快速检测单增李斯特菌的检测试纸及其制备和应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物残留物的快速检测研发技术领域，特别是涉及一种快速检测单增李斯特菌的检测试纸及其工业应用。
【背景技术】
[0002]目前，用于单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)的检测方法主要有传统检测方法和快速检测方法。传统检测方法存在检测周期长，程序繁琐的缺点，难以适应污染源快速诊断的需要。单增李斯特菌的快速检测，则主要包括聚合酶链式反应技术、免疫分析法、电化学方法及荧光法等。缺点是不但需要专门的实验设备，还需要专门的技术人员，不利于现场检测操作。商品化的快速检测方法包括特异性检验的培养基、检测试纸片等。一般是利用单增李斯特菌产特异性酶检测鉴定单增李斯特菌。单增李斯特菌能产生特异性磷脂酶C，而绝大部分沙门氏菌、大肠杆菌、志贺氏菌和耶尔森氏菌不能产生该酶，因此，可利用该酶底物有效检测单增李斯特菌，缺点是检测的时间一般都在24小时以上，检测时间还是较长，需要温箱培养等。
【发明内容】
[0003]本发明的目的在于:利用单增李斯特菌特异性酶与底物反应显色的特性结合液体物质在滤纸上自由扩散的原理，并确定酶与底物的最佳反应条件，建立能在5-6 h内检测被检样本的检测试纸，并将其运用于工业领域。采用本检测试纸，快速检测各种来源的单增李斯特菌，试纸本身制作工艺和操作简单，成本低廉，显色后肉眼直接快速判断结果。
[0004]本发明技术方案:(一)快速检测单增李斯特菌的检测试纸，在整体呈矩形的无菌标准试纸中从左至右依次设置着具有边界的大小相等的加样区，底物区及显色区三个功能区，相邻两区之间设置着流体通道，在底物区边界中设置着底物层。所述标准试纸长度为4cm，宽度为2cm。所述标准试纸可以为圆形。所述加样区，底物区及显色区整体呈圆形或矩形。所述加样区，底物区及显色区呈圆形，其直径为1.2cm。所述流体通道高度为0.3cm。所述底物层由5-溴-4-氯-3-吲羟肌醇磷酸铵X-1nP制成。
[0005](二)快速检测单增李斯特菌的检测试纸的制备方法，该制备方法有下述步骤组成:(1)取按照权利要求1所述的标准试纸，无菌处理后备用；(2)将底物溶液加入步骤(I)中制备好的标准试纸中的底物层区中，其中所述的底物为:5_溴-4-氯-3-吲羟肌醇磷酸钱X-1nP，其浓度为2 mg/ml或4 mg/ml或8 mg/ml，pH为7.0或7.5或8.0 ;在底物层区中温度为25°C或37°C或40°C，停留反应时间为0.5h或I h或2 h ;然后(3)将步骤(2)中制备好的含有底物溶液的标准试纸烘干，即制备成检测试纸。步骤(2)中的最优方案为:X-1nP溶液浓度为8 mg/ml，pH为7.5，温度为40°C，停留反应时间为0.5 h。
[0006](三)快速检测单增李斯特菌的检测试纸的应用方法，包括将如上述所定义的检测试纸运用到所述单增李斯特菌的检测步骤中。
[0007]所述的标准滤纸为Whatman滤纸，市售可得。所述的5_溴_4_氯_3_吲羟肌醇磷酸铵X-1nP底物为Sigma公司生产，市售可得。
[0008]本发明的技术原理:单增李斯特菌能产生特异性磷脂酶C，而绝大部分沙门氏菌、大肠杆菌、志贺氏菌和耶尔森氏菌不能产生该酶，而且自然环境中一般不存在该酶，该酶能与5-溴-4-氯-3-吲羟肌醇磷酸铵(X-1nP)发生化学反应，生成有色物质。因此，可利用这些底物有效检测单增李斯特菌。本发明用Whatman滤纸做成检测试纸，底物X-1nP在磷脂酶C的催化下会产生蓝色产物，将含有单增李斯特菌的增菌培养液滴加到试纸上时，经扩散后其中的酶与底物相遇发生特异性化学反应，会出现肉眼可见的蓝色产物，从而达到快速检测的目的。
[0009]有益效果:本发明克服现有的检测方法操作繁杂，时间较长之不足。在确定了底物与酶反应的最佳条件之后，只要在该试纸上滴加5小时增菌液后，针对单增李斯特菌样本，I小时内可以出现蓝色，可以判断是否为单增李斯特菌，操作极其简单快捷，检测效果显著。该检测试纸主要用于饮用水、肉食品、乳制品、蔬菜等的单增李斯特菌污染的快速定性检测鉴定。
【附图说明】
[0010]本发明结合附图作进一步说明。
[0011]图1为本发明检测试纸的主视结构示意图。
【具体实施方式】
[0012]实施例1、快速检测单增李斯特菌的检测试纸，如图1所示，在整体呈矩形的无菌标准试纸I中从左至右依次设置着具有边界的大小相等的加样区2，底物区3及显色区4三个功能区，相邻两区之间设置着流体通道5，在底物区3边界中设置着底物层6。所述标准试纸I长度为4cm，宽度为2cm。所述标准试纸I可以为圆形。所述加样区2，底物区3及显色区4整体呈圆形或矩形。所述加样区2，底物区3及显色区4呈圆形，其直径为1.2cm。所述流体通道5高度为0.3cm。所述底物层6由5-溴-4-氯-3-吲羟肌醇磷酸铵X-1nP制成。
[0013]实施例2、快速检测单增李斯特菌的检测试纸的制备方法，该制备方法有下述步骤组成:(1)取按照实施例1所述的标准试纸，无菌处理后备用；(2)将底物溶液加入步骤
(I)中制备好的标准试纸中的底物层区中，其中所述的底物为:5_溴-4-氯-3-吲羟肌醇磷酸钱X-1nP，其浓度为2 mg/ml或4 mg/ml或8 mg/ml，pH为7.0或7.5或8.0 ;在底物层区中温度为25°C或37°C或40°C，停留反应时间为0.5h或I h或2 h ;然后(3)将步骤(2)中制备好的含有底物溶液的标准试纸烘干，即制备成检测试纸。步骤(2)中的最优方案为:X-1nP溶液浓度为8 mg/ml，pH为7.5，温度为40°C，停留反应时间为0.5 h。
[0014]实施例3、快速检测单增李斯特菌的检测试纸的应用方法，包括将如上述所定义的检测试纸运用到所述单增李斯特菌的检测步骤中。
[0015]实施例4、( I)将浓度为8mg/ml、pH为7.5的购自Sigma公司的5-溴-4-氯-3- 口引轻肌醇磷酸钱(X-1nP)无菌水溶液滴加到长4cm，宽2cm的Whatman滤纸的一端制作成检测试纸，如图在B处滴加X-1nP，制作成检测试纸；其中以X-1nP为底物，浓度为8mg/ml，pH为7.5，40°C，反应时间为0.5ho
[0016](2)按照相关要求采集被检样品样本，按国标要求做增菌，在9mL脑心浸液培养基中加入ImL无菌生理盐水处理的样液，培养5小时后用于检测。如图1，将增菌液直接滴加到检测试纸的加样区2处，当单增李斯特菌存在时，I小时内在试纸的显色区4处形成肉眼可见蓝色的物质。
[0017]说明:单增李斯特菌的检测试纸，加样区2和显色区4是分开的，靠扩散作用使酶与底物相遇发生化学反应而显色；该单增李斯特菌的检测试纸，检测的对象是样本增菌液。
[0018]本检测试纸主要用于乳制品、肉制品、蔬菜、用水等的单增李斯特菌快速检测，总时间不超过6小时。
[0019]本发明的创新点:利用单增李斯特菌特异性酶与底物反应显色的特性结合液体物质在滤纸上自由扩散的原理，并确定酶与底物的最佳反应条件，建立能在5-6 h内检测被检样本的检测试纸，并将其运用于工业领域。的制作工艺，这种试纸的成本低廉，操作简单，还大大缩短了检测时间。
【主权项】
1.快速检测单增李斯特菌的检测试纸，其特征在于:在整体呈矩形的无菌标准试纸(I)中从左至右依次设置着具有边界的大小相等的加样区(2)，底物区(3)及显色区(4)三个功能区，相邻两区之间设置着流体通道(5)，在底物区(3)边界中设置着底物层(6)。
2.根据权利要求1所述的检测试纸，其特征在于:所述标准试纸(I)长度为4cm，宽度为 2cm。
3.根据权利要求1所述的检测试纸，其特征在于:所述标准试纸(I)可以为圆形。
4.根据权利要求1所述的检测试纸，其特征在于:所述加样区(2)，底物区(3)及显色区(4)整体呈圆形或矩形。
5.根据权利要求1所述的检测试纸，其特征在于:所述加样区(2)，底物区(3)及显色区(4)呈圆形，其直径为1.2cm。
6.根据权利要求1所述的检测试纸，其特征在于:所述流体通道(5)高度为0.3cm。
7.根据权利要求1所述的检测试纸，其特征在于:所述底物层(6)由5-溴-4-氯-3-吲羟肌醇磷酸铵X-1nP制成。
8.快速检测单增李斯特菌的检测试纸的制备方法，其特征在于:该制备方法有下述步骤组成:(1)取按照权利要求1所述的标准试纸，无菌处理后备用；(2)将底物溶液加入步骤(I)中制备好的标准试纸中的底物层区中，其中所述的底物为:5_溴-4-氯-3-吲羟肌醇磷酸钱X-1nP,其浓度为2 mg/ml或4 mg/ml或8 mg/ml,pH为7.0或7.5或8.0 ;在底物层区中温度为25°C或37°C或40°C，停留反应时间为0.5h或I h或2 h ;然后(3)将步骤(2)中制备好的含有底物溶液的标准试纸烘干，即制备成检测试纸。
9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于:步骤(2)中的最优方案为:X-1nP溶液浓度为8 mg/ml，pH为7.5，温度为40°C，停留反应时间为0.5 h。
10.快速检测单增李斯特菌的检测试纸的应用方法，其特征在于:包括将如权利要求8所定义的检测试纸运用到所述单增李斯特菌的检测步骤中。
【专利摘要】本发明涉及快速检测单增李斯特菌的检测试纸及其工业应用，该检测试纸整体呈矩形，包括加样区，底物区及显色区三个功能区，相邻两区之间设置着流体通道，在底物区边界中设置着底物层。检测试纸的制备方法有下述步骤组成：（1）取按照上述的标准试纸，无菌处理后备用；（2）将底物溶液加入底物层区中，其中所述的底物为：5-溴-4-氯-3-吲羟肌醇磷酸铵X-InP，其浓度为2mg/ml或4mg/ml或8mg/ml，pH为7.0或7.5或8.0；在底物层区中温度为25℃或37℃或40℃，停留反应时间为0.5h或1 h或2 h；然后（3）将步骤（2）中制备好的含有底物溶液的标准试纸烘干，即制备成检测试纸。该检测试纸主要用于饮用水、肉食品、乳制品、蔬菜等的单增李斯特菌污染的快速定性检测鉴定。
【IPC分类】C12Q1-04, C12R1-01
【公开号】CN104830952
【申请号】CN201510274726
【发明人】姚刚, 张军涛, 苏战强, 刘英玉, 钟旗, 夏利宁, 陶刚, 张晓红
【申请人】新疆农业大学
【公开日】2015年8月12日
【申请日】2015年5月26日