再生期间或在后续世代中选择性 消除选择基因 ：例如，使用带有两个独立的T-DNA构建体的共转化或利用特异性重组酶位 点特异性地切除选择基因。
[0175] 除用本发明的构建体直接转化特定植物基因型外，还可以通过使具有该构建体的 植物与缺乏该构建体的第二植物进行杂交来产生转基因植物。例如，可以通过杂交将编码 多肽或结构域的构建体引入特定植物品种中，无需总是直接地转化该给定品种的植物。因 此，本发明不仅涵盖了从根据本发明已经转化的细胞直接再生的植物，而且还涵盖了这类 植物的后代。如在此使用的，后代可以是指根据本发明制备的亲本植物的任何代的后代。此 类后代可以包括根据本发明制备的DNA构建体。杂交导致通过供体植物系与起始系交叉授 粉，将转基因引入植物系。此类步骤的非限制性实例描述于美国专利号7, 151，204中。
[0176] 植物可以通过回交转化方法生成。例如，植物包括被称为回交转化的基因型、种 系、近交体、或杂交体的植物。
[0177] 可以使用遗传标记以协助本发明的一种或多种转基因从一个遗传背景渗入到另 一个。标记协助的选择提供了相对于常规育种的优势，在于其可以用于避免由表型变异导 致的错误。另外，遗传标记可以在具体杂交的个别后代中提供有关良种种质相对程度的数 据。例如，当具有所希望性状并且另外具有非农艺学所希望的遗传背景的植物与良种亲本 杂交时，可以使用遗传标记来选择不仅具有感兴趣的性状，还具有相对较大比例所希望种 质的后代。以此方式，使一种或多种性状渗入特定遗传背景所需的世代数得以最小化。
[0178] 本发明还涉及产生本发明的多肽或结构域的方法，这些方法包括（a)在有益于产 生该多肽或结构域的条件下培养转基因植物或植物细胞，该转基因植物或植物细胞包含编 码该多肽或结构域的多核苷酸；并且（b)回收该多肽或结构域。
[0179] 发酵液配制品或细胞组合物
[0180] 本发明还涉及包括本发明的多肽的一种发酵液配制品或细胞组合物。发酵液产物 进一步包含在发酵过程中使用的另外的成分，例如像，细胞（包括含有编码本发明的多肽 的基因的宿主细胞，这些宿主细胞被用于产生感兴趣的多肽）、细胞碎片、生物质、发酵介质 和/或发酵产物。在一些实施例中，该组合物是含有一种或多种有机酸、杀死的细胞和/或 细胞碎片以及培养基的细胞杀灭的全培养液。
[0181] 如在此使用的术语"发酵液"是指由细胞发酵产生、不经历或经历最低限的回收和 /或纯化的制剂。例如，当微生物培养物生长至饱和，在碳限制条件下孵育以允许蛋白质合 成（例如，由宿主细胞进行酶的表达）并且分泌到细胞培养基中时，产生发酵液。发酵液可 以包含在发酵结束时得到的发酵材料的未分级的或分级的内容物。典型地，发酵液是未分 级的并且包括用过的培养基以及例如通过离心去除微生物细胞（例如，丝状真菌细胞）之 后存在的细胞碎片。在一些实施例中，发酵液包含用过的细胞培养基、胞外酶以及有活力的 和/或无活力的微生物细胞。
[0182] 在一个实施例中，该发酵液配制品和细胞组合物包括一种第一有机酸组分（包括 至少一种1-5碳的有机酸和/或其盐）以及一种第二有机酸组分（包括至少一种6碳或 更多碳的有机酸和/或其盐）。在一个具体实施例中，该第一有机酸组分是乙酸、甲酸、丙 酸、其盐，或前述酸中的两种或更多种的混合物；并且该第二有机酸组分是苯甲酸、环己烷 羧酸、4-甲基戊酸、苯乙酸、其盐，或前述酸中的两种或更多种的混合物。
[0183] 在一个方面中，该组合物包含一种或多种有机酸，并且任选地进一步包含杀死的 细胞和/或细胞碎片。在一个实施例中，从细胞杀灭的全培养液中去除这些杀死的细胞和 /或细胞碎片，以提供不含这些组分的组合物。
[0184] 这些发酵液配制品或细胞组合物可以进一步包含一种防腐剂和/或抗微生物（例 如抑菌）剂，包括但不限于山梨醇、氯化钠、山梨酸钾、以及本领域中已知的其他试剂。
[0185] 该细胞杀灭的全培养液或组合物可以包含在发酵终止时得到的发酵物质的未分 级的内容物。典型地，该细胞杀灭的全培养液或组合物包含用过的培养基以及在微生物细 胞（例如，丝状真菌细胞）生长至饱和、在碳限制条件下孵育以允许蛋白质合成之后存在的 细胞碎片。在一些实施例中，细胞杀灭的全培养液或组合物含有用过的细胞培养基、胞外 酶、和杀死的丝状真菌细胞。在一些实施例中，可以使用本领域已知方法来使细胞杀灭的全 培养液或组合物中存在的微生物细胞透性化和/或裂解。
[0186] 在此描述的全培养液或细胞组合物典型地是液体，但是可以含有不溶组分，例如 杀死的细胞、细胞碎片、培养基组分、和/或一种或多种不溶性酶。在一些实施例中，可以除 去不溶性组分以提供澄清的液体组合物。
[0187] 可以通过WO 90/15861或WO 2010/096673所述的方法产生本发明的全培养液配 制品和细胞组合物。
[0188] 酶组合物
[0189] 本发明还涉及包含本发明的一种多肽的组合物。优选地，这些组合物富含这种多 肽。术语"富集"指示该组合物的蛋白酶活性已经增加，例如，以至少1. 1的一个富集因子。
[0190] 这些组合物可以包含本发明的多肽作为主要酶组分，例如单组分组合物。可替代 地，这些组合物可以包括多种酶活性，如一种或多种（例如，若干种）选自下组的酶，该组由 以下各项组成：水解酶、异构酶、连接酶、裂解酶、氧化还原酶、或转移酶，例如，α -半乳糖 苷酶、α -葡糖苷酶、氨肽酶、淀粉酶、β -半乳糖苷酶、β -葡糖苷酶、β -木糖苷酶、糖酶、羧 肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶、环糊精葡萄糖基转移酶、 脱氧核糖核酸酶、内切葡聚糖酶、酯酶、葡糖淀粉酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、变 聚糖酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、 转谷氨酰胺酶、或木聚糖酶。
[0191 ] 这些组合物可根据本领域已知的方法制备并且可以是液体或干燥组合物的形式。 可以根据本领域中已知的方法稳定这些组合物。
[0192] 下文中给出本发明的组合物的优选用途的实例。可以基于本领域已知的方法来确 定组合物的剂量和使用该组合物的其他条件。
[0193] 用途
[0194] 啤酒酿造的方法是本领域的普通技术人员熟知的。可以按照如下方式概述一种常 规程序：
[0195] 起始材料是发芽（即，使其潮湿或浸泡、萌发并且随后干燥）的大麦和/或未发 芽的附属物，其称为谷粉。在打浆过程中，其中将该谷粉研磨并与水混合，加热和搅拌，通过 在麦芽中天然存在的酶辅助降解包括碳水化合物的聚合物。
[0196] 打浆之后，有必要从从这些固体（用过的谷物颗粒和附属物颗粒）分离液体提取 物（麦芽汁）以得到一种澄清的麦芽汁。这种过程被描述为滤清。滤清之前，可以将醪液 温度升高至约75°C -78°C (称为煮浆）。麦芽汁过滤是重要的，因为固体富含大量蛋白、变 性不足的淀粉、脂类和脂肪酸、硅酸盐及多酚（鞣酸）以及蛋白。
[0197] 收集第一麦芽汁后留在酒糟中的提取物通过在滤清饼（lauter cake)的顶部添 加热水也可以被洗出。这一过程被叫做喷洒（sparging)。热水流过酒糟并溶解剩余的提 取物。稀释的麦芽汁被叫做第二麦芽汁，并且其提取物从第一麦芽汁的原始比重下降至 1%-2%。添加啤酒花后，煮沸麦芽汁。由此，许多物质（包括若干蛋白质）变性并且将发 生蛋白质-多酚络合物的沉淀。冷却并除去沉淀物后，为成品啤酒麦芽汁充气并添加酵母。 典型地持续5-10天的主发酵后，除去大部分酵母并且将所谓的生啤（green beer)储存在 低温度（典型地在0-5摄氏度）下1至12周。在此期间，剩余的酵母将与蛋白-多酚络合 物以及其他不可溶物质一起沉淀或沉积。为了除去剩余的过量分散颗粒，进行过滤。现在 可以在装瓶之前将发酵啤酒碳化。二氧化碳不仅有助于感观的"丰满（fullness)"或"大 量（body)"，它也赋予"麻刺感（tingling)"和"新鲜"。而且，它充当一种增味剂并且充当 具有发泡潜力的增强剂并且在延长产品的货架期中发挥重要作用。
[0198] 不被理论所束缚，据信在低温下或长时间的储存的啤酒中蛋白和多酚之间的相互 作用导致发展聚集物，这被称为混浊。由于混浊的形成影响啤酒的质量参数之一，即，胶体 稳定性，已经开发了阻止此类混浊形成的方法。在酿造过程中，在啤酒成熟过程中通过冷却 该液体来沉淀大部分的蛋白-多酚复合物。使用PVPP、硅胶、膨润土等去除任何剩余的多酚 和/或蛋白。
[0199] 另一种减少混浊形成的方法是通过使用蛋白酶。蛋白酶像木瓜蛋白酶被用来切割 这些蛋白，可能产生更低和/或更多可溶性蛋白-多酚聚集物。然而，使用这些酶还影响泡 沫形成和泡沫稳定所涉及的蛋白，进一步影响最终啤酒的质量。
[0200] 诸位发明人发现在啤酒生产过程中使醪液和/或麦芽汁与本发明的一种或多种 多肽接触导致改进的胶体稳定性和/或泡沫稳定性。诸位发明人还出人意料的发现在啤酒 生产过程中将醪液和/或麦芽汁与本发明的一种或多种多肽接触导致改进的胶体稳定性 而不显著影响泡沫稳定性。
[0201] 待根据本发明使用的一种或多种多肽优选地是纯化的。如在此使用的术语"纯化 的"涵盖酶蛋白制剂，其中该制剂已经富集了所讨论的酶蛋白。此类富集例如可以：除去产 生酶蛋白的生物体的细胞，通过蛋白特异性沉淀或使用色谱程序去除非蛋白质材料，其中 所讨论的酶蛋白被选择性地吸附并从一种色谱基质中洗脱。该一种或多种多肽可能已经纯 化至这样的程度，使得仅有少量的其他蛋白质是存在的。表述"其他蛋白"特别涉及其他的 酶。用于本发明的方法的一种或多种多肽可以是"基本上纯的"，即基本上不含其中产生该 多肽的生物体的其他组分，该生物体可以是一种天然存在的微生物或一种经遗传修饰的用 于重组产生该一种或多种多肽的宿主微生物。
[0202] 然而，针对根据本发明的用途，该一种或多种多肽不必那么纯。它可以，例如，包括 其他的酶。在一个优选的方面，用于本发明的方法中的一种或多种多肽已经被纯化以含有 总蛋白的至少20%、优选至少30%、至少40%或至少50% (w/w)的一种或多种多肽。
[0203] 在一个方面，该一种或多种多肽的接触是与一种醪液或麦芽汁或两者进行的。在 另一个方面，该一种或多种多肽的接触是与该醪液或与该打浆水或与该谷粉进行的。在一 个优选的方面中，与醪液的接触是在打浆过程中进行的。在一个方面中，与醪液的接触是在 煮浆过程中进行的。在另一个方面中，该接触是在滤清过程中进行的。在一个方面中，该接 触是在喷洒过程中进行的。在另一个方面中，该接触是与麦芽汁进行的。在一个方面中，该 一种或多种多肽被添加到麦芽汁中。在一个方面中，该接触是在滤清后进行的。在另一个 方面中，该接触是在滤清后但在麦芽汁煮沸之前进行的。在另一个方面中，该接触是在麦芽 汁煮沸后但在发酵之前进行的。在另一个优选方面中，该接触是在发酵过程中进行的。
[0204] 该接触是在取决于如下的温度下进行：该酶的最佳温度以及还有添加该酶的阶 段。本领域技术人员将知道如何计算该酶的最佳温度。为了本发明的目的，该接触通常 是在至少20°C的温度下进行的，例如，至少25°C、至少30°C、至少35°C、至少40°C、至少 45°C、至少50°C、至少55°C，优选地如至少60°C，例如至少65°C，更优选地如至少70°C，并 且最优选地如75°C _80°C。具体地，该接触是在约20°C -80°C范围内的温度下进行的，例如 30°C -80°C，例如约 40°C -80°C，优选地如约 50°C -80°C。
[0205] 在一个方面，该接触是在如下的一个时间段进行：在3分钟至5小时之间，例如在 5分钟至5小时之间，优选在5分钟和4小时之间，更优选在5分钟至180分钟之间，例如在 5分钟至120分钟之间，更优选在10分钟和120分钟之间并且最优选地在30分钟和90分 钟之间。
[0206] 用于接触的蛋白酶的量通常取决于不同的因素，例如但不限于蛋白酶的类型，蛋 白酶的活性等。为了本发明的目的，所使用的蛋白酶的量通常将是大约〇. Olmg至约IOOmg EP (酶蛋白）每升的底物，优选约0. 05至约50mg EP每升的底物，更优选约0. 1至约40mg EP每升的底物。
[0207] 具体地，所使用的酶的量通常将是大约0. 16mg至约16mg EP每升的麦芽汁，优选 地约0. 8mg至约8mg EP每升的麦芽汁。
[0208] 在一个方面，使用本发明的方法，该胶体稳定性相比于不存在一种或多种多肽的 情况下酿造的啤酒增加了至少10%、例如至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至 少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至 少75%、例如至少80%、例如至少81 %、例如至少82%、例如至少83%、例如至少84%、例 如至少85%、例如至少86%、例如至少87%、例如至少88%、例如至少89%、例如为至少 90 %、例如至少91 %、例如至少92 %、例如至少93 %、例如至少94%、例如至少95 %、例如至 少96%、例如至少97%、例如至少98%、例如至少99%、例如至少100%、例如至少101%、 例如至少102 %、例如至少103 %、例如至少104 %、例如至少105 %、例如至少106 %、例如 至少107%、例如至少108%、例如至少109%、例如至少110%。在另一个方面，相比于不存 在该一种或多种多肽的情况下酿造的啤酒，胶体稳定性增加范围是约10% -110%，例如约 20% -110%、30% _110%、40% -110%，优选约 50% -110%，更优选地范围是 60% -110%， 最优选范围是70% -110%，甚至最优选地范围是80% -110%。
[0209] 可以通过使用如在实例中描述的一种方法确定胶体稳定性。
[0210] 在一个方面，相比于不存在该一种或多种多肽的情况下酿造的啤酒，混浊减少至 少5%，例如，至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、 至少45 %、至少50 %、至少55%、至少60 %、至少65 %、至少70 %、至少75 %、例如至少 80 %、例如至少81 %、例如至少82 %、例如至少83 %、例如至少84%、例如至少85 %、例如至 少86%、例如至少87%、例如至少88%、例如至少89%、例如至少90%、例如在至少91%、 例如至少92%、例如至少93%、例如至少94%、例如至少95%、例如至少96%、例如至少 97%、例如至少98%、例如至少99%、例如至少100%。在另一个方面，相比于不存在该一 种或多种多肽的情况下酿造的啤酒，混浊减小范围是约5% -100%，例如约10% -100%、 30% _100%、40% -100%，优选约50% -100%，更优选地范围是60% -100%，最优选范围 是70% -100%，甚至最优选地范围是80% -100%。
[0211] 在另一个方面，相比于通过使用加工助剂加工的啤酒，本发明的方法导致混浊的 减少。
[0212] 为了在饮料中定量混浊的量，经常使用浊度计（也称为混浊度测量仪）。在浊度计 中测量光的量，其相对于入射光束的方向在前述的角度是散射的。浊度测量非常合适用于 测量形成的混浊（作为蛋白-多酚相互作用的结果）。可以例如通过使用如在实例中描述 的一种方法来测量混浊。
[0213] 在另一个方面，本发明的方法导致在酿造和储存过程中对加工助剂的使用降低以 减少混浊形成。在一个方面，该降低是100%，这意味着没有使用加工助剂。
[0214] 在另一个方面，啤酒是在未用二氧化硅稳定化并且优选地未用二氧化硅和PVPP 稳定化的情况下产生的。在一个方面，使用本发明的方法，相比于不存在本发明的一种或多 种多肽的情况下酿造的啤酒，泡沫稳定性是不受影响的。在一个方面，使用本发明的方法， 相比于使用一种加工助剂加工的啤酒该泡沫稳定性不受影响。
[0215] 在一个方面，相比于不存在本发明的一种或多种多肽的情况下酿造的啤酒，啤酒 的泡沫稳定性是至少80 %，例如81 %、82 %、83 %、84 %，像至少85 %，例如，86 %、87 %、 88%、89%，像至少90%，例如，90%、91%、92%、93%、94%，像至少95%，例如96%、97%、 98 %，像至少99 %。在另一个方面，相比于不存在本发明的一种或多种多肽的情况下酿造的 啤酒，啤酒的泡沫稳定性是在80 % -99 %范围内，例如，85 % -99 %、90 % -99 %、95 % -99 %。
[0216] 在另一个方面，相比于不存在加工助剂的情况下酿造的啤酒，啤酒的泡沫稳定性 是至少80%，例如81%、82%、83%、84%，像至少85%、例如，86%、87%、88%、89%，像至 少90%，例如，90%、91%、92%、93%、94%，像至少95%，例如96%、97%、98%，像至少 99%。在另一个方面，相比于不存在加工助剂的情况下酿造的啤酒，啤酒的泡沫稳定性是在 80% -99%范围内，例如，85% -99%、90% _99%、95% -99%。
[0217] 可以通过使用如在实例中描述的一种方法确定泡沫稳定性。
[0218] 在一个方面中，本发明涉及本发明的一种或多种多肽在酿造，特别是啤酒酿造中 的用途。在另一个方面中，本发明涉及在酿造，特别是啤酒酿造中使用本发明的一种或多种 多肽的方法。在另一个方面中，本发明涉及使用本发明的一种或多种多肽的酿造方法。
[0219] 通过以下实例进一步描述本发明，这些实例不应当解释为限制本发明的范围。
[0220] 实例
[0221] 实例 1 :
[0222] 来自变孢指孢囊菌JCM 3273的M5蛋白酶在枯草芽孢杆菌中的克隆和表达
[0223] 变孢指孢囊菌（菌株JCM 3273)近来已经被重归类为变孢糖丝菌（Saccharothrix variisporea)(金姆（Kim)等人，国际系统与进化微生物学杂志（Int J Syst Evol Microbiol.) ;2011 年 2月；61 (Pt 2):310-4)〇
[0224] M5蛋白酶基因来源于菌株号JCM 3273(日本微生物保藏中心（Japan Collection of Microorganisms))。
[0225] -种基于来自变孢指孢囊菌的M5蛋白酶的蛋白质序列的合成基因被设计为具有 SEQ ID N0:3的序列。（SEQ ID