基 因、苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因（阿盖塞（Agaisse)和勒尔克吕（Lereclus)，1994,分 子微生物学（Molecular Microbiology) 13:97-107)、大肠杆菌Iac操纵子、大肠杆菌trc 启动子（埃贡（Egon)等人，1988,基因（Gene) 69:301-315)、天蓝链霉菌琼脂水解酶基因 (dagA)、以及原核β -内酰胺酶基因（维拉-卡马洛夫（Villa-Kamaroff)等人，1978， 美国国家科学院院刊（Proc. Natl. Acad. Sci. USA)75:3727-3731)、以及tac启动子（德 波尔（DeBoer)等人，1983,美国国家科学院院刊80:21-25)。其他启动子描述在吉尔伯 特（Gilbert)等人，1980,科学美国人（Scientific American)242:74-94 的"来自重组细 菌的有用蛋白质（Useful proteins from recombinant bacteria)"；以及在萨姆布鲁克 (Sambrook)等人，1989,见上文。串联启动子的实例披露在W099/43835中。
[0100]用于指导本发明的核酸构建体在丝状真菌宿主细胞中的转录的合适启动子的实 例是从以下各项的基因获得的启动子：构巢曲霉乙酰胺酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲 霉酸稳定性α -淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶（glaA)、米曲霉TAKA淀粉酶、米曲 霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶（W0 96/00787)、镶片 镰孢淀粉葡糖苷酶（W0 00/56900)、镶片镰孢Daria(W0 00/56900)、镶片镰孢QuinnOTO 00/56900)、米黑根毛霉（Rhizomucor miehei)脂肪酶、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木 霉β -葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切 葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖 酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉木聚糖酶III、里氏木霉β-木 糖苷酶、以及里氏木霉翻译延长因子，以及NA2-tpi启动子（一种修饰的启动子，其来自曲 霉属中性α-淀粉酶基因，其中未翻译的前导序列由曲霉属丙糖磷酸异构酶基因的未翻译 的前导序列替代；非限制性实例包括修饰的启动子，其来自黑曲霉中性α -淀粉酶的基因， 其中未翻译的前导序列由构巢曲霉或米曲霉丙糖磷酸异构酶基因的未翻译的前导序列替 代）；以及其突变型启动子、截短型启动子、以及杂合型启动子。其他启动子描述于美国专 利号 6, 011，147 中。
[0101] 在酵母宿主中，有用的启动子从以下的基因获得：酿酒酵母烯醇酶（ΕΝ0-1)、酿酒 酵母半乳糖激酶（GALl)、酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶（ADHUADH2/GAP)、酿 酒酵母丙糖磷酸异构酶（TPI)、酿酒酵母金属硫蛋白（CUPl)、以及酿酒酵母3-磷酸甘油酸 激酶。罗马诺斯（Romanos)等人，1992,酵母（Yeast)8:423-488描述了酵母宿主细胞的其 他有用的启动子。
[0102] 控制序列还可以是由宿主细胞识别以终止转录的一种转录终止子。该终止子可操 作地连接到编码该多肽的多核苷酸的3' -末端。在该宿主细胞中起作用的任何终止子都可 以用于本发明中。
[0103] 用于细菌宿主细胞的优选终止子是从克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶（aprH)、地衣芽 孢杆菌α-淀粉酶（amyL)以及大肠杆菌核糖体RNA (rrnB)的基因获得。
[0104] 用于丝状真菌宿主细胞的优选终止子是从以下各项的基因获得：构巢曲霉乙酰胺 酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α -葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀 粉酶、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶、里氏木霉β -葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏 木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内 切葡聚糖酶ΠI、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里 氏木霉木聚糖酶III、里氏木霉β -木糖苷酶以及里氏木霉翻译延长因子。
[0105] 用于酵母宿主细胞的优选终止子是从以下各项的基因获得：酿酒酵母烯醇酶、酿 酒酵母细胞色素 C (CYCl)以及酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶。用于酵母宿主细胞的其他 有用的终止子由罗马努斯等人，1992,见上文描述。
[0106] 控制序列还可以是启动子下游和基因的编码序列上游的mRNA稳定子区，其增加 该基因的表达。
[0107] 适合的mRNA稳定子区的实例是从以下获得的：苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因 (TO 94/25612)和枯草芽孢杆菌SP82基因（化（Hue)等人，1995,细菌学杂志（Journal of Bacteriology)177:3465-3471)〇
[0108] 该控制序列还可以是一个前导序列，一种对宿主细胞翻译很重要的非翻译mRNA 区域。该前导子可操作地连接到编码该多肽的多核苷酸的5'-末端。可以使用在宿主细胞 中具有功能的任何前导序列。
[0109] 用于丝状真菌宿主细胞的优选前导序列是从米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖 磷酸异构酶的基因获得。
[0110] 适用于酵母宿主细胞的前导序列从以下各项的基因获得：酿酒酵母烯醇酶 (EN0-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α因子、以及酿酒酵母醇脱氢酶/甘油 醛-3-磷酸脱氢酶（ADH2/GAP)。
[0111] 控制序列还可以是一种聚腺苷酸化序列，可操作地连接至该多核苷酸的3' -末端 并且当转录时由宿主细胞识别为将聚腺苷酸残基添加至所转录的mRNA的信号的序列。可 以使用在宿主细胞中起作用的任何多腺苷酸化序列。
[0112] 用于丝状真菌宿主细胞的优选多腺苷酸化序列是从以下各项的基因中获得的：构 巢曲霉邻氨基苯甲酸合成酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α -葡萄糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉 酶、以及尖孢镰刀菌胰蛋白酶样蛋白酶。
[0113] 对于酵母宿主细胞有用的多聚腺苷酸化序列在郭（Guo)和谢尔曼（Sherman)， 1995,分子细胞生物学（Mol. Cellular Biol. ) 15:5983-5990 中得以描述。
[0114] 控制序列也可以是编码与多肽的N-端连接并指导多肽进入细胞的分泌通路的信 号肽的信号肽编码区。多核苷酸的编码序列的5'-端可以固有地包括在翻译阅读框架中与 编码多肽的编码序列的区段天然地连接的一个信号肽编码序列。可替代地，编码序列5'末 端可以包括对于该编码序列是外源的信号肽编码序列。在编码序列不天然地包含信号肽编 码序列的情况下，可能需要外源信号肽编码序列。可替代地，外源信号肽编码序列可简单地 替换天然的信号肽编码序列以便增强该多肽的分泌。然而，可以使用指导所表达多肽进入 宿主细胞的分泌通路的任何信号肽编码序列。
[0115] 用于细菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是从以下各项的基因获得的信号肽编 码序列：芽孢杆菌属NCIB 11837产麦芽糖淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶、地衣芽 孢杆菌β -内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α -淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶（nprT、 nprS、nprM)以及枯草芽孢杆菌prsA。西蒙纳（Simonen)和帕尔瓦（Palva)，1993,微生物 学评论（Microbiological Reviews) 57:109-137 描述了另外的信号肽。
[0116] 用于丝状真菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是获得自以下项的基因的信号肽 编码序列：黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、特异腐质霉纤维素 酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶V、柔毛腐质霉脂肪酶以及米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶。
[0117] 对于酵母宿主细胞有用的信号肽获得自以下项的基因：酿酒酵母α -因子和酿酒 酵母转化酶。见上文，罗马诺斯（Romanos)等人（1992)描述了其他有用的信号肽编码序列。
[0118] 该控制序列还可以是编码位于多肽的N-末端处的前肽的一个前肽编码序 列。生成的多肽被称为前体酶（proenzyme)或多肽原（或者在一些情况下被称为酶原 (zymogen))。多肽原通常是无活性的并且可以通过从该多肽原上催化切割或自动催化切割 前肽而被转化成一种活性多肽。前肽编码序列可以从以下各项的基因获得：枯草芽孢杆菌 碱性蛋白酶（aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶（nprT)、嗜热毁丝霉漆酶（W0 95/33836)、米 黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、以及酿酒酵母α -因子。
[0119] 在信号肽序列和前肽序列二者都存在的情况下，该前肽序列定位成紧邻多肽的 N-末端并且该信号肽序列定位成紧邻该前肽序列的N-末端。
[0120] 还可能希望地是添加调控序列，这些调控序列相对于宿主细胞的生长来调节多肽 的表达。调节序列的实例是使得基因的表达响应于化学或物理刺激（包括调控化合物的存 在）而开启或关闭的那些序列。原核系统中的调控序列包括lac、tac以及trp操纵子系 统。在酵母中，可以使用ADH2系统或GALl系统。在丝状真菌中，可以使用黑曲霉葡糖淀粉 酶启动子、米曲霉TAKA α -淀粉酶启动子和米曲霉葡糖淀粉酶启动子、里氏木霉纤维二糖 水解酶I启动子以及里氏木霉纤维二糖水解酶II启动子。调节序列的其他实例是允许基 因扩增的那些。在真核系统中，这些调节序列包括在甲氨蝶呤存在下被扩增的二氢叶酸还 原酶基因以及用重金属扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况中，编码多肽的多核苷酸将与 调控序列可操作地连接。
[0121] 表达载体
[0122] 本发明还涉及包括本发明的多核苷酸、启动子、以及转录和翻译终止信号的重组 表达载体。不同的核苷酸和控制序列可以连接在一起以产生一个重组表达载体，这一重组 表达载体可以包括一个或多个便利的限制酶切位点以允许在这些位点处插入或取代编码 该变体的多核苷酸。可替代地，该多核苷酸可以通过将该多核苷酸或包括该多核苷酸的核 酸构建体插入用于表达的适当载体中来表达。在产生该表达载体时，该编码序列是位于该 载体中，这样使得该编码序列与该供表达的适当控制序列可操作地连接。
[0123] 重组表达载体可以是任何载体（例如，质粒或病毒），其能够方便地进行重组DNA 程序，并且能够引起多核苷酸的表达。载体的选择将典型地取决于该载体与有待引入该载 体的宿主细胞的相容性。该载体可以是一种线性的或闭合的环状质粒。
[0124] 载体可以是自主复制载体，即，作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色 体复制，例如，质粒、染色体外元件、微染色体或人工染色体。该载体可以包含用于确保自我 复制的任何装置。可替代地，该载体可以是这样一种载体，当它被引入该宿主细胞中时，被 整合到基因组中并且与其中已整合了它的一个或多个染色体一起复制。此外，可以使用单 一载体或质粒或两个或更多个载体或质粒（这些载体或质粒共同含有待引入到宿主细胞 的基因组中的总DNA)或转座子。
[0125] 该载体优选包含允许容易选择转化细胞、转染细胞、转导细胞或类似细胞的一个 或多个选择性标记。选择性标记是一种基因，该基因的产物提供了杀生物剂抗性或病毒抗 性、重金属抗性、营养缺陷型的原养型等。
[0126] 细菌性选择性标记的实例是地衣芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌dal基因，或赋予抗生 素抗性（例如氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素、新霉素、大观霉素或四环素抗性）的标记。 用于酵母宿主细胞的适合的标记包括但不限于ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1、以及 URA3。用于在丝状真菌宿主细胞中使用的选择性标记包括但不限于，adeA(磷酸核糖酰氨基 咪挫-琥泊羧胺合酶）、adeB (磷酸核糖酰-氨基咪唑合酶）、amdS (乙酰胺酶）、argB (鸟 氨酸氨甲酰基转移酶）、bar (草丁膦乙酰转移酶）、hph (潮霉素磷酸转移酶）、niaD (硝酸 还原酶）、pyrG (乳清酸核苷-5' -磷酸脱羧酶）、sC (硫酸腺苷基转移酶）、以及trpC (邻氨 基苯甲酸合酶）、连同其等效物。优选在曲霉属细胞中使用的是构巢曲霉或米曲霉amdS和 PyrG基因以及吸水链霉菌（Streptomyces hygroscopicus)bar基因。优选在木霉属细胞中 使用的是adeA、adeB、amdS、hph以及pyrG基因。
[0127] 选择性标记可以是在W02010/039889中描述的双选择性标记系统。在一方面，双 选择性标记是hph-tk双选择性标记系统。
[0128] 载体优选含有允许载体整合到宿主细胞的基因组中或载体在细胞中独立于基因 组自主复制的一个或多个元件。
[0129] 对于整合到该宿主细胞基因组中，该载体可以依靠编码该多肽的多核苷酸序列或 者用于通过同源或非同源重组整合到该基因组中的该载体的任何其他元件。可替代地，该 载体可以包含用于指导通过同源重组而整合到宿主细胞基因组中的一个或多个染色体中 的一个或多个精确位置处的另外的多核苷酸。为了增加在精确位置整合的可能性，这些整 合的元件应包含足够数量的核酸，例如100至10, OOO个碱基对、400至10, OOO个碱基对、以 及800至10, 000个碱基对，这些碱基对与对应的靶序列具有高度的序列一致性以提高同源 重组的可能性。这些整合元件可以是与宿主细胞的基因组内的靶序列同源的任何序列。此 外，这些整合元件可以是非编码多核苷酸或编码多核苷酸。另一方面，该载体可以通过非同 源重组整合到宿主细胞的基因组中。
[0130] 对于自主复制，载体可以进一步包括使该载体能够在所讨论的宿主细胞中自主复 制的复制起点。复制起点可以是在细胞中起作用的介导自主复制的任何质粒复制子。术语 "复制起点"或"质粒复制子"意指使质粒或载体能够在体内复制的多核苷酸。
[0131] 细菌复制起点的实例是允许在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177、 以及PACYC184的复制起点，以及允许在芽孢杆菌中复制的质粒pUB110、pE194、pTA1060、以 及ρΑΜβ 1的复制起点。
[0132] 用于在酵母宿主细胞中使用的复制起点的实例是2微米复制起点ARS1、ARS4、 ARSl与CEN3的组合以及ARS4与CEN6的组合。
[0133] 在丝状真菌细胞内有用的复制起点的实例是AMAl和ANS1(格姆斯（Gems)等 人，1991，基因（Gene)98:61_67;卡伦（Cullen)等人，1987，核酸研究（Nucleic Acids Res.) 15:9163-9175 ;W0 00/24883)。AMAl基因的分离和包括该基因的质粒或载体的构建 可根据WO 00/24883披露的方法完成。
[0134] 可以将本发明的多核苷酸的多于一个的拷贝插入到宿主细胞中以增加多肽的产 生。通过将序列的至少一个另外的拷贝整合到宿主细胞基因组中或者通过包含一个与该多 核苷酸一起的可扩增的选择性标记基因可以获得多核苷酸的增加的拷贝数目，其中通过在 适当的选择性试剂的存在下培养细胞可以选择包含选择性标记基因的经扩增的拷贝的细 胞、以及由此该多核苷酸的另外的拷贝。
[0135] 用于连接以上所描述的元件以构建本发明的重组表达载体的程序是本领域的普 通技术人员熟知的（参见，例如，萨姆布鲁克（Sambrook)等人，1989,见上文）。
[0136] 宿主细胞
[0137] 本发明还涉及重组宿主细胞，这些重组宿主细胞包括本发明的多核苷酸，该多核 苷酸可操作地连接至一个或多个控制序列，该一个或多个控制序列指导本发明的多肽的产 生。将包含多核苷酸的构建体或载体引入到宿主细胞中，这样使得该构建体或载体被维持 作为染色体整合体或作为自主复制的染色体外载体，如早前所描述。术语"宿主细胞"涵盖 由于复制期间发生的突变与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。宿主细胞的选择在很大 程度上取决于编码该多肽的基因及其来源。
[0138] 该宿主细胞可以是有用于重组产生本发明的多肽的任何细胞，例如原核细胞或真 核细胞。
[0139] 原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性细菌包括但 不限于：芽孢杆菌属、梭菌属、肠球菌属、土芽孢杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、海洋芽孢杆菌 属、葡萄球菌属、链球菌属以及链霉菌属。革兰氏阴性细菌包括但不限于：弯曲杆菌属、大肠 杆菌、黄杆菌菌、梭杆菌属、螺杆菌属、泥杆菌属、奈瑟氏菌属、假单胞菌属、沙门氏菌属以及 脲原体属。
[0140] 细菌宿主细胞可以是任何芽孢杆菌细胞，包括但不限于：嗜碱芽孢杆菌、解淀粉 芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、灿 烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆 菌、枯草芽孢杆菌以及苏云金芽孢杆菌细胞。
[0141] 细菌宿主细胞还可以是任何链球菌细胞，包括但不限于：似马链球菌、酿脓链球 菌、乳房链球菌以及马链球菌兽瘟亚种细胞。
[0142] 细菌宿主细胞还可以是任何链霉菌属细胞，包括但不限于：不产色链霉菌、除虫链 霉菌、天蓝链霉菌、灰色链霉菌以及浅青紫链霉菌细胞。
[0143] 将DNA引入芽孢杆菌属细胞中可通过以下来实现：原生质体转化（参见例如，张 (Chang)和科恩（Cohen)，1979,分子遗传学与基因组学（Mol. Gen. Genet.) 168:111-115)、 感受态细胞转化（参见，例如，杨格（Young)和斯皮宰曾（Spizizen)，1961，细菌学 杂志（J. Bacteriol.) 81:823-829 ;或杜拜努（Dubnau)以及大卫杜夫-阿贝尔森 (Davidoff-Abelson)，1971，分子生物学杂志（J. Mol. Biol. )56:209-221)、电穿孔（参见， 例如，茂川（Shigekawa)和道尔（Dower)，1988,生物技术（Biotechniques) 6:742-751)、或 者接合（参见，例如克勒（Koehler)和索恩（Thorne)，1987,细菌学杂志169:5271-5278)。 将DNA引入大肠杆菌细胞中可通过以下来实现：原生质体转化（参见例如，哈纳汗 (Hanahan)，1983,分子生物学杂志（J. Mol. Biol. ) 166:557-580)或电穿孔（参见例如， 道尔（Dower)等人，1988,核酸研究（Nucleic Acids Res.) 16:6127-6145)。将 DNA 引入 链霉菌属细胞中可通过以下来实现：原生质