一种鉴别牛结核分枝杆菌和人结核分枝杆菌的方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于医学检验领域，具体涉及一种鉴别牛结核分枝杆菌和人结核分枝杆菌 的方法及其应用。
【背景技术】
[0002] 结核病是最严重的流行性传染疾病之一，使人类的公共健康面临着巨大的挑战。 它在全世界范围内有着相当高的致病率和致死率。结核分枝杆菌复合群（MTBC)中的一些 菌种是引发人类和动物结核病的病原菌。引起人类结核病的主要病原菌一一人结核分枝杆 菌（M.tuberculosis)起源于大约3百万年前，并因耐药株的出现持续影响着人类健康。除 了人结核分枝杆菌，作为牛结核病主要病原菌的牛分枝杆菌也会导致人的结核病。
[0003] 传统的鉴定牛结核分枝杆菌和人结核分枝杆菌的方法是根据烟酸累积、硝酸盐还 原酶的活性、对吡嗪酰胺（PZA)天然耐药性以及在含有对硝基苯甲酸（PNB)和噻吩二羧 酸肼（TCH)均敏感作为牛结核分枝杆菌的实验室诊断标准，这些方法都制约于缓慢的细 菌培养，而且涉及主观解读易于判错。传统的鉴定方法由于时间长等原因已不能满足当 前的临床需要，因此快速鉴定牛结核分枝杆菌和人结核分枝杆菌，对于控制传染源和早期 治疗起着至关重要的作用，也可为临床治疗提供用药指导。现今的分子鉴别方法主要有 IS6110-RFLP、Spoligotyping和单核苷酸多态性（SNP)。IS6110-RFLP应用广泛，分辨率较 高，但该方法基于大量菌株的培养，价格高，时间长且IS6110拷贝数较少的菌株不易分型； Spoligotyping分型方法用时较短，成本较低，但分辨率较低，易产生假阳性；SNP需要测 序，价格昂贵，不能在实验室间推广。
[0004] 从1985年Mullis创建了聚合酶链式反应（PCR)技术，到1989年Hance等首先将 该技术应用于检测分枝杆菌，再到1990年我国引进该项技术，从而开辟了以PCR为代表的 分子生物学技术检测结核分枝杆菌阶段。可变数目串联重复序列（VNTR)技术是基于PCR 和琼脂糖电泳基础上的一类基因分型技术。
【发明内容】
[0005] 本发明的一个目的是提供检测ETR-A、ETR-D、QUB-26、MIRU-20、MIRU-26 和 MIRU-276这6个VNTR位点的物质的用途。
[0006] 本发明提供了检测ETR-A、ETR-D、QUB-26、MIRU-20、MIRU-26 和MIRU-276 这 6 个 VNTR位点的物质在制备鉴定或辅助鉴定待测菌株是否为牛型结核分枝杆菌或人型结核分 枝杆菌的产品中的应用；
[0007] 本发明还提供了检测ETR-A、ETR-D、QUB-26、MIRU-20、MIRU-26 和MIRU-276 这 6 个VNTR位点的物质在制备区分或辅助区分牛型结核分枝杆菌和人型结核分枝杆菌的产品 中的应用。
[0008] 本发明还提供了检测ETR-A、ETR-D、QUB-26、MIRU-20、MIRU-26 和MIRU-276 这 6 个VNTR位点的物质在制备对牛型结核分枝杆菌和人型结核分枝杆菌进行基因分型或聚类 分析的产品中的应用。
[0009] 上述应用中，所述ETR-A的核苷酸序列为序列19 ;所述ETR-D的核苷酸序列为序 列20 ;所述QUB-26的核苷酸序列为序列21 ;所述MIRU-20的核苷酸序列为序列22 ;所述 MIRU-26的核苷酸序列为序列23 ;所述MIRU-276的核苷酸序列为序列24。
[0010] 上述应用中，所述检测ETR-A、ETR-D、QUB-26、MIRU-20、MIRU-26 和MIRU-27 这 6 个VNTR位点的物质包括如下1)或2):
[0011] 1)鉴定或辅助鉴定待测菌株是否为牛型结核分枝杆菌或人型结核分枝杆菌的产 品；
[0012] 2)区分或辅助区分牛型结核分枝杆菌和人型结核分枝杆菌的产品。
[0013] 上述应用中，所述检测ETR-A、ETR-D、QUB-26、MIRU-20、MIRU-26 和MIRU-27 这 6 个VNTR位点的物质包括如下1)或2)或3)或4):
[0014] 1)检测ETR-A、ETR-D、QUB-26、MIRU-20、MIRU-26 和MIRU-27 这 6 个VNTR位点的 拷贝数的物质；
[0015] 2)扩增所述6个VNTR位点的成套引物；
[0016] 3)含有所述2)的PCR试剂组；
[0017] 4)含有所述2)或所述3)的试剂盒。
[0018] 上述应用中，所述扩增所述6个位点的成套引物由引物对1、引物对2、引物对3、引 物对4、引物对5和引物对6组成；
[0019] 所述引物对1由SEQIDNo. 1所示的单链DNA和SEQIDNo. 2所示的单链DNA组 成；所述引物对1扩增所述ETR-A位点；
[0020] 所述引物对2由SEQIDNo. 3所示的单链DNA和SEQIDNo. 4所示的单链DNA组 成；所述引物对2扩增所述ETR-D位点；
[0021] 所述引物对3由SEQIDNo. 5所示的单链DNA和SEQIDNo. 6所示的单链DNA组 成；所述引物对3扩增所述QUB-26位点；
[0022] 所述引物对4由SEQIDNo. 7所示的单链DNA和SEQIDNo. 8所示的单链DNA组 成；所述引物对4扩增所述MIRU-20位点；
[0023] 所述引物对5由SEQIDNo. 9所示所示的单链DNA和SEQIDNo. 10所示的单链 DNA组成；所述引物对5扩增所述MIRU-26位点；
[0024] 所述引物对6由SEQIDNo. 11所示的单链DNA和SEQIDNo. 12所示的单链DNA 组成；所述引物对6扩增所述MIRU-27位点；
[0025] 所述PCR试剂组由PCR试剂1、PCR试剂2、PCR试剂3、PCR试剂4、PCR试剂5和 PCR试剂6组成；
[0026] 所述PCR试剂1包括所述成套引物中的引物对1 ;
[0027] 所述PCR试剂2包括所述成套引物中的引物对2 ;
[0028] 所述PCR试剂3包括所述成套引物中的引物对3 ;
[0029] 所述PCR试剂4包括所述成套引物中的引物对4 ;
[0030] 所述PCR试剂5包括所述成套引物中的引物对5 ;
[0031] 所述PCR试剂6包括所述成套引物中的引物对6。
[0032] 本发明的另一个目的是提供一种具有如下1)或2)功能的产品：
[0033] 1)鉴定或辅助鉴定待测菌株是否为牛结核分枝杆菌或人结核分枝杆菌；
[0034] 2)区分或辅助区分牛结核分枝杆菌和人结核分枝杆菌。
[0035] 本发明提供的产品包括检测ETR-A、ETR-D、QUB-26、MIRU-20、MIRU-26 和MIRU-27 这6个VNTR位点的物质。
[0036] 上述产品中，所述检测ETR-A、ETR-D、QUB-26、MIRU-20、MIRU-26 和MIRU-27 这 6 个VNTR位点的物质包括如下1)或2)或3)或4):
[0037] 1)检测ETR-A、ETR-D、QUB-26、MIRU-20、MIRU-26 和MIRU-27 这 6 个VNTR位点的 拷贝数的物质；
[0038] 2)扩增所述6个VNTR位点的成套引物；
[0039] 3)含有所述2)的PCR试剂组；
[0040] 4)含有所述2)或所述3)的试剂盒。
[0041] 上述产品中，所述扩增所述6个位点的成套引物由引物对1、引物对2、引物对3、引 物对4、引物对5和引物对6组成；
[0042] 所述引物对1由SEQIDNo. 1所示的单链DNA和SEQIDNo. 2所示的单链DNA组 成；所述引物对1扩增所述ETR-A位点；
[0043] 所述引物对2由SEQIDNo. 3所示的单链DNA和SEQIDNo. 4所示的单链DNA组 成；所述引物对2扩增所述ETR-D位点；
[0044] 所述引物对3由SEQIDNo. 5所示的单链DNA和SEQIDNo. 6所示的单链DNA组 成；所述引物对3扩增所述QUB-26位点；
[0045] 所述引物对4由SEQIDNo. 7所示的单链DNA和SEQIDNo. 8所示的单链DNA组 成；所述引物对4扩增所述MIRU-20位点；
[0046] 所述引物对5由SEQIDNo. 9所示所示的单链DNA和SEQIDNo. 10所示的单链 DNA组成；所述引物对5扩增所述MIRU-26位点；
[0047] 所述引物对6由SEQIDNo. 11所示的单链DNA和SEQIDNo. 12所示的单链DNA 组成；所述引物对6扩增所述MIRU-27位点；
[0048] 所述PCR试剂组由PCR试剂1、PCR试剂2、PCR试剂3、PCR试剂4、PCR试剂5和 PCR试剂6组成；
[0049] 所述PCR试剂1包括所述成套引物中的引物对1 ;
[0050] 所述PCR试剂2包括所述成套引物中的引物对2 ;
[0051] 所述PCR试剂3包括所述成套引物中的引物对3 ;
[0052] 所述PCR试剂4包括所述成套引物中的引物对4 ;
[0053] 所述PCR试剂5包括所述成套引物中的引物对5 ;
[0054] 所述PCR试剂6包括所述成套引物中的引物对6。
[0055] 本发明最后一个目的是提供一种鉴别或辅助鉴别待测菌株为牛结核分枝杆菌还 是人结核分枝杆菌的方法。
[0056] 本发明提供的鉴别或辅助鉴别待测菌株为牛结核分枝杆菌还是人结核分枝杆菌 的方法包括如下步骤：
[0057] 1)采用上述产品中的成套引物分别对待测菌株进行PCR扩增，得到6个PCR扩增 产物；检测所述6个PCR扩增产物；
[0058] 2)根据待测菌株的6个PCR扩增产物的大小，分别计算待测菌株在每一个引物对 对应的VNTR位点的拷贝数；
[0059] 所述拷贝数的计算公式：待测样本VNTR位点拷贝数=(待测样本VNTR位点的PCR 扩增产物长度-人结核分枝杆菌M.tuberculosisH37Rv在VNTR位点的PCR产物长度）+ 人结核分枝杆菌M.tuberculosisH37Rv在VNTR位点的重复序列长度+人结核分枝杆菌 M.tuberculosisH37Rv的VNTR位点的拷贝数；
[0060] 3)将待测菌株每一个引物对对应的VNTR位点的拷贝数与牛型分枝杆菌和人结核 分枝杆菌的相同引物对对应的VNTR位点的拷贝数进行比较；
[0061] A、若待测菌株6对引物对对应的VNTR位点的拷贝数至少有4个与人结核分枝杆 菌相同引物对对应的VNTR位点的拷贝数相同，则待测菌株为或候选为人结核分枝杆菌；
[0062] B、若待测菌株6对引物对对应的VNTR位点的拷贝数少于4个与人结核分枝杆菌 相同引物对对应的VNTR位点的拷贝数相同，则待测菌株不为或候选不为人结核分枝杆菌；
[0063] C、若待测菌株6对引物对对应的VNTR位点的拷贝数至少有4个与牛结核分枝杆 菌相同引物对对应的VNTR位点的拷贝数相同，则待测菌株为或候选为牛结核分枝杆菌；
[0064] D、若待测菌株6对引物对对应的VNTR位点的拷贝数少于4个与人结核分枝杆菌 相同引物对对应的VNTR位点的拷贝数相同，则待测菌株不为或候选不为牛结核分枝杆菌。
[0065] 上述方法中，所述人结核分枝杆菌M.tuberculosisH37Rv在引物对1对应的VNTR 位点的PCR产物大小为397bp、重复序列长度的大小为75bp;
[0066] 所述人结核分枝杆菌M.tuberculosisH37Rv在引物对2对应的VNTR位点的PCR 产物大小为312bp，重复序列长度的大小为77bp;
[0067] 所述人结核分枝杆菌M.tuberculosisH37Rv在引物对3对应的VNTR位点的PCR 产物大小为708bp，重复序列长度的大小为lllbp;
[0068] 所述人结核分枝杆菌M.tuberculosisH37Rv在引物对4对应的VNTR位点的PCR 产物大小为591bp，重复序列长度的大小为77bp;
[0069] 所述人结核分枝杆菌M.tuberculosisH37Rv在引物对5对应的VNTR位点的PCR 产物大小为438bp，重复序列长度的大小为51bp;
[0070] 所述人结核分枝杆菌M.tuberculosisH37Rv在引物对6对应的VNTR位点的PCR 产物大小为657bp，重复序列长度的大