N0:3编码具有信号肽、原肽、和成熟蛋白酶肽的全长蛋白 酶）。
[0226] 如在WO 99/43835描述的，该天然信号肽是通过将该合成基因融合至编码来自克 劳氏芽孢杆菌（Bacillus clausii)的碱性蛋白酶（aprH)的信号肽的DNA进行替换。在转 化时将所得基因通过同源重组整合至枯草芽孢杆菌宿主细胞基因组中。
[0227] 该枯草芽孢杆菌表达宿主通过在其染色体上的基因插入或基因缺失而缺乏以下 基因产物：SpoIIAC-、Biol-、NprE-、AprE-、AmyE-、SrfAC-。在三联启动子系统的控制下表 达该基因构建体（如描述于WO 99/43835中）。将编码氯霉素乙酰转移酶的基因用作标记 物（如描述于狄代丽柯森（Diderichsen)等人，1993,质粒（Plasmid) 30:312-315中）。
[0228] 选择一种表达克隆并且将其在500mL带挡板的锥形瓶（Erlenmeyer flask)中的 旋转摇床上培养，每个锥形瓶包含补充有34mg/l氯霉素的100mL基于酪蛋白的培养基。将 该克隆在37 °C培养3天并且通过SDS-PAGE分析测定成功的表达。
[0229] 实例 2 :
[0230] M5蛋白酶的表征和纯化
[0231] I) Protazyme AK 测定：
[0232] 底物：Protazyme AK片剂（交联和染色的酪蛋白；来自麦格酶公司（Megazyme))
[0233] 温度：受控的（测定温度）。
[0234] 测定缓冲液：100mM 琥珀酸，IOOmM HEPES，IOOmM CHES，IOOmM CABS，ImM CaC12， 150mM KC1，0. 01% Triton X-100,用 HCl 或 NaOH 调节至 pH 值 2· 0、3· 0、4· 0、5· 0、6· 0、7· 0、 8· 0、9· 0、10· 0、及 11. 0〇
[0235] 通过温和揽摔，将Protazyme AK片剂悬浮于2· Oml 0· 01 % Triton Χ-100中。将 500 μ 1的这种悬浮液和500 μ 1的测定缓冲液分散在艾本德管中并置于冰上。添加20 μ 1 蛋白酶样品（稀释在0.01% Triton Χ-100中）。通过将艾本德管转移至设定为测定温度 的艾本德恒温混勾仪（Eppendorf thermomixer)来启动测定。将管在艾本德恒温混勾仪上 在最高振摇速率（HOOrpm)下孵育30分钟。通过转移该管返回至冰浴停止孵育。随后将 管在冰冷的离心机中离心数分钟并将200 μ 1上清液转移至微量滴定板。读取0D650作为 蛋白酶活性的度量。在测定法中包含空白缓冲液（buffer blind)(代替酶）。
[0236] 来自变孢指孢囊菌的M5蛋白酶的纯化
[0237] 将来自实例1的培养上清液离心（26000x g，20min)并且将上清液小心地与沉 淀物倾析分开。上清液通过耐洁（Nalgene) 0. 2 μ m过滤装置过滤以便除去剩余芽孢杆菌 宿主细胞。将〇· 2 μ m滤液转移至G25塞法戴克斯（s印hadex)柱（来自GE医疗公司（GE Healthcare))上的 IOOmM H3B03, IOmM MES，2mM CaC12, pH 6。将经 G25 塞法戴克斯转移 的酶施加至在IOOmM H3B03，10mM MES，2mM CaC12, pH 6中平衡的杆菌肽琼脂糖柱（来自 Upfront色谱公司（Upfront chromatography))上。在用平衡缓冲液充分地洗涤该柱之后， 将 M5 蛋白酶用具有 25% (v/v)2-丙醇的 IOOmM H3B03，10mM MES，2mM CaC12，lM NaCl，pH 6洗脱。在G25塞法戴克斯柱上将洗脱峰转移到50mM H3B03,5mM MES，lmM CaC12，pH 8. 5。 将经G25塞法戴克斯转移的杆菌肽峰值施加到在50mM H3B03,5mM MES，lmM CaC12，pH 8. 5 中平衡的SOURCE 30Q柱（来自GE医疗公司）。在将柱用平衡缓冲液洗涤之后，将M5蛋白 酶以在相同缓冲液中的线性NaCl梯度（0->0. 5M)经五个柱体积进行洗脱。将来自该柱的 级分针对蛋白酶活性进行分析（使用在pH 7下的Protazyme AK测定法），并且合并峰级 分。用20% CH3C00H将该合并物的pH调节至6. 0。经pH调节的合并物是纯化的制剂并且 用于进一步表征。当通过SDS-PAGE分析该纯化的制剂时，考马斯染色的凝胶显示一个单一 的带。
[0238] 来自变孢指孢囊菌的M5蛋白酶的表征
[0239] 将Protazyme AK测定法用于获得pH-活性曲线和pH-稳定性曲线（在指示的pH 值下2小时之后的残余活性）。对于pH-稳定性曲线，将蛋白酶在不同测定缓冲液中稀释 7x以达到这些缓冲液的pH值并且然后在37°C下孵育2小时。在孵育之后，通过稀释于pH 7. 0测定缓冲液中，将蛋白酶孵育物的pH调节至相同的pH值。在pH 7. 0下，测量相对于样 品的残余活性，将其在稳定条件（5°C，pH 7.0)下保持。使用Protazyme AK测定法以获得 在pH 7. 0下的温度-活性曲线。结果示于表1-3中。
[0240] 表1 :在37 °C下的pH-活性曲线
[0242] 注释：活性是相对于酶的最佳pH而言。
[0243] 表2 :pH-稳定性曲线（在37°C下2小时之后的残余活性）
[0244]
[0245] 注释：活性是相对于样品的残余活性，将该样品保持在稳定条件（5°C，pH 7. 0) 下。
[0246] 表3 :在pH 7. 0处的温度活性曲线
[0249] 注释：活性是相对于酶的最佳温度而言。
[0250] 来自变孢指孢囊菌的M5蛋白酶的其他实验室测定表明它被1，10-菲咯啉和EDTA 抑制。
[0251] 通过埃德曼（EDMN)降解的N-末端测序揭示其是ATACATG。
[0252] 如通过SDS-PAGE所确定的相对分子量为约Mr = 37kDa，并且通过完整的分子量分 析确定的分子量是36658. ?a。
[0253] 成熟序列（来自MS数据、埃德曼降解数据和DNA测序）示于SEQ ID No: 1。
[0254] 来自这一成熟序列的计算的分子量是36658. 4Da。
[0255] 实例 3 :
[0256] M5蛋白酶在麦芽汁混浊减少中的作用
[0257] 在这个实例中使用Seq ID No: 1的M5蛋白酶。
[0258] 标准麦芽汁制备：向打浆烧杯里添加50.0 g研磨的麦芽（0.2mm)，连同200ml H20(50°C )和 3. Oml CaCl2溶液（11. Og CaCl 2 ·2Η20/500ι?1 H2O)。使用以下打浆曲线：50°C 持续20分钟、63 °C持续30分钟、72 °C持续20分钟、78 °C持续15分钟，冷却至20 °C (1°C加 热/分钟）。
[0259] 打衆之后，加入另外的水至300g并且通过沃特曼（Whatman)过滤器5971/2将麦 芽汁过滤。在此之后将麦芽汁的一个等分部分调节至PH6.0或pH 7.0、预加热至60°C并且 与对应于3. 2和15mg EP(酶蛋白）/升麦芽汁的量的M5蛋白酶在60°C孵育1小时。将对 照也在60°C下保持1小时（pH 6. 0或7. 0)，不经酶处理。
[0260] 该酶处理后，将麦芽汁持续煮沸15分钟并且此后冷却至15°C。
[0261 ] 通过根据西伯特（Siebert) 1997 (美国酿造化学协会杂志（J. Am. Soc. Brew. Chem. )55(2) :73-78, 1997)公开的方法修改的方法来测量麦芽汁中混浊。
[0262] 简言之，将25mL麦芽汁转移到一个25mL混浊测量仪室，添加15mL乙酸盐缓冲液 pH 4. 5、以300rpm搅拌1分钟并且测量EBC混浊单位（零值）。将混浊测量仪室放置在多 点搅拌器（300RPM)中并且添加0.47mL X 2Brewtan C溶液（200mg鞣酸/1L)至该麦芽汁 溶液中。孵育40分钟之后在2100AN浊度计上测量混浊EBC值。然后将在40分钟之后的 测量值减去背景值以给出麦芽汁中形成混浊的潜力的度量。表4中给出结果。
[0263] 表4 :麦芽汁的混浊测量结果
[0265] 从以上的表格中，显然，分别在60°C pH 6. 0和7. 0下与未经处理的对照相比，M5 蛋白酶可以减少高达42 %麦芽汁混浊。
[0266] 对于上面的条件，M5蛋白酶的蛋白降解模式证实无蛋白Z、LTPl或BDAI-I降解， 表明对重要泡沫蛋白没有损害。此外、SDS-PAGE结果还表明被认为包含泡沫活性蛋白的低 分子量（LMff)区域（10-15kDa)没有降解。
[0267] 实例 4 :
[0268] M5蛋白酶处理的麦芽汁的实验室发酵试验
[0269] 如实例3中所述产生一种标准麦芽汁。
[0270] 加热麦芽汁至60°C的孵育温度之前将麦芽汁-pH调节至6. 0。添加 M5蛋白酶至 达到浓度3. 2mg EP/升的麦芽汁并且孵育lh。然后将麦芽汁样品冷却至20°C并且使用乳 酸将麦芽汁pH调节至5. 3。煮沸之前，添加啤酒花到麦芽汁中持续40分钟以在啤酒中达到 计算的15EBC苦味单元的苦味。
[0271] 离心煮沸的麦芽汁以去除热凝固物。将增殖的酵母添加到麦芽汁中以便麦芽汁达 到2x IO7细胞/mL的浓度。于IL的带有松散连接的盖子的派热克斯（Pyrex)瓶中在12°C 发酵7天。到第5天，将该发酵培养液在145rpm下于定轨摇床上振荡。从第5天至第7天， 速度降低至120rpm。在发酵之后将这些样品储存在冰上5天。
[0272] 如实例3中所述在啤酒中进行混浊测量。
[0273] 使用以下程序来确定啤酒中的泡沫稳定性：
[0274] 在第一步骤中，通过将混浊的样品由沃特曼5971/2纸滤器过滤到脱脂的玻璃器皿 中除去酵母和剩余粗沉淀。将250mL滤液的等分部分转移到清洁的和脱脂的瓶（0.5L)并 且回火至20. (TC。通过在恒定CO2-压力与温度下间歇的振荡和静止将该啤酒碳酸化至 5. 75g C02/L。使用能够纠正温度偏差的标准NIBEM-T泡沫分析器（滨特尔-诺芮特哈夫 曼斯（Pentair-Norit Haffmans)，芬洛（Venlo)，NL)来确定泡沫稳定性。简言之，通过特 殊泡沫闪光装置将一个体积的啤酒发泡于一个标准化玻璃烧杯中。基于电导率测量，随着 玻璃杯中泡沫塌陷，将玻璃杯转移到含有可移动式电极系统的一个测量单元中。该仪器记 录泡沫塌陷的时间对距离。随着时间[in s]推移给出泡沫稳定性直至泡沫在垂直距离上 塌陷 30mm(NIBEM 30-值）。
[0275] 表5 :用M5蛋白酶处理麦芽汁对啤酒混浊和啤酒泡沫稳定性的影响
[0277] 实例 5 :
[0278] 在发酵中添加 M5蛋白酶的0. 5L实验室发酵
[0279] 如实例3中所述产生一种标准麦芽汁。
[0280] 将麦芽汁样品随后冷却至20°C并且使用乳酸将麦芽汁pH调节至5. 3。在煮沸40 分钟之前添加啤酒花到该麦芽汁以达到在啤酒中计算的15EBC苦味单元的苦味。离心煮沸 的麦芽汁以去除热凝固物。添加 M5蛋白酶连同以3. 2mg EP/升麦芽汁的浓度投入酵母。
[0281] 将增殖的酵母添加到麦芽汁中以便麦芽汁达到2x IO7细胞/mL的浓度。于IL的 带有松散连接的盖子的派热克斯（Pyrex)瓶中在12°C发酵7天。到第5天，将该发酵培养 液在145rpm下于定轨摇床上振荡。从第5天至第7天，速度降低至120rpm。在发酵之后将 这些样品储存在冰上5天。
[0282] 如实例3中所述在啤酒中进行混浊测量。
[0283] 使用以下程序来确定啤酒中的泡沫稳定性：
[0284] 在第一步骤中，通过将混浊的样品由沃特曼5971/2纸滤器过滤到脱脂的玻璃器 皿中除去酵母和剩余粗沉淀。将250mL滤液的等分部分转移到清洁的和脱脂的瓶（0. 5L) 并且回火至20. (TC。通过在恒定CO2-压力与温度下间歇的振荡和静止将该啤酒碳酸化至 5. 75g C02/L。使用能够纠正温度偏差的标准NIBEM-T泡沫分析器（滨特尔-诺芮特哈夫 曼斯（Pentair-Norit Haffmans)，芬洛（Venlo)，NL)来确定泡沫稳定性。简言之，通过特 殊泡沫闪光装置将一个体积的啤酒发泡于一个标准化玻璃烧杯中。基于电导率测量，随着 玻璃杯中泡沫塌陷，将玻璃杯转移到含有可移动式电极系统的一个测量单元中。该仪器记 录泡沫塌陷的时间对距离。随着时间[in s]推移给出泡沫稳定性直至泡沫在垂直距离上 塌陷 30mm(NIBEM 30-值）。
[0285] 表6 :在发酵中添加的M5蛋白酶对啤酒混浊和啤酒泡沫稳定性的影响
[0287] 实例 6 :
[0288] 就混浊减少测试M5蛋白酶变体
[0289] 通讨宙点诱夺构律夺体
[0290] 定点变体是构建自M5蛋白酶（SEQ ID NO: 1)，包括根据本发明的特定的取代。这 些变体是通过传统的克隆DNA片段制得（萨拉布鲁克（Sambrook)等人，分子克隆：实验室 手册（Molecular Cloning:A Laboratory Manual)，第2版，冷泉港，1989)，使用PCR连同正 确地设计的诱变寡核苷酸，这些寡核苷酸在所得序列中引入了所希望的突变。
[0291] 对应于希望的一个或多个突变位点侧翼的DNA序列合成诱变的寡核苷酸，其由限 定插入/缺失/取代的DNA碱基对分离。以此方式，构建并产生下表7中所列的变体。
[0292] 为了测试本发明的M5蛋白酶变体，将包含本发明的变体的突变DNA转化到一个感 受态枯草芽胞杆菌菌株并使用标准方案发酵（PS-1培养基，3-4天，37°C )。
[0293] 表7 :M5的变体
[0294]
[0296] 混沌减小实验
[0297] 在混浊减少实验中测试上述提及的M5蛋白酶变体。
[0298] 将标准麦芽（与实例3相同的）用于实验1。对于实验2和实验3,打浆中包括 25%小麦^/^)。
[0299] 对于该小麦内含物，使用以下打浆曲线：54°C持续20分钟，64°C持续60分钟，72°C 持续20分钟，以及8〇°C持续5分钟。在该打浆开始时根据供应商的推荐添加 CererrHx(H) PI u s MG 和 tlltrafli):⑩ Max。
[0300] M5蛋白酶变体的孵育条件：pH 5. 3,温度60°C，30分钟，并且酶剂量3. 2mg EP/1。
[0301] 结果示于表8中。
[0302] 表8示出了所有测试的M5蛋白酶变体（24个）具有麦芽汁混浊减少能力。
[0303] 表8 :混浊减少实验
[0304]
【主权项】
1. 一种具有蛋白酶活性的多肽，该多肽选自下组，该组由以下各项组成： (a) -种多肽，该多肽与SEQIDNO: 1的多肽具有至少60%序列一致性； (b) 由一种多核苷酸编码的一种多肽，该多核苷酸在低严格条件下与SEQIDN0:2的成 熟多肽编码序列杂交； (c) 一种多肽，该多肽由与SEQIDN0:2的多肽编码序列具有至少60%序列一致性的 多核苷酸编码； (d)SEQIDNO: 1的多肽的一种变体，该变体在一个或多个位置处包括取代、缺失和/或 插入；和 (e) (a)、（b)、（c)或⑷的多肽的一个片段，该片段具有蛋白酶活性。2. 如权利要求1所述的多肽，该多肽与SEQIDNO: 1的多肽具有至少65%、至少70%、 至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91 %、至少92%、至少93%、至少94%、至 少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%的序列一致性。3. -种包括如权利要求1-2中任一项所述的多肽的组合物。4. 一种分离的多核苷酸，该多核苷酸编码如权利要求1-2中任一项所述的多肽。5. -种核酸构建体或表达载体，该核酸构建体或表达载体包括如权利要求4所述的多 核苷酸，该多核苷酸可操作地连接至指导该多肽在一个表达宿主内产生的一个或多个控制 序列。6. -种重组宿主细胞，该重组宿主细胞包括如权利要求4所述的多核苷酸，该多核苷 酸可操作地连接至指导该多肽产生的一个或多个控制序列。7. -种产生如权利要求1-2中任一项所述的多肽的方法，该方法包括：在有益于产生 该多肽的条件下培养一种细胞，该细胞以其野生型形式产生该多肽。8. -种改进啤酒中胶体稳定性的方法，该方法包括在啤酒生产过程中向醪液和/或麦 芽汁中添加如权利要求1-2所述的多肽。9. 根据权利要求8所述的方法，其中接触是从5分钟至120分钟进行的。10. 根据权利要求8所述的方法，其中在打浆过程中添加该多肽。11. 根据权利要求8所述的方法，其中在滤清过程中添加该多肽。12. 根据权利要求8所述的方法，其中在喷洒过程中添加该多肽。13. 根据权利要求8所述的方法，其中在滤清后但在麦芽汁煮沸前添加该多肽。14. 根据权利要求8所述的方法，其中在发酵过程中添加该多肽。15. 如权利要求1-2所述的多肽在啤酒酿造中的用途。
【专利摘要】本发明涉及具有蛋白酶活性的分离的多肽和编码这些多肽的多核苷酸。本发明还涉及核酸构建体、载体、以及包括这些多核苷酸的宿主细胞，连同在啤酒生产中使用这些多肽的方法。
【IPC分类】C12C7/26, C12C7/24, C12G3/00, C12N9/52, C12H1/00, C12C5/00
【公开号】CN105378050
【申请号】CN201480021860
【发明人】M·S·博尔歇特, M·耶蒙森, P·R·厄斯特高, L·贝克加德, A·毛赫, H·P·赫尔特-汉森, A·M·B·弗雷德里克森, C·伦德, M·D·G·P·托斯卡诺
【申请人】诺维信公司
【公开日】2016年3月2日
【申请日】2014年4月11日
【公告号】EP2986701A1, US20160053211, WO2014170218A1