具有蛋白酶活性的多肽和编码它们的多核苷酸的制作方法
【专利说明】具有蛋白酶活性的多肽和编码它们的多核苷酸
[0001] 对序列表的引用
[0002] 本申请包括一个计算机可读形式的序列表，将其通过引用结合在此。
[0003] 发明背景 发明领域
[0004] 本发明涉及具有蛋白酶活性的多肽和编码这些多肽的多核苷酸。本发明还涉及核 酸构建体、载体、以及包括这些多核苷酸的宿主细胞，连同在啤酒生产中使用这些多肽的方 法。
[0005] 相关技术说明
[0006] 本发明提供具有蛋白酶活性的多肽和编码这些多肽的多核苷酸。
[0007] 本发明还提供了在饮料中使用本发明的多肽改进胶体稳定性的方法。
[0008] 许多饮料（像啤酒、葡萄酒、果汁等）在制造过程中或在储存后发展沉淀。这种现 象被描述为混浊形成。一种形式的混浊形成通常被认为是由于存在于该饮料中的蛋白和多 酚的相互作用。这种相互作用导致形成胶体颗粒的不溶性或半可溶性的悬浮液。由于混浊 形成可类似于由微生物污染产生的晦度，但是通常优选的是，这些饮料（特别是啤酒）甚至 在长期储存后是非常清澈且透明的。因此已经开发了用以减轻这类混浊形成的方法。这些 方法靶向这些蛋白或多酚或两者。
[0009] 硅胶、膨润土、聚（乙烯基聚吡咯烷酮）（PVPP)等已经用来吸附蛋白和多酚、减少 混浊形成和改进胶体稳定性。然而，这类材料，当反复使用时会导致收益减少并且因此导致 成本的增加。此外，它们还从该饮料去除其他希望的化合物，这可能影响其质量。
[0010] 酶，特别是蛋白酶，也在发酵过程中使用以改进饮料（特别是啤酒）的胶体稳定 性。传统上，蛋白酶像木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶，已经被用于减少冷混浊形成。然而，这些 蛋白酶已经显示出会通过水解参与泡沫的形成和稳定的蛋白而影响饮料的泡沫稳定性。此 外，这些也引起饮料的香味变化。另一种途径是使用主要水解混浊形成蛋白并且很少水解 泡沫形成蛋白的蛋白酶。例如，已知一种脯氨酸特异性内切蛋白酶（例如，从EP 1326957)。
[0011] 发明概述
[0012] 本发明涉及具有蛋白酶活性的多肽，所以我们要求：
[0013] -种具有蛋白酶活性的多肽，该多肽选自下组，该组由以下各项组成：
[0014] (a) -种多肽，该多肽与SEQ ID NO: 1的多肽具有至少60%序列一致性；
[0015] (b)由一种多核苷酸编码的一种多肽，该多核苷酸在低严格条件下与SEQ ID NO: 2 的成熟多肽编码序列杂交；
[0016] (c) 一种多肽，该多肽由与SEQ ID NO:2的多肽编码序列具有至少60%序列一致 性的多核苷酸编码；
[0017] (d) SEQ ID NO: 1的多肽的一种变体，该变体在一个或多个位置处包括取代、缺失 和/或插入；和
[0018] (e) (a)、（b)、（c)或⑷的多肽的一个片段，该片段具有蛋白酶活性。
[0019] 本发明还涉及编码本发明多肽的分离的多核苷酸；核酸构建体；重组表达载体； 包括这些多核苷酸的重组宿主细胞；以及产生这些多肽的方法。
[0020] 本发明还涉及使用本发明的一种或多种多肽改进饮料中的胶体稳定性的方法，该 饮料为例如但不限于啤酒、基于麦芽汁的非酒精饮料、葡萄酒以及果汁。一种改进胶体稳定 性的方式是通过防止或减少混浊。
[0021] 在一个方面，本发明涉及一种改进啤酒胶体稳定性的方法，该方法包括在啤酒生 产过程中向醪液和/或麦芽汁中添加本发明的一种或多种多肽。
[0022] 在另一个方面中，本发明涉及本发明的一种或多种多肽在酿造中的用途。
[0023] 在一个方面中，该接触是与麦芽汁一起进行的。在另一个方面中，该一种或多种多 肽被添加到麦芽汁中。在另一个方面中，该接触是与醪液一起进行的。在另一个方面中， 该一种或多种多肽被添加到醪液中。在一个方面中，该接触是在发酵过程中进行的。在另 一个方面中，该一种或多种多肽是在发酵过程中添加的。在一个方面中，该接触是在滤清 后进行的。在另一个方面中，该接触是在喷洒过程中进行的。在一个方面中，该接触是在 20°C-80°C的温度进行的。在另一个方面中，该接触是在至少30°C的温度进行的。在另一 个方面中，该接触是在至少40°C的温度进行的。在一个方面中，该接触是在至少50°C的温 度进行的。在另一个方面中，该接触是在至少60°C的温度进行的。在另一个方面中，该接触 是在至少70°C的温度进行的。在一个方面中，该接触是在至少75°C的温度进行的。
[0024] 定义
[0025] 具有蛋白酶活性的多肽
[0026] 具有蛋白酶活性的多肽或蛋白酶有时还被指定为肽酶、朊酶、肽水解酶或蛋白水 解酶。蛋白酶可以是在其任一端开始水解肽的外切型蛋白酶或在多肽链内部发挥作用的内 切型蛋白酶（内肽酶）。内肽酶对N-和C-末端被封闭的肽底物显示出活性，这些底物与所 讨论的蛋白酶的特异性有关。
[0027] 术语"蛋白酶"在此被定义为水解肽键的酶。蛋白酶的定义也适用于如在此使用 的术语"亲本蛋白酶"和"蛋白酶变体"的蛋白酶部分。术语"蛋白酶"包括属于EC 3.4酶 组（包括其13个亚类中的每一个）的任何酶。EC编号参考加利福尼亚州（California)的 圣迭戈（San Diego)的NC-IUBMB学术出版社（Academic Press)的1992年酶命名法，分别 包括出版于欧洲生物化学杂志（Eur. J. Biochem.) 1994, 223,1-5 ;欧洲生物化学杂志1995， 232,1-6 ;欧洲生物化学杂志1996, 237,1-5 ;欧洲生物化学杂志1997, 250,1-6 ;以及欧洲生 物化学杂志1999, 264,610-650的增刊1-5。命名会定期得以增补和更新；参见例如万维网 (WWW)于 http://www. chem. qmw. ac. uk/iubmb/enzyme/index. html〇
[0028] 本发明的和根据本发明使用的蛋白酶选自下组，该组由以下各项组成：
[0029] (a)属于EC 3. 4. 24酶组的蛋白酶；和/或
[0030] (b) M5家族的蛋白酶；
[0031] 如在基因（Gene)88:87-95(1990)和在MEROPS蛋白酶数据库，发行，9. 6(www. merops. sanger. ac. uk)中所述的。该数据库描述于罗林斯（Rawl ings)，Ν· D.，巴雷特 (Barrett)，A. J.和贝特曼（Bateman)，Α. (2012)MER0PS :蛋白水解酶数据库，它们的底 物和抑制剂（MEROPS:the database of proteolytic enzymes, their substrates and inhibitors)，核酸研究（Nucleic Acids Res) 40, D343-D350 中。
[0032] 可以使用任何测定来测量蛋白酶活性，其中采用一种底物，该底物包括与所讨论 的蛋白酶的特异性相关的肽键。PH测定和温度测定同样适用于所讨论的蛋白酶。pH值测 定的实例是pH 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、或12。温度测定的实例是15°(：、20°(：、25°(：、30°(：、 35°(：、37°(：、40°(：、45°(：、50°(：、55°(：、60°(：、65°(：、70°(：、80°(：、90°(：、或95°(：。蛋白酶底物的实 例为酪蛋白，如Azurine-Crosslinked Casein(AZCL-酪蛋白）。适合的蛋白酶测定的实例 描述于实验部分中。
[0033] 蛋白酶活性：术语"蛋白酶活性"意指通过水解多肽链中的将氨基酸连接在一起的 肽键，催化酰胺键或蛋白的水解的蛋白水解活性（EC3. 4)。用于测定蛋白酶活性的若干测定 在本领域是可获得的。出于本发明的目的，根据实例中所描述的程序确定蛋白酶活性。在 一个方面中，本发明的这些多肽具有SEQ ID N0:1的成熟多肽的至少20%，例如至少40%、 至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或至少100%的蛋白酶活 性。
[0034] 等位基因变体：术语"等位基因变体"意指占据同一染色体基因座的基因的两种或 更多种可替代形式中的任一种。等位基因变异由突变天然产生，并且可以导致群体内的多 态性。基因突变可以是沉默的（在所编码的多肽中没有改变）或可编码具有改变的氨基酸 序列的多肽。多肽的等位基因变体是由基因的等位基因变体编码的多肽。
[0035] 催化结构域：术语"催化结构域"意思指一种酶的包含该酶的催化机器的区域。
[0036] cDNA :术语"cDNA"是指可以通过从得自真核或原核细胞的成熟的、剪接的mRNA分 子进行反转录而制备的DNA分子。cDNA缺乏可以存在于对应基因组DNA中的内含子序列。 早先的初始RNA转录本是mRNA的前体，其在呈现为成熟的剪接的mRNA之前要经一系列的 步骤进行加工，包括剪接。
[0037] 编码序列：术语"编码序列"意指直接指定一个多肽的氨基酸序列的多核苷酸。编 码序列的边界一般由一个开放阅读框架决定，该开放阅读框架从一个起始密码子（如ATG、 GTG或TTG)开始并且以一个终止密码子（如TAA、TAG或TGA)结束。编码序列可以是一种 基因组DNA、cDNA、合成DNA或其组合。
[0038] 控制序列：术语"控制序列"意指对于表达编码本发明的成熟多肽的多核苷酸所必 需的核酸序列。每个控制序列对于编码该多肽的多核苷酸来说可以是天然的（即，来自相 同基因）或外源的（即，来自不同基因），或相对于彼此是天然的或外源的。此类控制序列 包括但不限于前导子、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列、以及转录终止子。 至少，控制序列包括启动子，以及转录和翻译终止信号。出于引入有利于将这些控制序列与 编码一种多肽的多核苷酸的编码区连接的特异性限制酶切位点的目的，这些控制序列可以 提供有多个接头。
[0039] 表达：术语"表达"包括涉及多肽产生的任何步骤，包括但不限于，转录、转录后修 饰、翻译、翻译后修饰、以及分泌。
[0040] 表达载体：术语"表达载体"意指线性或环状DNA分子，该分子包括编码多肽的多 核苷酸并且该多核苷酸可操作地与提供用于其表达的控制序列相连接。
[0041] 片段：术语"片段"意指具有从成熟多肽或结构域的氨基和/或羧基端缺失的一个 或多个（例如，若干个）氨基酸的多肽；其中该片段具有蛋白酶活性。在一个方面中，一个 片段包含SEQ ID NO: 1的氨基酸数目的至少85%、至少90%、至少95%。
[0042] 高严格条件：术语"高严格条件"意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言， 遵循标准DNA印迹程序，在42°C下在5X SSPE、0. 3% SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼 精子DNA和50%甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2X SSC、0. 2% SDS，在65 °C下洗涤三次，每次15分钟。
[0043] 宿主细胞：术语"宿主细胞"意指易于用包括本发明的多核苷酸的核酸构建体或表 达载体转化、转染、转导等的任何细胞类型。术语"宿主细胞"涵盖由于复制期间发生的突 变而与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。
[0044] 分离的：术语"分离的"意指处于自然界中不出现的形式或环境中的物质。分离的 物质的非限制性实例包括（1)任何非天然发生的物质，（2)包括但不限于任何酶、变体、核 酸、蛋白质、肽或辅因子的任何物质，该物质至少部分地从与其本质相关的一种或多种或所 有天然发生的成分中去除；（3)相对于天然发现的物质通过人工修饰的任何物质；或（4)通 过增加该物质相对于与其天然相关的其他组分的量而修饰的任何物质（例如，宿主细胞中 的重组体产量；编码该物质的基因的多拷贝；以及使用比编码该物质的基因天然相关的启 动子强的启动子）。
[0045] 低严格条件：术语"低严格条件"意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言， 遵循标准DNA印迹程序，在42°C下在5X SSPE、0. 3% SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼 精子DNA和25%甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2X SSC、0. 2% SDS，在50 °C下洗涤三次，每次15分钟。
[0046] 成熟多肽：术语"成熟多肽"意指在翻译和任何翻译后修饰如N-末端加工、C-末 端截短、糖基化作用、磷酸化作用等之后处于其最终形式的多肽。在一方面，成熟多肽是SEQ ID NO:1〇
[0047] 成熟多肽编码序列：术语"成熟多肽编码序列"意指编码具有蛋白酶活性的成熟多 肽的一种多核苷酸。在一方面，成熟多肽编码序列是SEQ ID N0:2。
[0048] 中严格条件：术语"中严格条件"意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言， 遵循标准DNA印迹程序，在42°C下在5X SSPE、0. 3% SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼 精子DNA和35%甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2X SSC、0. 2% SDS，在55 °C下洗涤三次，每次15分钟。
[0049] 中-高严格条件：术语"中-高严格条件"意指对于长度为至少100个核苷酸的探 针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42°C下在5X SSPE、0. 3% SDS、200微克/ml剪切并变性 的鲑鱼精子DNA和35%甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2X SSC、 0. 2 % SDS，在60 °C下洗涤三次，每次15分钟。
[0050] 核酸构建体：术语"核酸构建体"意指单链或双链的一种核酸分子，该核酸分子是 从天然存在的基因中分离的，或以一种本来不存在于自然界中的方式被修饰成含有核酸的 区段，或是合成的，该核酸分子包括一个或多个控制序列。
[0051] 可操作地连接：术语"可操作地连接"意指如下的构造，其中，控制序列相对于多核 苷酸的编码序列安置在适当位置处，从而使得该控制序列指导该编码序列的表达。
[0052] 序列一致性：两个氨基酸序列之间或者两个核苷酸序列之间的关联度通过参数 "序列一致性"来描述。
[0053] 出于本发明的目的，使用如在EMBOSS包（EMBOSS :欧洲分子生物学开放软件 套件（The European Molecular Biology Open Software Suite)，赖斯（Rice)等人， 2000,遗传学趋势（Trends Genet.) 16:276-277)(优选5.0.0版或更新版本）的尼德尔 (Needle)程序中所实施的尼德尔曼-翁施（Needleman-Wunsch)算法（Needleman(尼德尔 曼）和Wunsch (翁施），1970,分子生物学杂志（J. Mol. Biol.) 48:443-453)来确定两个氨 基酸序列之间的序列一致性。所使用的参数是空位开放罚分10,空位延伸罚分〇. 5,以及 EBL0SUM62 (BL0SUM62的EMBOSS版本）取代矩阵。尼德尔标注的"最长的一致性"的输出 (使用-非简化选项获得）被用作百分比一致性，并且如下计算：
[0054] (一致的残基X 100V(比对长度-比对中的空位总数）
[0055] 出于本发明的目的，使用如在EMBOSS包（EMBOSS :欧洲分子生物学开放软件套件， 赖斯（Rice)等人，2000,见上文）（优选5. 0. 0版或更新版本）的尼德尔程序中所实施的尼 德尔曼-翁施算法（尼德尔曼（Needleman)和翁施（Wunsch)，1970,见上文）来确定两个 脱氧核糖核苷酸序列之间的序列一致性。所使用的参数是空位开放罚分10,空位拓展罚分 0. 5,和EDNAFULL (NCBI NUC4. 4的EMBOSS版）取代矩阵。尼德尔标注的"最长的一致性"的 输出（使用-非简化选项获得）被用作百分比一致性，并且如下计算：
[0056] (-致的脱氧核糖核苷酸X 100)八比对长度-比对中的空位总数）。
[0057] 子序列：术语"子序列"意指使一个或多个（例如，若干个）核苷酸从成熟多肽编 码序列的5'端和/或3'端缺失的多核苷酸；其中该子序列编码具有蛋白酶活性的片段。
[0058] 基本上纯的多核苷酸：术语"基本上纯的多核苷酸"意指不含其他外来的或不需要 的核苷酸的多核苷酸制品，并且其存在的形式适于在基因工程改造的多肽生产系统内进行 使用。因而，基本上纯的多核苷酸包含按重量计最多10%、最多8%、最多6%、最多5%、最 多4%、最多3%、最多2%、最多1 %和最多0. 5%与该多核苷酸天然或重组关联的其他多核 苷酸物质。然而，基本上纯的多核苷酸可以包含天然存在的5'和3'非翻译区，如启动子和 终止子。优选地，该多核苷酸是按重量计至少90%纯的，例如至少92%纯的、至少94%纯 的、至少95 %纯的、至少96 %纯的、至少97 %纯的、至少98 %纯的、至少99 %纯的、以及至少 99. 5%纯的。本发明的多核苷酸优选以一种基本上纯的形式存在。
[0059] 基本上纯的多肽：术语"基本上纯的多肽"意指这样一种制品，该制品包括与其天 然关联或重组关联的按重量计至多10%、至多8%、至多6%、至多5%、至多4%、至多3%、 至多2 %、至多1 %、以及至多0. 5 %的其他多肽物质。优选地，该多肽按存在于制剂中的总 多肽材料的重量计是至少90 %纯的，例如至少91 %纯的、至少92 %纯的、至少93 %纯的、至 少94%纯的、至少95%纯的、至少96%纯的、至少97%纯的、至少98%纯的、至少99%纯 的、至少99. 5%纯的、以及100%纯的。本发明的多肽优选处于基本上纯的形式。这可以例 如通过熟知的重组方法或通过经典纯化方法制备该多肽来实现。
[0060] 变体：术语"变体"意指在一个或多个（例如，若干个）位置包括改变（即，取代、插 入和/或缺失）的具有蛋白酶活性的一个多肽。取代意指用一个不同氨基酸置换占用一个 位置的氨基酸；缺失意指去除占据一个位置的氨基酸；并且插入意指邻近于并且紧跟着占 据一个位置的氨基酸之后添加一个或多个（例如，若干个）氨基酸（例如，1-5个氨基酸）。 本发明的这些变体具有SEQ ID NO: 2的成熟多肽的至少20%，例如至少40%、至少50%、至 少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或至少100%的蛋白酶活性。
[0061] 非常高严格条件：术语"非