结核分枝杆菌tb-sa抗体胶体金法检测试剂盒及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了结核分枝杆菌TB-SA抗体胶体金法检测试剂盒及其制备方法，检测试剂盒由试纸条和加样缓冲液组成，试纸条由检测线包被有TB-SA抗原、质控线包被有羊抗人多抗的硝酸纤维素膜、胶体金标记的SPA蛋白吸附在聚酯膜上的金标垫、样品垫和吸水纸组成。加样缓冲液为含有表面活性剂的PB溶液。检测试剂盒的制备方法包括试纸条的制备和加样缓冲液的制备。本发明结核分枝杆菌TB-SA抗体胶体金法检测试剂盒具有快速、简便、准确、成本低廉、特异性好和灵敏度高的特点，测试结果在5到15分钟内读取。制备该试剂盒的方法操作简单，制备方便、适宜于工业化大规模生产。
【专利说明】结核分枝杆菌TB-SA抗体胶体金法检测试剂盒及其制备方 法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种抗体检测试剂盒及其制备方法，具体涉及一种结核分枝杆菌 TB-SA抗体胶体金法检测试剂盒及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 结核病、艾滋病与疟疾一起，被视为至今影响全球公共卫生的三大疾病，结核病是 我国重点控制的重大疾病之一，也是全球关注的公共卫生问题和社会问题。
[0003] 据世界卫生组织（WHO)和全国第五次结核病流行病学调查显示：目前全球有近 1/3的人口感染结核分枝杆菌，每年有约800万新病例发生，接近300万人死于该病。中国 是全球22个结核病高负担国家之一，结核病患者数量居世界第二位。目前有肺结核病人 约450万，结核病年发病人数约130万，我国肺结核的发病率为459/10万人，占全球发病的 14. 3%，每年因结核病死亡人数达13万，大大超过其他传染病死亡人数的总和。
[0004] 结核病是人畜共患传染病，可感染各个阶段的人群，第五次流行病学调查显示，随 着年龄的增长，结核病人的发病率增加。有报道显示，一个传染性结核病人一年内可能传染 10?15人。面对如此严峻的形势，我们应该及早采取措施。结核病的早期诊断及有效治疗 是结核病预防工作的重中之重，对于控制结核菌传播有着重要的临床意义。目前国内大多 数医院根据直接涂片镜检和结核分枝杆菌培养技术对活动性结合进行诊断。结核菌涂片检 测虽然简单易行且准确性高，但阳性率低。结核菌培养检测可信度高，但耗时较长，不能满 足临床需求。此外，结核菌素皮试（PPD)试验所用抗原为结核分枝杆菌粗提的抗原混合物， 和许多非结核分枝杆菌及卡介苗（BCG)均存在共同抗原成分，从而导致该法用于结核病诊 断特异性差。中国是结核病高度流行区，由于广泛接种BCG，也造成PH)实验假阳性率很高， 所以临床上只能根据pro实验皮肤的反应强弱给予辅助诊断。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的即在于克服现有技术的不足，提供一种可快速定性检测样本中的结 核分枝杆菌TB-SA抗体胶体金法检测试剂盒。
[0006] 本发明的另一目的在于提供结核分枝杆菌TB-SA抗体胶体金法检测试剂盒的制 备方法。
[0007] 本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：结核分枝杆菌TB-SA抗体胶体金法 检测试剂盒，它由试纸条和加样缓冲液组成，所述试纸条所述试纸条包括包被有TB-SA抗 原、质控线包被有羊抗人多抗的硝酸纤维素膜、胶体金标记的SPA蛋白吸附在聚酯膜上的 金标塾、样品塾和吸水纸；
[0008] 所述结核分枝杆菌TB-SA抗原为无色透明液体，浓度大于2mg/ml，用SDS-PAGE测 定；
[0009] 所述羊抗人多抗为无色透明液体，浓度大于2mg/ml;
[0010] 所述SPA蛋白为无色透明液体，浓度大于2mg/ml;
[0011] 所述加样缓冲液为含有〇. 5g/ml表面活性剂TWEEN-20的PB溶液。
[0012] 结核分枝杆菌TB-SA抗体胶体金法检测试剂盒的制备方法，它包括以下步骤：
[0013]SL试纸条的制备：
[0014]SlL反应膜的制备：用磷酸盐缓冲液将结核分枝杆菌TB-SA抗原稀释到包被浓度 I.Omg/ml，将羊抗人多抗体稀释至包被浓度为I. 5mg/ml，用划膜喷金标机将两种溶液分别 划到硝酸纤维膜上，将膜干燥后保存；
[0015]S12.金结合垫的制备：将浓度为0. 5mg/ml的SPA蛋白将胶体金进行标记，以转速 为12000r/min离心30min，弃上清，加入胶体金结合物稀释液至原体积的1/10,然后浸润裁 切好的聚酯膜，制备成金结合垫；
[0016]S13.组装切条：在反应膜所在的PVC底板上揭去2.Ocm不干胶，粘贴上吸水纸，使 纸下部压住反应膜，揭去底板上的I. 7cm不干胶，分别粘贴上金结合垫和样品垫，金结合垫 的上部压住反应膜1mm，样品垫上部压住金结合垫下部1mm，组装好后，用切条机将试纸切 成3. 5?3. 7謹试纸条，包装；
[0017] S2.加样缓冲液的制备：称取表面活性剂TWEEN-20,用20mMPB缓冲液溶解至浓度 为0· 5g/ml。
[0018] 进一步地，步骤Sl所述干燥温度为35?40°C，干燥时间为115?125min。
[0019] 本发明中所述步骤S13所述包装可以为桶装或卡盒装，裸条试纸为桶装，卡盒装 试纸条进行塑封后盒装。
[0020] 本发明的试剂盒的检测原理为：本发明试剂盒系用纯化的结核分枝杆菌分泌型 TB-SA抗原和抗人IgG分别固定于硝酸纤维素膜上，以胶体金标记SPA蛋白，米用膜免疫层 析技术原理制备成。
[0021] 测试时，标本和缓冲液等在毛细效应下向另一方移动，标本中的成分IgG流经检 测区（T线，包被TB-SA蛋白），如果标本中含有抗TB-SA的抗体，则抗TB-SA的抗体（IgG) 就和T线上的TB-SA蛋白发生特异性的结合，随后而来的胶体金标记SPA蛋白与TB-SA的抗 体（IgG)结合，并被固定在T线，形成一条红色条带。如果标本中不含有抗TB-SA的抗体， 则无相关的的IgG结合在T线上，随后而来的胶体金标记SPA蛋白也不与T线上的物质反 应，从而不显色出现。质控区内（C线，包被抗人IgG)所显示的红色条带是判定层析过程是 否正常的标准，同时也作为试剂的内控标准。
[0022] 本发明的检测样本可以采用肝素、EDTA-钾、柠檬酸三钠作为抗凝剂。没有使用抗 凝剂的全血标本需立即使用，若果全血发生凝集现象，则不能用该标本做全血标本检测看， 可使用其血清标本检测。
[0023] 本发明结核分枝杆菌TB-SA抗体胶体金法检测试剂盒的检测方法为：
[0024] 使用前将试剂和血清、全血等标本恢复至室温（20_30°C)。
[0025] 1.从包装盒取出试剂，在1小时内应尽快地使用，特别是在室温高于30°C或在高 度潮湿的环境中。
[0026] 2.将试纸条平放在操作台面上，做好标识，取2μ1血清标本或全血加在试剂条的 加样处（前端加样），轻轻接触膜面，使样本扩散到膜面上。
[0027] 3.尽快在试纸条的后端缓慢加入缓冲液2-3滴，见有液体流到膜面计时开始。
[0028] 4.等待红色条带的出现，测试结果在5分钟后15分钟内读取。
[0029] 检测结果：
[0030] 阳性⑴：两条红色条带出现。一条位于检测区（T)，另一条位于质控区（C)。表 明结核分枝杆菌TB-SA抗体阳性。
[0031] 阴性:仅质控区出现一条红色条带，在检测区（T)内无紫红色条带出现。表明 结核分枝杆菌TB-SA抗体阴性。
[0032] 无效：质控区（C)未出现红色条带。
[0033] 本发明的有益效果是：结核分枝杆菌TB-SA抗体胶体金法检测试剂盒具有快速、 简便、准确和灵敏度高的特点，测试结果在5到15分钟内读取。本发明的结核分枝杆菌 TB-SA抗体胶体金法检测试剂盒具有操作简便、成本低廉、特异性好、灵敏度高的特点。制备 该试剂盒的方法操作简单，制备方便、适宜于工业化大规模生产。
【具体实施方式】
[0034] 下面结合实施例对本发明做进一步的描述，本发明的保护范围不局限于以下所 述：
[0035] 实施例1 :反应条件的确定
[0036] 免疫层析胶体金检测反应过程主要涉及三个方面的组合匹配，分别是：金标结合 物的制备、检测线和质控线的包被、硝酸纤维素膜的选择。
[0037] 1.金标结合物制备的确定
[0038] 按照实验设计，整个过程分为胶体金的制备、标记、封闭、离心浓缩和喷涂等过程， 各个过程条件确定如下：
[0039] 胶体金的制备：采用柠檬酸三钠还原氯金酸制备，具体的制备工艺确定如下 ：
[0040] 配制：1 %氯金酸溶液、1 %柠檬酸三钠溶液。
[0041] 制备：在装有97ml超纯水的锥形瓶中加入2.Oml柠檬酸钠溶液（1% )，加热至沸 腾，边搅拌边加热，迅速加入I.Oml氯金酸溶液（1% )，5min后变为稳定的酒红色，继续加热 搅拌lOmin。冷却后用超纯水补充至100ml。
[0042] 2.胶体金的标记：
[0043](I)pH值的确定过程如下：
[0044] 根据文件介绍，SPA蛋白标记的最佳pH值在6.0附近，我们测定刚烧制好的胶体 金溶液pH值在6. 0-6. 5,我们测试4. 5到7.O标记的差异，结果显示SPA标记时属于pH值 非严格依赖型，PH值在5. 0-7.O差异不显著，最后确定烧制好的胶体金直接标记使用，不调 整pH值。
[0045] (2)SPA标计量的确定：
[0046] 初步测试：
[0047] ①取洁净微孔板，每孔加200μ1胶体金及5μ1 0. 2MK2C03 (事先将0. 2M的碳酸 钾和胶体金按此比例混匀，再分别加入各孔）。
[0048] ②将5mg/ml的SPA稀释为0. 5μg/ul浓度。
[0049] ③每孔分别加 1μ1、2μ1、4μ1、8μ1、16μ1、32μ1，并做复孔，静置lOmin。
[0050] ④每孔分别加入NaCl溶液20ul，置IOmin后，观察。
[0051] ⑤实验结果如表3所示：
[0052]表 3 :
[0053]
【权利要求】
1. 结核分枝杆菌TB-SA抗体胶体金法检测试剂盒，其特征在于，它由试纸条和加样缓 冲液组成，所述试纸条包括包被有TB-SA抗原、质控线包被有羊抗人多抗的硝酸纤维素膜、 胶体金标记的SPA蛋白吸附在聚酯膜上的金标垫、样品垫和吸水纸； 所述结核分枝杆菌TB-SA抗原，为无色透明液体，浓度大于2mg/ml ; 所述羊抗人多抗，为无色透明液体，浓度大于2mg/ml ; 所述SPA蛋白为无色透明液体，为无色透明液体，浓度大于2mg/ml ; 所述加样缓冲液为含有〇. 5g/ml表面活性剂TWEEN-20的PB溶液。
2. 如权利要求1所述的结核分枝杆菌TB-SA抗体胶体金法检测试剂盒的制备方法，其 特征在于，它包括以下步骤：
51. 试纸条的制备：
511. 反应膜的制备：用磷酸盐缓冲液将结核分枝杆菌TB-SA抗原稀释到包被浓度 1. Omg/ml，将羊抗人多抗体稀释至包被浓度为1. 5mg/ml，用划膜喷金标机将两种溶液分别 划到硝酸纤维膜上，将膜干燥后保存；
512. 金结合垫的制备：将浓度为0. 5mg/ml的SPA蛋白将胶体金进行标记，以转速为 12000r/min离心30min，弃上清，将胶体金结合物稀释液至原体积的1/10,然后浸润裁切好 的聚酯膜，制备成金结合垫；
513. 组装切条：在反应膜所在的PVC底板上揭去2. Ocm不干胶，粘贴上吸水纸，使纸 下部压住反应膜，揭去底板上的1. 7cm不干胶，分别粘贴上金结合垫和样品垫，金结合垫的 上部压住反应膜1mm，样品垫上部压住金结合垫下部1mm，组装好后，用切条机将试纸切成 3. 5?3. 7mm试纸条，包装；
52. 加样缓冲液的制备：称取表面活性剂TWEEN-20,用20mM PB缓冲液溶解至浓度为 0?5g/ml〇
3. 如权利要求2所述的结核分枝杆菌TB-SA抗体胶体金法检测试剂盒的制备方法，其 特征在于，步骤S1所述干燥温度为35?40°C，干燥时间为115?125min。
【文档编号】G01N33/569GK104483491SQ201410798281
【公开日】2015年4月1日 申请日期:2014年12月19日 优先权日:2014年12月19日
【发明者】叶成栋, 刘军, 郭沛, 罗春勤, 王洪 申请人:成都永安制药有限公司