一种原料乳中乳过氧化物酶的试纸检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种原料乳中乳过氧化物酶的试纸检测方法，该方法包括配制反应试剂、试纸反应、检测标准的建立及乳样检测等步骤。本发明的优点在于：检测速度快，最快可在几秒钟完成对乳过氧化物酶的定性检测，3分钟即可定量测定原料乳中的乳过氧化物酶含量，适合乳过氧化物酶的在线检测，并且检测费用低，检测结果准确，最低检出浓度为1-2mg/L，环境要求低，检测操作简便。
【专利说明】一种原料乳中乳过氧化物酶的试纸检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生化检测领域，具体涉及一种原料乳中乳过氧化物酶的分析测试方 法。
【背景技术】
[0002] 乳过氧化物酶（Lactoperoxidase, LP)是过氧化物酶类的一种，由一条多肽链构 成，包括612个氨基酸残基，分子量大约是78kDa,该酶是一个依赖于过氧化氢（H2O2)的氧 化还原酶类，作为乳液中的内源酶之一，广泛存在于哺乳动物的乳腺、唾液腺、泪腺及其分 泌物中。在牛乳中，LP是含量仅次于黄嘌呤氧化酶的酶，它在乳中的浓度大约是30mg/L。 LP热稳定性相对较高，de Wit等发现牛奶中LP彻底失活，需要在78°C持续15s ;Marks等 证明了普通的巴氏灭菌法并不能使牛奶中的LP失活，经72°C持续15s的巴氏灭菌后仍有活 性。因此，可通过检测LP活力，掌握乳品的热处理情况。
[0003] 国内外对乳过氧化物酶检测的研究较多，ABTS、TMB、愈创木酚等常用于检测LP。现 有的检测方法都是借助大型仪器测定酶活性与酶浓度，方法的准确度、灵敏度均较高，但由 于需借助大型仪器，不适合于现场检测。目前，鉴于乳过氧化物酶的仪器检测方法，需对样 品进行复杂前处理且处理时间长、无法实现在线检测等缺点。因此，开发快速、灵敏、准确检 测乳过氧化物酶含量的关键技术，用于原料乳验收及其乳制品加工，具有重要理论研究价 值和实际意义。本发明利用酶促显色反应原理，利用四甲基联苯胺（TMB)为显色底物，优化 检测试纸的最佳制备条件，研制出一种简便、快速、精确的乳过氧化酶试纸检测方法，以满 足实际现场快速检测乳过氧化酶的加工需求。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是为了解决现有的乳过氧化物酶含量的分析测试方法中存在的操 作繁琐且需要专业的技术人员进行操作、或成本高、或无法实现在线检测等问题，提供一种 快速、便捷的乳过氧化物酶的检测方法。
[0005] 实现上述目的的本发明的技术方案为：
[0006] 一种原料乳中乳过氧化物酶的试纸检测法，该方法包括以下步骤：
[0007] (1)配制试纸浸泡液：分别配制pH值为4. 0?6. 0的0? lmol/L朽1檬酸-〇? 2mol/L 磷酸氢二钠缓冲溶液、浓度为l〇-25mmol/L的TMB溶液以及质量分数为0. 1% -1. 0%的表 面活性剂溶液；将上述配制好的三种溶液按照缓冲溶液：TMB溶液：表面活性剂溶液体积比 =30-50:0. 5-2:1-3,优选按照体积比40:1:2混合混匀，即为试纸浸泡液；
[0008] ⑵配制过氧化氢（H2O2)溶液：配制浓度为0? 5-1. Ommol/L的H2O2溶液；
[0009] (3)试纸的制作：将裁剪好的滤纸条在步骤⑴配制的试纸浸泡液中，浸泡 1?3分钟，完全浸透后，放在平皿上抽真空干燥，制得乳过氧化物酶检测试纸，为提 高试纸的稳定性，干燥后的试纸裁去边缘0. 5cm，将处理好的显色试纸切割成规格为 0. 2-0. 8cmX0. 2-0. 8cm的试纸片，作为反应区黏接在准备好的PVC胶版上，即制成乳过氧 化物酶检测试纸；
[0010] ⑷试纸检测：在步骤⑶中制备好的检测试纸上，先滴加3 iiL步骤⑵配制好 的H2O2溶液，再滴加3 y L待检测乳样品，反应l-7min后，目测或使用便携式光电测色仪或 其他任何可采集样品颜色信息的仪器，记录试纸颜色信息变化；
[0011] (5)标准的建立：配制浓度范围在0_25mg/L的标准乳过氧化物酶样品，按照步骤 (4)的方法，采用测定吸光度值或与之等效的方法，制作标准比色卡，或建立反应过程中的 颜色变化信息与乳过氧化物酶浓度之间固定的函数关系，作为检测标准；
[0012] (6)检测：将步骤⑷采集的颜色变化信息与步骤（5)获得的检测标准进行比较， 获得所测乳样中的乳过氧化物酶的浓度。
[0013] 在本发明所述的方法中，优选的，步骤（1)所述的0. lmol/L柠檬酸-0. 2mol/L磷 酸氢二钠缓冲液pH值为5. 0。
[0014] 在本发明所述的方法中，优选的，步骤（1)所述的TMB溶液浓度为22mmol/L。
[0015] 在本发明所述的方法中，优选的，步骤（1)所述的表面活性剂为Tween-20、 Triton、CTAB或SDS中的至少一种。更优选的，步骤（1)所述的表面活性剂为质量分数为 0? 5 %的Tween-20或质量分数为0? 3 %的CTAB。
[0016] 在本发明所述的方法中，优选的，步骤（2)所述的H2O2浓度为0. 6mmol/L。
[0017] 在本发明所述的方法中，优选的，步骤（3)所述试纸为快速、中速、慢速定性滤纸 或者快速、中速、慢速定量滤纸，更优选为中速定量滤纸。
[0018] 在本发明所述的方法中，优选的，步骤（4)中试纸检测时间为反应3min。
[0019] 采用本发明所述的方法对原料乳中乳过氧化物酶进行检测，其最低检测浓度为 卜2mg/L〇
[0020] 相对于现有的技术，本发明具有以下优点：
[0021] 1、检测速度快，最快几秒钟试纸由白色变为浅黄绿色，能够实现对乳过氧化物酶 进行定性检测；3min即可定量测定乳中乳过氧化物酶的浓度，适合在线检测；
[0022] 2、检测费用低，检测结果准确，试纸法能检出的最低乳样中乳过氧化物酶浓度为 l-2mg/L，该检测法性价比高；
[0023] 3、环境要求低，检测操作简便，建立好标准后，在试纸上滴加H2O2溶液后，试纸与 乳样反应即可，操作人员无需专门培训，易普及；
[0024] 4、乳过氧化物酶检测试纸，其检测精密度在3% -7%，说明该试纸法具有较好的 精密度；
[0025] 5、乳过氧化物酶试纸检测法与TMB试管检测法相关性较好，其相关系数为0. 983。
【专利附图】
【附图说明】
[0026] 图1为反光值与反应时间关系曲线；
[0027] 注：同一曲线标注无相同字母者差异显著（p〈0. 05)
[0028] 图2为柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液pH值对显色反应的影响；
[0029] 注：同一曲线标注无相同字母者差异显著（p〈0. 05)
[0030] 图3为不同浓度TMB对显色反应的影响；
[0031] 注：同一曲线标注无相同字母者差异显著（p〈〇. 05)
[0032] 图4表面活性剂的筛选；
[0033] 注：同一曲线标注无相同字母者差异显著（p〈0. 05)
[0034] SDS:十二烷基硫酸钠；T20 :Tween-20 ;CTAB :十六烷基三甲基溴化铵；TlOO : TritionX-IOO ；
[0035] 图5为不同浓度过氧化氢对反应的影响；
[0036] 注：同一曲线标注无相同字母者差异显著（p〈0. 05)
[0037] 图6为乳过氧化物酶浓度与反光值的关系曲线；
[0038] 注：同一曲线标注无相同字母者差异显著（p〈0. 05)
[0039] 图7为试纸检测法最低检出浓度；
[0040] 注：同一曲线标注无相同字母者差异显著（p〈〇. 05)
[0041] 图8为试纸检测法与TMB试管法检测乳过氧化物酶浓度相关性。
【具体实施方式】
[0042] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而 更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员 应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行 修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0043] 实施例1乳过氧化物酶的快速检测
[0044] 本实施方式原料乳中乳过氧化物酶的试纸检测方法按照以下步骤进行：
[0045] (1)配制试纸浸泡液：分别配制pH为5. 0的0? lmol/L柠檬酸-0? 2mol/L磷酸氢二 钠缓冲溶液、浓度为22mmol/L的TMB溶液、质量分数为0. 5%的Tween-20溶液；将上述配制 好的三种溶液按照缓冲溶液=TMB溶液：表面活性剂溶液体积比=40:1:2混合，振荡3min 混匀，即为试纸浸泡液；
[0046] (2)配制H2O2溶液：配制浓度为0? 6mmol/L的H2O2溶液。
[0047] (3)试纸的制作：将裁剪好的中速定量滤纸条（3cmX5cm)在步骤⑴配制的浸泡 液中，浸泡1?3分钟，完全浸透后，放在平皿上抽真空干燥，制得乳过氧化物酶检测试纸， 为提高试纸的稳定性，干燥后的试纸裁去边缘0.5cm，将处理好的显色试纸切割成规格为 0. 5cmX0. 5cm的试纸片，作为反应区黏接在准备好的PVC胶版上，即制成乳过氧化物酶检 测试纸。
[0048] (4)试纸检测：在步骤⑶中制备好的检测试纸上，先滴加3 y L步骤⑵配制好 的H2O2溶液，再滴加3 y L待检测乳样品，反应3min后，目测或使用便携式光电测色仪或其 他任何可采集样品颜色信息的仪器，记录试纸颜色信息变化；
[0049] (5)标准的建立：配制浓度为0、5、10、15、20、25mg/L的标准乳过氧化物酶样品，按 照步骤（4)的方法，采用测定吸光度值或与之等效的方法，制作标准比色卡，或建立反应过 程中的颜色变化信息与乳过氧化物酶浓度之间固定的函数关系，作为检测标准；
[0050] (6)检测：将步骤⑷采集的颜色变化信息与步骤（5)获得的检测标准进行比较， 获得所测乳样中的乳过氧化物酶浓度。
[0051] 本实施方式中步骤（5)建立标准的操作只需一次，标准建立后，以后的每次检测 仅需与标准进行比较即可。
[0052] 实施例2乳过氧化物酶的快速检测
[0053] 本实施方式原料乳中乳过氧化物酶的分析测试方法按照以下步骤进行：
[0054] (1)配制试纸浸泡液：分别配制pH为4. 8的0? lmol/L柠檬酸-0? 2mol/L磷酸氢二 钠缓冲溶液、浓度为20mmol/L的TMB溶液、质量分数为0. 3%的CTAB溶液；将上述配制好的 三种溶液按照缓冲溶液：TMB溶液：表面活性剂溶液体积比=45:1. 5:1混合，振荡3min混 匀，即为试纸浸泡液；
[0055] (2)配制H2O2溶液：配制浓度为0? 8mmol/L的H2O2溶液。
[0056] (3)试纸的制作：将裁剪好的中速定量滤纸条（3cmX5cm)在步骤⑴配制的浸泡 液中浸泡1?3分钟，完全浸透后，放在平皿上抽真空干燥，制得乳过氧化物酶检测试纸， 为提高试纸的稳定性，干燥后的试纸裁去边缘0.5cm，将处理好的显色试纸切割成规格为 0. 5cmX0. 5cm的试纸片，作为反应区黏接在准备好的PVC胶版上，即制成乳过氧化物酶检 测试纸。
[0057] (4)试纸检测：在步骤⑶中制备好的检测试纸上，先滴加3 y L步骤⑵配制好 的H2O2溶液，再滴加3 y L待检测乳样品，反应3min后，目测或使用便携式光电测色仪或其 他任何可采集样品颜色信息的仪器，记录试纸颜色信息变化；
[0058] (5)标准的建立：配制浓度为0、5、10、15、20、25mg/L的标准乳过氧化物酶样品，按 照步骤（4)的方法，采用测定吸光度值或与之等效的方法，制作标准比色卡，或建立反应过 程中的颜色变化信息与乳过氧化物酶浓度之间固定的函数关系，作为检测标准；
[0059] (6)检测：将步骤⑷采集的颜色变化信息与步骤（5)获得的检测标准进行比较， 获得所测乳样中的乳过氧化物酶浓度。
[0060] 本实施方式中步骤（5)建立标准的操作只需要一次，标准建立后，以后的每次检 测仅需与标准进行比较即可。
[0061] 试验例1不同试纸载体对显色反应的影响
[0062] 选用快、中、慢速定量滤纸；快、中、慢定性滤纸为试纸载体，浸入试纸浸泡液中，浸 泡Imin后取出，放在平皿上抽真空烘干。测定不同试纸载体对显色反应的影响。以不同纸 张的吸水力、显色能力以及颜色分布的均匀程度为依据，选择最好的纸张作为制作试纸的 载体。其余步骤同实施例1。
[0063] 不同试纸载体对显色反应的影响见表1。由表1可见，快速定量滤纸与快速定性滤 纸的吸水能力都较强，但在显色能力及颜色分布上存在一定欠缺陷；慢速定量滤纸与慢速 定性滤纸的吸水能力较差、颜色分布不均匀。中速定量滤纸的吸水能力强，显色效果好，且 颜色分布均匀。基于以上结果，所以本发明优选采用中速定量滤纸为试纸载体。
[0064] 表1试纸载体的选择
[0065]
【权利要求】
1. 一种原料乳中乳过氧化物酶的试纸检测方法，其特征在于，该方法包括以下步骤： (1)配制试纸浸泡液：分别配制pH值为4. 0?6. 0的0? lmol/L朽1檬酸-0? 2mol/L磷 酸氢二钠缓冲溶液、浓度为l〇-25mmol/L的TMB溶液以及质量分数为0. 1% -1. 0%的表面 活性剂溶液；将上述配制好的三种溶液按照缓冲溶液：TMB溶液：表面活性剂溶液体积比= 30-50:0. 5-2:1-3,优选按照体积比40:1:2混合混匀，即为试纸浸泡液； ⑵配制过氧化氢（H202)溶液：配制浓度为0? 5-1. Ommol/L的H202溶液； (3) 试纸的制作：将裁剪好的滤纸条在步骤（1)配制的试纸浸泡液中，浸泡1?3分钟， 完全浸透后，放在平皿上抽真空干燥，制得乳过氧化物酶检测试纸，为提高试纸的稳定性， 干燥后的试纸裁去边缘〇. 5cm，将处理好的显色试纸切割成规格为0. 2-0. 8cmX0. 2-0. 8cm 的试纸片，作为反应区黏接在准备好的PVC胶版上，即制成乳过氧化物酶检测试纸； (4) 试纸检测：在步骤（3)中制备好的检测试纸上，先滴加3 yL步骤⑵配制好的H202溶液，再滴加3 y L待检测乳样品，反应l-7min后，目测或使用便携式光电测色仪或其他任 何可采集样品颜色信息的仪器，记录试纸颜色信息变化； (5) 标准的建立：配制浓度范围在0-25mg/L的标准乳过氧化物酶样品，按照步骤（4) 的方法，采用测定吸光度值或与之等效的方法，制作标准比色卡，或建立反应过程中的颜色 变化信息与乳过氧化物酶浓度之间固定的函数关系，作为检测标准； (6) 检测：将步骤（4)采集的颜色变化信息与步骤（5)获得的检测标准进行比较，获得 所测乳样中的乳过氧化物酶的浓度。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（1)所述的0. lmol/L柠檬酸-0. 2mol/ L磷酸氢二钠缓冲液的pH值为5. 0。
3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤⑴所述的TMB溶液浓度为22mmol/ L〇
4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（1)所述的表面活性剂为Tween-20、 TritonX-100、十六烷基三甲基溴化铵（CTAB)或十二烷基硫酸钠（SDS)中的至少一种。
5. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于步骤（1)所述的表面活性剂为质量分数为 0? 5 %的Tween-20或质量分数为0? 3 %的CTAB。
6. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（2)所述的H202浓度为0. 6mmol/L。
7. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（3)所述试纸为快速、中速、慢速定性 滤纸或者快速、中速、慢速定量滤纸。
8. 根据权利要求7所述的方法，其特征在于步骤（3)所述试纸为中速定量滤纸。
9. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（4)中试纸检测时间为反应3min。
10. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，检测试纸对原料乳中乳过氧化物酶的最 低检测浓度为l_2mg/L。
【文档编号】G01N21/78GK104406977SQ201410798199
【公开日】2015年3月11日 申请日期:2014年12月19日 优先权日:2014年12月19日
【发明者】姜瞻梅, 许晓曦, 车红霞, 刘丽丽, 辛岩 申请人:东北农业大学