抽提按照Trizol(美国Invitrogen公司）试剂说明书操作， 总RNA的纯度及完整性通过检测A260/280及琼脂糖凝胶电泳来确定。
[0015]E、荧光定量聚合酶链反应（qPCR)检测PLSCR1:取1ygRNA反转录成cDNA，再取 lylcDNA在ABI7500荧光定量PCR仪中进行反应。每个组织样本分别做3个重复进行检 测。
[0016]F、综合数据分析磷脂混杂酶对肝癌细胞的影响。
【附图说明】
[0017] 图1是Westernblot检测siRNA干扰IfepG2细胞PLSCR1蛋白表达图。
[0018] 图2是MTT检测PLSCR1对H印G2细胞增殖的影响图。siRNA组与Control组比较 (*p〈0. 05)，siRNA组与IfepG2 未处理组比较（#p〈0. 05)。
[0019] 图3是PLSCR1对H印G2细胞侵袭能力的影响图。图A为通过倒置显微镜C⑶拍 摄发生侵袭的H印G2细胞。图B为对图A的定量分析结果。siRNA组与Control组比较 (*p〈0. 05)，siRNA组与IfepG2 未处理组比较（#p〈0. 05)。
【具体实施方式】
[0020] A、细胞培养：人肝癌细胞H印G2细胞购自中国科学院上海细胞库。胎牛血清 (FBS)，DMEM培养基，0. 025%胰蛋白酶，青链霉素和嘌呤霉素均购自美国Gibco公司。H印G2 细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基中，置5%C02的37°C培养箱中培养。
[0021]B、siRNA干扰PLSCR1的表达及稳转细胞系的构建：干扰PLSCR1的siRNA慢病毒 载体，PLSCR1抗体及GAPDH抗体均购自美国SantaCruze公司，稳转细胞株按照说明书操 作。PLSCR1及GAPDH抗体H印G2细胞培养于含10%FBS的DMEM培养液中至对数生长期， 用0.025%的胰蛋白酶消化，按5x105个细胞/ml接种于12孔板中，培养过夜后按照MOI20感染H印G2细胞，同时设立对照组，48h后，将培养基换成含5yg/ml嘌呤霉素的新鲜培 养基进行细胞筛选，以后隔天更换含5yg/ml嘌呤霉素的新鲜培养基，10-12d后，0. 025% 的胰蛋白酶消化细胞，将其按1个细胞/1〇〇y1培养液接种于96孔板，1周后，挑选单克隆 株，继续扩大培养。Wester