产耐酸耐蛋白酶β-甘露聚糖酶的枯草芽孢杆菌的筛选及所获基因的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，涉及一种菌种和基因，尤其是产耐酸耐蛋白酶甘 露聚糖酶的枯草芽孢杆菌的筛选及所获基因。
【背景技术】
[0002] 0-甘露聚糖酶是水解以0-1，4-D-吡喃甘露糖为主链的甘露寡糖、甘露多 糖（甘露聚糖、葡萄甘露聚糖、半乳甘露聚糖）的内切水解酶。甘露聚糖及其衍生 物是半纤维素的第二大组分，是由0-1，4-甘露糖苷键连接的线状多糖，主链上通常 还连接有〇-1，6-半乳糖或葡萄糖，主要包括葡糖甘露&111(：〇1]^11皿11)、半乳甘露聚糖 (galactomannan)、葡糖醛酸甘露聚糖（glucuronomannan)等。在饲料工业中作为一种绿色 饲料添加剂，用于消除甘露聚糖的抗营养作用。
[0003] 0-甘露聚糖酶在自然界中广泛存在，植物、动物及微生物。在植物的种子、豆类植 物发芽的种子及天南星科植物魔芋萌发的球茎中；在一些海洋软体动物的肠道分泌液中； 在微生物如细菌、真菌、放线菌中等，均存在甘露聚糖酶。其中，微生物是甘露聚糖 酶的主要来源，如细菌中的枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜热芽孢杆菌，真菌中的曲霉、木 霉、酵母、青霉、多孔菌，以及放线菌中的链霉菌等。但是只有微生物甘露聚糖酶具有商 业价值，微生物0 _甘露聚糖酶是最重要工业用酶之一，其广泛应用于造纸行业中，近年来 发现甘露聚糖酶也可以应用在食物和饲料、咖啡萃取、石油勘探和清洁剂行业中。尤其微生 物甘露聚糖酶在饲料行业具有很大的市场。因为甘露聚糖酶是一种新型酶制剂， 它能有效分解饲料中的甘露聚糖，生成甘露寡糖等物质。多项试验表明，在玉米一豆柏 型日粮中添加0-甘露聚糖酶，可以提高动物的生产性能和健康水平，从而提高动物的生 产水平，这在动物生产上具有重要意义。
[0004] 微生物产生的e-甘露聚糖酶为多组分型，这些酶组分可能在分子量或等电点上 有着微小的差别，但在水解甘露聚糖时活性却明显不同，存在一定的互补关系，这说明微 生物甘露聚糖酶的诱导和分泌是一个复杂的代谢调节过程。不同来源的甘露聚 糖酶，对不同来源的底物作用深度及其水解产物是不相同的。0-甘露聚糖酶水解底物的 方式和深度主要与a-半乳糖残基和葡萄糖残基在主链中的位置、含量、酯酰化的程度有 关。底物本身的物理状态也会影响酶对底物的作用，如结晶状态的甘露聚糖不易被降解。甘 露聚糖经甘露聚糖酶作用后，通过HPLC或纸层析方法分析，主要产物是低聚糖（一 般2~10个残基），产物聚合度的大小与酶和底物的来源有关，但相对来说，产生单糖 (甘露糖）很少或根本不产生。国内外对来源于不同菌种的甘露聚糖酶的生产有所报 道，但多集中在碱性和中性0-甘露聚糖酶方面，而酸性0-甘露聚糖酶的微生物发酵生 产国内很少有报道。而单胃动物饲料中使用的甘露聚糖酶要求是酸性的，因此，对酸 性0 _甘露聚糖酶的研宄及其工业化推广将在饲料工业中具有较大的应用潜力。
[0005] 利用分子生物学手段，可以开发产酶活性高、高效产酶的重组菌种。大部分的细 菌来源的0-甘露聚糖酶属中性和酸性的。因此，细菌来源的0-甘露聚糖酶在适应宿主 中的表达相关研宄也成为了 甘露聚糖酶研宄的关键。因此开发高效产甘露聚糖酶 在理论和工业应用上具有重要的意义。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种产耐酸耐蛋白酶甘露聚糖酶的枯草芽孢杆菌的筛选 方法。
[0007] 本发明另一个目的通过扩增，获得产耐酸耐蛋白酶甘露聚糖酶的基因，利用 基因重组技术获得高效表达0 _甘露聚糖酶的菌株，通过发酵培养制备粗酶液，进一步通 过盐析、透析和层析分离制备电泳纯级别0 _甘露聚糖酶。
[0008] 本发明实现目的的技术方案是：
[0009] -种产耐酸耐蛋白酶甘露聚糖酶的枯草芽孢杆菌的筛选方法，步骤如下
[0010] ⑴初筛：通过LB固体培养基三区划线将来自实验室的枯草芽孢杆菌纯化和活化 37°C培养24h，将平板上长出的单菌落依次点接到筛选平板培养基上，37°C培养24h，将配 好的刚果红倾倒于长出茵落的筛选平板上，10~15min后，倒去刚果红溶液，用物质的量浓 度为1mol/L的NaCI溶液反复冲洗2-3次，加入NaCI溶液静置15min后倒掉，此时，产生 甘露聚糖酶的茵落周围将会出现透明圈，将具有透明圈直径较大的的菌落进行斜面保 存；
[0011] (2)斜面保存：将筛选出的产生甘露聚糖酶的枯草芽孢杆菌菌株划线于斜面 培养基上，在30°C恒温培养箱内培养24h，然后置于4°C冰箱保存；
[0012] (3)复筛：将初筛得到的菌株进行发酵，利用发酵产生的粗酶液进行耐酸耐蛋白 酶实验；
[0013](4)实验方法：lmL粗酶液加入到9mL50mMpH2. 0的甘氨酸-盐酸缓冲液中，37°C， 120r/min，孵育lh。按照侧酶活的标准方法进行酶活测定，并选取酶活残留率较高的上述 孵育液lmL，加入到含有0. 1%胰蛋白酶的9mL20mMpH5. 5乙酸-乙酸钠缓冲液中37°C继 续孵育2小时，按照测酶活的标准方法进行酶活测定，选取酶活残留率最高的菌落即为产 耐酸耐蛋白酶0-甘露聚糖酶的枯草芽孢杆菌，进行甘油管保存；
[0014] (5)甘油管保存：将产耐酸耐蛋白酶活力强的枯草芽孢杆菌菌株接种于LB液体 培养基中37°0摇床培养2411，将0.51111新鲜培养菌液与0.5111160%高温灭菌甘油分装于 1. 5mlEP管中充分混合后，标号后置于-70°C冰箱保存。
[0015] 一种产耐酸耐蛋白酶0-甘露聚糖酶的基因，序列如序列1所示的基因序列。
[0016] 一种包含产耐酸耐蛋白酶甘露聚糖酶的基因的基因工程菌，所述宿主菌为毕 赤酵母GS115,而且，所述载体为质粒PPIC9K。
[0017] 一种耐酸耐蛋白酶甘露聚糖酶，由基因工程菌的菌株发酵制得。
[0018] 而且，所述发酵培养基为：含酵母金粉1%，葡萄糖2%，蛋白胨2%，余量为水的 YH)培养基，培养条件为：活化重组菌，30°C、180rpm条件下培养24h，按2%的接种量接入种 子培养基（BMGY):100mM磷酸钾PH6.01.34%YNB4XKT5%生物素 1%甘油，30°C、180rpm 条件下培养17h。
[0019] 而且，将所得的菌体用发酵培养基（BMMY)洗2-3次，最后重悬于BMMY中，30°C、 180rpm条件下进行发酵96h，每24h补加终浓度为0. 5 %的甲醇。所得发酵液于4 °C、 8000rpm离心20min后，去菌体取上清作为粗酶液。
[0020] 本发明的优点和有益效果为：
[0021] 1、本发明源于枯草芽孢杆菌的甘露聚糖酶具有耐酸耐蛋白酶的优势，发酵方 法简单，成本低，使用刚果红及耐酸耐蛋白酶的筛选方法，操作简单。
[0022] 2、本发明菌株pPIC9K_man/GS115采用常规单批发酵方式培养，以角豆角为底物 测定该0-甘露聚糖酶活。该菌株产生的0-甘露聚糖酶最适酶解温度为50°C，最适pH为 5.5。该甘露聚糖酶耐碱能力良好，能够在pH3-ll保持良好的稳定性。非常适合作为 饲料的添加剂。
[0023] 3、本发明甘露聚糖酶适用于饲料添加剂用酶的开发，应用本发明提供的粗酶 液进行体外肠道模拟实验，其残留酶活率为80%。
[0024] 5、应用本发明提供的方法分离纯化甘露聚糖酶，甘露聚糖酶比酶活从 40.lU/mg提高到 781U/mg。
[0025] 6、本发明提供的电泳纯甘露聚糖酶的储存稳定性较好，电泳纯甘露聚糖 酶在4°C和室温下保存一个月后仍旧能够分别保持86. 2%和82. 7%的残留活性。
[0026] 7、本发明提供酶对金属离子Hg2+和Ag+，表面活性剂SDS，吐温20,TritonlOO对 该0_甘露聚糖酶有不同程度上的抑制作用，Na+，Ni2+，K+，Ca2+，Mg2+，Ba2+，EDTA对该 酶的酶活基本没有影响，Zn2+，Co2+，Cu2+，Fe3+对该酶有明显的激活作用。
[0027] 8、本发明提供酶的稳定性试验以胰蛋白酶30min处理后仍具有80%以上的残余 酶活。
【附图说明】
[0028]图1为产0_甘露聚糖酶枯草芽孢杆菌的平板筛选图；
[0029] 图2-1与图2-2为0-甘露聚糖酶的耐酸耐蛋白酶实验图；
[0030] 图3-1与图3-2为转化子在浓度梯度的平板上相同时间内长势图；
[0031] 图4为阳性酵母转化子的平板筛选图；
[0032] 图5为本发明0-甘露聚糖酶蛋白的电泳图，其中注：MMarker;1粗酶液；2离子 交换层析；3凝胶过滤层析；
[0033] 图6为本发明pH对0-甘露聚糖酶的活性影响图和pH稳定性图；
[0034] 图7为本发明温