专利名称：通过表达udp－半乳糖差向异构酶反义rna在瓜尔豆中体内修饰半乳甘露聚糖的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种修饰方法。
具体地说，本发明涉及一种体内修饰方法。
半乳甘露聚糖是一组不均一的细胞壁多糖，由具有不同数目α-1，6键连接的半乳糖侧链的β-1-4键连接的甘露聚糖主链组成。
具有最重要工业用途的半乳甘露聚糖得自豆科植物瓜尔豆(Caymopsis tetragonolobus)和角豆(Ceratonia siliqua)的胚乳。这些半乳甘露聚糖的半乳糖含量不同，瓜尔豆的半乳糖与甘露糖之比约为1∶1.6，而角豆胶(LBG)的该比率约为1∶3.4。
半乳糖含量的差异对瓜尔豆胶和LBG的功能特性有显著的影响。两种半乳甘露聚糖在低浓度下(1-2％)均形成非常粘稠的溶液，但LBG具有另一特性，即能够与诸如黄原胶、角叉藻聚糖和琼脂糖之类的其它多糖形成坚固的凝胶。食品工业广泛实使用LBG，用于乳制品(特别是冰淇淋)、色拉调味品、调味汁、低热量制品和宠物食品。然而，LBG的使用受高价格和不定期供应的限制。
因此，希望大规模地生产具有改进功能特性的半乳甘露聚糖，诸如由于提高甘露糖与半乳糖之比(诸如与LBG类似)而改进功能特性。
由于瓜尔豆胶和LBG之间在种属上具有化学相似性，并且瓜尔豆胶的价格低得多，因此，已经尝试体外将瓜尔豆胶转化为具有LBG样特性且化学组成类似于LBG的半乳甘露聚糖。
这种体外处理的一个实例包括使用α-半乳糖苷酶。在该方面，参见McCleary等1983和EP-A-0255153。
通过使用从瓜尔豆种子纯化的α-半乳糖苷酶，获得了半乳糖含量为10-34％的瓜尔豆胶(Bulpin等1990)。修饰的瓜尔豆胶胶凝行为的分析表明，半乳糖含量为24％的制剂与角叉藻聚糖形成混合凝胶，表现出与LBG类似的流变学特性。相比之下，未处理的瓜尔豆胶的半乳糖含量38％，而LBG的半乳糖含量为23％。
然而，从工业的观点来看，瓜尔豆胶的体外脱半乳糖基涉及到许多问题。
第一，必须制备大量的α-半乳糖苷酶，因为必须去除瓜尔豆胶中约40％的半乳糖。
第二，在温育期间，非常重要的是不发生甘露聚糖主链的水解，这必需使用高度纯化的无任何甘露聚糖酶活性痕迹的α-半乳糖苷酶制剂。已经公开了从瓜尔豆种子异源生产α-半乳糖苷酶的方法(Overbeeke等1986)。然而，在研究对瓜尔豆胶的作用之前，纯化了由测试物种生产的α-半乳糖苷酶，提示甘露聚糖酶问题仍待解决。
第三，半乳甘露聚糖的产生降低，因为半乳糖含量降低40％相当于少15％修饰的瓜尔豆胶。在终产物中，释放的半乳糖可能是不希望的，可能必须去除。
第四，在与α-半乳糖苷酶温育期间，有相当大的半乳甘露聚糖解聚的风险。
此外，有污染微生物在反应混合物中定居释放内切β-甘露聚糖酶的风险。
最后，必须从反应化合物中除去水。除影响该方法的成本外，这也导致可以用以获得最适反应条件的缓冲液的浓缩。
这些实例说明，目前修饰瓜尔豆胶的方法与多种问题有关，其中某些与相当大的成本有关。
因此，需要有一种改进的修饰瓜尔豆胶的方法。
在该方法，我们已经提出，修饰含甘露糖/半乳糖的化合物(诸如瓜尔豆胶)，其中该修饰在诸如瓜尔豆植株的植物体内发生，并且利用重组DNA技术。特别是，我们提及PCT/EP96/05581，该专利于1996年12月2日申请(其内容通过引用结合到本文中)。
从最广义的意义来说，PCT/EP96/05581涉及在能够合成该化合物的生物中体内修饰含甘露糖/半乳糖化合物(诸如瓜尔豆胶)，其修饰方法对该生物不是天然的，诸如利用重组DNA技术的方法。该修饰的发生可以与该化合物的任何一种或多种前体(例如甘露糖和/或半乳糖)相关，或与该化合物本身相关(即含甘露糖/半乳糖的化合物的甘露糖和/或半乳糖单位)。
具体地说，PCT/EP96/05581涉及一种体内修饰方法，该方法影响、最好是提高或者生物(或其部分)的甘露糖与半乳糖之比、或含甘露糖/半乳糖的化合物的甘露糖与半乳糖之比，其中所述生物能够产生含甘露糖/半乳糖的化合物。这种体内修饰过程不是天然发生的过程。
因此，PCT/EP96/05581的体内方法，可能改变生物体内甘露糖与半乳糖内部之比和/或甘露糖/半乳糖化合物的甘露糖与半乳糖之比。
生产体内修饰的瓜尔豆胶的一个要求是将合适的基因引入瓜尔豆的方法的可得性。Jorsboe和Okkels(1994)在有限程度上已经完成了这种方法，他们转移了一种用于开发转化方法的可选择和可筛选基因。这些作者没有报道用影响甘露糖与半乳糖之比的基因进行转化。这是重要的，因为从生物技术的观点来看，生产体内修饰的瓜尔豆胶的主要障碍是缺乏对半乳甘露聚糖生物合成的了解。迄今为止，尚未分离和特征鉴定控制瓜尔豆胶体内生物合成的基因或基因产物。然而，在PCR/EP96/05581中，我们确定了控制瓜尔豆胶体内生物合成的某些基因或基因产物，因此使得我们能够体内修饰瓜尔豆胶。
现在，我们提供一种修饰含甘露糖/半乳糖的化合物(诸如瓜尔豆胶)的新方法。
按照本发明的第一方面，我们提供一种体内修饰方法，该方法影响或者能够产生含甘露糖/半乳糖化合物的生物(或其部分)的甘露糖与半乳糖之比、或者含甘露糖/半乳糖的化合物的甘露糖与半乳糖之比，其中该体内修饰方法包括表达影响以下的核苷酸序列(a)含甘露糖/半乳糖化合物的甘露糖和半乳糖组分的甘露糖与半乳糖之比；和/或(b)含甘露糖/半乳糖化合物的甘露糖和半乳糖前体的甘露糖与半乳糖之比；并且其中所述核苷酸序列是UDP-半乳糖差向异构酶基因的至少一部分的反义核苷酸序列。
按照本发明的第二方面，我们提供一种核苷酸序列的用途，所述核苷酸序列影响或者能够产生含甘露糖/半乳糖化合物的生物(或其部分)的甘露糖与半乳糖之比、或者含甘露糖/半乳糖的化合物的甘露糖与半乳糖之比，其中所述核苷酸序列是UDP-半乳糖差向异构酶基因的至少一部分的反义核苷酸序列，并且其中所述核苷酸序列影响(a)含甘露糖/半乳糖化合物的甘露糖和半乳糖组分的甘露糖与半乳糖之比；和/或(b)含甘露糖/半乳糖化合物的甘露糖和半乳糖前体的甘露糖与半乳糖之比。
在一个最佳实施方案中，所述核苷酸序列是UDP-半乳糖差向异构酶编码序列的至少一部分的反义核苷酸序列。
术语“含甘露糖/半乳糖化合物”是指包含至少一个甘露糖基团和至少一个半乳糖基团的化合物。
所述含甘露糖/半乳糖化合物优选半乳甘露聚糖。
所述含甘露糖/半乳糖化合物更优选瓜尔豆胶。
更优选的是，所述能够产生含甘露糖/半乳糖化合物的生物是瓜尔豆植物，而其含甘露糖/半乳糖化合物是半乳甘露聚糖。然而，包括其它产生半乳甘露聚糖的植物，诸如葫芦巴和苜蓿。被认为不产生适量半乳甘露聚糖的植株属于茄科和烟草。
术语“产生含甘露糖/半乳糖化合物的生物(或其部分)”也包括能够产生含甘露糖/半乳糖化合物的任何合适生物，特别是植物，使得该生物的内部体内甘露糖与半乳糖之比改变。该术语也包括能够产生含甘露糖/半乳糖化合物的生物的任何部分，使得该部分的甘露糖与半乳糖之比改变。该术语也包括在生物内的部分或活培养物培养基中的部分。该部分最好是在生物本身内。一个这样的部分的实例是种子。
术语“甘露糖和半乳糖前体”包括作为含甘露糖/半乳糖化合物(最好是半乳甘露聚糖)生物合成前体的甘露糖本身或其衍生物和/或半乳糖本身或其衍生物。另外，该术语包括甘露糖本身或其衍生物的前体和/或半乳糖或其衍生物的前体，所述前体进而用作含甘露糖/半乳糖化合物(最好是半乳甘露聚糖)生物合成的前体。最好是，该术语是指作为半乳甘露聚糖、最好是瓜尔豆半乳甘露聚糖的前体的甘露糖本身或其衍生物(诸如甘露糖-6-磷酸或GDP-甘露糖)和/或半乳糖本身或其衍生物。
优选的是，该生物(或其部分)或其含甘露糖/半乳糖化合物的体内甘露糖与半乳糖之比高于所述瓜尔豆植物或其半乳甘露聚糖的该比率。
更优选的是，该生物(或其部分)或其含甘露糖/半乳糖化合物的体内甘露糖与半乳糖之比与所述角豆植物或其半乳甘露聚糖的该比率大致相似。
优选的是，所述生物(或其部分)或其含甘露糖/半乳糖化合物是瓜尔豆植物或瓜尔豆植物的胶。
本发明也包括用本发明方法制备的含甘露糖/半乳糖化合物。这种含甘露糖/半乳糖化合物将称为按照本发明的含甘露糖/半乳糖化合物。
另外，本发明也包括包含按照本发明的含甘露糖/半乳糖化合物的食料。
另外，本发明也包括组合物，诸如食料，所述组合物包含与另一种多糖混合的按照本发明的含甘露糖/半乳糖化合物。最好是，其它糖是黄原胶、角叉藻聚糖和琼脂糖中的任何一种或多种。
另外，本发明包括制备按照本发明的组合物或食料的方法，包括将按照本发明的含甘露糖/半乳糖化合物与另一种合适组分混合。
本发明的各个广义方面可以通过使用一种核苷酸序列来达到，所述核苷酸序列是UDP-半乳糖差向异构酶基因的至少一部分的反义核苷酸序列。UDP-半乳糖差向异构酶将UDP-葡萄糖转化为掺入半乳甘露聚糖中的UDP-半乳糖。用该策略，表达反义UDP-半乳糖差向异构酶降低该差向异构酶活性，藉此提高含甘露糖化合物(诸如半乳甘露聚糖)生物合成的甘露糖和半乳糖前体的体内甘露糖与半乳糖之比。
本发明的优选方法涉及包含或表达本发明核苷酸序列的构成物。
本发明的另一优选方法涉及包含或表达本发明的构成物或核苷酸序列的载体。
本发明的另一优选方面涉及包含或表达本发明的载体、构成物或核苷酸序列的质粒。
本发明的另一优选方面涉及包含或表达本发明的质粒、载体、构成物或核苷酸序列的转基因生物。
本发明的其它优选方面包括表达或允许表达或转化所述核苷酸序列、构成物、质粒、载体、细胞、组织、器官或生物以及它们的产物的任何一种。
本发明的其它优选方法包括使用按照本发明的反义核苷酸序列制备或处理食料，包括动物饲料。
本发明的一个关键的优点是，通过使用所述反义序列，可能提高生物或其含甘露糖化合物(特别是体内修饰的瓜尔豆胶)的甘露糖与半乳糖之比。
可以与一种或多种其它核苷酸序列在体内结合使用所述反义核苷酸序列，所述其它核苷酸序列最好是利用重组DNA技术制备的。
同样，本发明的核苷酸序列可以结合一种或多种基因产物使用，以进一步影响所述甘露糖与半乳糖之比，所述基因产物最好是利用DNA技术制备的。这里，所述基因产物可以是肽、多肽、蛋白质、酶和RNA中的一种或多种。最好是，至少其中一种基因产生是由非天然核苷酸序列的核苷酸序列表达的酶。这里，术语“天然核苷酸序列”是指在其天然环境中且与一个天然连接的完整启动子操作性地连接时的完整的核苷酸序列，所述启动子也在其天然环境中。
作为实例，在某些情况下，按照本发明反义核苷酸序列最好与一种或多种编码下述酶的基因和/或一种或多种编码α-半乳糖苷酶的基因结合使用，所述酶是GDP-甘露糖生物合成所需的，即磷酸甘露糖异构酶(PMI)和/或磷酸甘露糖变位酶和/或GDP-甘露糖焦磷酸酶。
在更优选情况下，按照本发明的核苷酸序列与编码磷酸甘露糖异构酶(PMI)和/或编码α-半乳糖苷酶的基因结合使用。在PCT/EP96/05581(其内容通过引用结合到本文中)中公开和讨论了优选的PMI和α-半乳糖苷酶。
本发明也包括按照本发明的核苷酸序列的变异体、同系物或片段的用途。这里，与所述核苷酸序列相关的术语“变异体”、“同系物”或“片段”，包括所述核苷酸序列中一个(或多个)核酸的任何置换、变异、修饰、取代、缺失或添加，只要所得核苷酸序列类似于UDP-半乳糖差向异构酶基因的至少一部分的反义核苷酸序列，并且其中所得的核苷酸序列能够影响以上定义的甘露糖与半乳糖之比。这些术语与所述序列的等位基因变异同义。
本发明核苷酸序列为其基因序列的反义核苷酸序列的UDP-半乳糖差向异构酶，可以是任何合适的UDP-半乳糖差向异构酶。本发明核苷酸序列为其基因序列的反义核苷酸序列的UDP-半乳糖差向异构酶，最好是内源UDP-半乳糖差向异构酶或具有相似序列的酶(诸如序列相似性至少为85％，优选序列相似性至少为90％，更优选序列相似性至少为95％，更优选序列相似性至少为98％)。
按照本发明的一个优选实施方案，本发明核苷酸序列为其基因序列的反义核苷酸序列的UDP-半乳糖差向异构酶，可以是或可以包含SEQ ID No.1或SEQ ID No.2提出的氨基酸序列或其变异体、其同系物或其片段。
按照本发明的一个更优选的实施方案，本发明核苷酸序列为其基因序列的反义核苷酸序列的UDP-半乳糖差向异构酶，可以是或可以包含SEQ ID No.1或SEQ ID No.2提出的氨基酸序列。
另外，按照本发明的再一更优选的实施方案，本发明核苷酸序列为SEQ ID No.1或SEQ ID No.2提出的UDP-半乳糖差向异构酶的编码序列、或其变异体、其同系物或其片段的反义核苷酸序列。
按照本发明的再一优选实施方案，本发明的核苷酸序列为SEQ IDNo.1或SEQ ID No.2提出的UDP-半乳糖差向异构酶的编码序列的反义核苷酸序列。
如上所述，与关于本发明反义核苷酸序列的优选UDP-半乳糖差向异构酶的氨基酸序列相关的术语“变异体”、“同系物”或“片段”，包括所述序列中一个(或多个)氨基酸的任何置换、变异、修饰、取代、缺失或添加，只要所得酶具有UDP-半乳糖差向异构酶活性，最好至少具有与包含SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示序列的酶的相同活性。特别是，术语“同系物”包括涉及结构和/或功能的同源性。对于序列同源性，与包含SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示序列的酶的同源性优选至少为75％，更优选至少为85％，更优选至少为90％。与包含SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示序列的酶的同源性更优选至少为95％，更优选至少为98％。
与关于本发明反义核苷酸序列的编码UDP-半乳糖差向异构酶的核苷酸序列相关的术语“变异体”、“同系物”或“片段”，包括所述序列中一个(或多个)核酸的任何置换、变异、修饰、取代、缺失或添加，只要所得核苷酸序列编码或能够编码具有UDP-半乳糖差向异构酶活性的酶，所述酶最好至少具有与包含SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示序列的酶的相同活性。特别是，术语“同系物”包括涉及结构和/或功能的同源性，只要所得核苷酸序列编码或能够编码具有UDP-半乳糖差向异构酶活性的酶。对于序列同源性，与包含SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示序列的同源性优选至少为75％，更优选至少为85％，更优选至少为90％。与包含SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示序列的酶的的序列的同源性，更优选至少为95％，更优选至少为98％。
与本发明反义核苷酸序列(即编码UDP-半乳糖差向异构酶的核苷酸序列的反义核苷酸序列)相关的术语“变异体”、“同系物”或“片段”，包括所述序列中一个(或多个)核酸的任何置换、变异、修饰、取代、缺失或添加，只要所得核苷酸序列为下述序列的反义序列编码或能够编码具有UDP-半乳糖差向异构酶活性的酶的序列，所述酶最好至少具有与包含SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示序列的酶的相同活性。特别是，术语“同系物”包括涉及结构和/或功能的同源性，只要所得核苷酸序列为下述序列的反义序列编码或能够编码具有UDP-半乳糖差向异构酶活性的酶的序列。对于序列同源性，与包含下述序列的序列的同源性优选至少为75％，更优选至少为85％，更优选至少为90％，所述序列为SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示序列的反义序列。与包含下述序列的序列的同源性更优选至少为95％，更优选至少为98％，所述序列为SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示序列的反义序列。
本发明的转基因生物包括包含任何一种或多种以下物质的生物按照本发明的核苷酸序列、按照本发明的构成物、按照本发明的载体、按照本发明的质粒、按照本发明的细胞、按照本发明的组织或它们的产物，包括它们的组合物。例如，所述转基因生物也可以包含在一种或多种异源启动子控制之下的任何一种或多种本发明的核苷酸序列。
在一个高度优选的实施方案中，所述转基因生物(或其部分)不包含一种启动子和按照本发明的核苷酸序列的组合，其中所述启动子和所述核苷酸序列均对该生物(或其部分)是天然的且处于其天然环境中。
术语“启动子”以本领域正常意义使用，例如为Jacob-Mond基因表达理论中的RNA聚合酶结合位点。所述启动子可以另外包括一种或多种特征，以确保或提高在合适宿主中的表达。例如，所述特征可以是保守区，诸如Pribnow框或TATA框。所述启动子甚至可以含有影响(诸如保持、增强、降低)本发明核苷酸序列表达水平的其它序列。例如，合适的其它序列包括Shl内含子或一种ADH内含子。其它序列包括诱导型元件，诸如温度、化学、光或胁迫诱导型元件。
此外，可以存在增强转录或翻译的合适元件。后一种元件的一个实例是TMW 5’信号序列(参见Sleat Gene 217217-225；和Dawson Plant Mol.Biol.2397)。
因此，一方面，按照本发明的核苷酸序列处于允许所述核苷酸序列表达的启动子控制之下。在该方面，所述启动子可以是细胞或组织特异性启动子。如果例如所述生物是一种植物，则所述启动子可以是影响所述核苷酸序列在种子、茎、芽、根或叶组织中的一个或多个中表达的启动子。
作为实例，用于本发明核苷酸序列的启动子可以是如PCT/EP95/02195中所述的α-Amy 1启动子(在其它情况下也称为Amy1启动子、Amy 637启动子或α-Amy 637启动子)。
或者，用于本发明核苷酸序列的启动子可以是如PCT/EP95/02196中所述的α-Amy 3启动子(在其它情况下也称为Amy 3启动子、Amy351启动子或α-Amy 351启动子)。关于Amy 351启动子，可以失活其一部分，使得部分失活的启动子以更特异性的方式表达所述核苷酸序列，诸如仅在一种特定组织类型或器官中表达。术语“失活的”是指在修饰所述启动子表达模式的意义上的部分失活，但其中所述部分失活的启动子仍作为启动子起作用。然而，如上所述，所述修饰的启动子能够在原始启动子的至少一种(而不是所有)特定组织中表达所述核苷酸序列。启动子序列(不必仅是Amy 351启动子的序列)的其它部分失活的实例，包括改变所述启动子序列的折叠模式、或与所述核苷酸序列结合的种类，使得所述核苷酸序列的一部分不为例如一种特定RNA聚合酶所识别。部分失活Amy 351启动子的另一种和最好的方式是将其截短，以形成其片段。另一种方式是使所述序列的至少一部分突变，使得所述RNA聚合酶不能与该部分或另一部分结合。
另一种修饰是使施加碳分解代谢物抑制的调节蛋白(例如已知来自丝状真菌的CreA蛋白)的结合位点突变，并由此消除所述天然启动子的分解代谢物抑制。
因此，本发明涉及利用重组DNA技术影响甘露糖与半乳糖之比。
在Sambrook，J.，Fritsch，E.F.，Maniatis T.(编辑)分子克隆-实验手册.第二版.Cold Spring Harbour Laboratory Press.New York 1989中，可以发现重组DNA技术的一般内容。
本发明也涉及诸如通过制备转基因植物影响植物或植物内的甘露糖与半乳糖之比。即使在EP-B-0470145和CA-A-2006454中未公开本发明的酶和核苷酸序列，但这两个文献确实提供了可以用来制备按照本发明的转基因植物的技术类型的某些有用的背景评论。这些背景技术中的某些的修改技术新增包括在以下评论中。
构建基因修饰的植物的基本原理是在所述植物基因组中插入遗传信息，以获得所插入遗传物质的稳定维持。
有几种技术插入所述遗传信息，两种主要原理是直接引入所述遗传信息和利用载体系统引入所述遗传信息。可以在Potrykus(Annu RevPhysiol Plant Mol Biol42205-225)和Christou(Agro-Food-Industry Hi-Tech 1994年3月/4月17-27)的论文中，找到一般技术的综述。
因此，一方面，本发明涉及一种载体系统，该载体系统携带按照本发明的核苷酸序列或构成物，并且能够将所述核苷酸序列或构成物引入诸如植物的生物的基因组中。所述载体系统可以包含一种载体，但它可以包含两种载体。在两种载体的情况下，所述载体系统通常称为双载体系统。在Gynheung An等，(1980)，Binary Vectors，PlantMolecular Biology Manual A3，1-19中进一步详细地描述了双载体系统。
一个广泛用于用给定启动子或核苷酸序列或构成物转化植物细胞的系统基于根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的Ti质粒或毛根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)的Ri质粒。An等(1986)，PlantPhysiol.81，301-305和Butcher D.N.等(1980)，Tissue Culture Methodsfor Plant Pathologists，编辑D.S.Ingrams和J.P.Helgeson，203-208。
已经构建的几种不同的适用于构建上述植物或植物细胞构成物的Ti质粒和Ri质粒。
本发明的核苷酸序列或构成物应该最好插入Ti质粒的T-DNA末端序列之间或邻近T-DNA序列插入，以避免破坏紧靠-DNA边缘的序列，因为至少这些区之一看来是将修饰的T-DNA插入植物基因组中所必需的。
正如根据以上解释所理解的，如果该生物为植物，则本发明的载体系统最好是含有感染该植物所必需的序列(例如vir区)和T-DNA序列的至少一个边界部分，所述边界部分位于所述基因构成物的同一载体上。
此外，该载体系统最好是根癌农杆菌的Ti质粒或毛根农杆菌的Ri质粒或它们的衍生物，因为这些质粒是熟知，并且广泛用于构建转基因植物，存在许多基于这些质粒或其衍生物的载体系统。
在转基因植物构建中，在将本发明的核苷酸序列或构成物插入植物之前，可以首先在所述载体可以在其中复制且易于操作的微生物中，构建所述核苷酸序列或构成物。一种有用的微生物的实例是大肠杆菌，但可以使用具有上述特性的其它微生物。当在大肠杆菌中构建以上定义的载体系统的载体时，必要时，将其转染入合适的农杆菌菌株中，例如根癌农杆菌。由此，最好将带有本发明核苷酸序列或构成物的Ti质粒转染入合适的农杆菌菌株中，例如根癌农杆菌，以便获得带有本发明核苷酸序列或构成物的农杆菌细胞，所述DNA随后转染入待修饰的植物细胞中。
如CA-A-2006454中报道的，可得到大量的克隆载体，它们含有在大肠杆菌中的复制系统和一种允许选择转化细胞的标记。所述载体包括例如pBR322、pUC系列、M13 mp系列、pACYC 184等。
这样，可以将本发明的核苷酸或构成物引入该载体的合适限制性位置中。所含有报道质粒用来转化入大肠杆菌中。在合适的营养培养基中培养所述大肠杆菌细胞，然而收获并裂解。然后回收质粒。作为分析方法，有一般使用的序列分析、限制性分析、电泳和其它生物化学-分子生物学方法。每次操作后，可以将所用的DNA序列进行限制性消化，并与下一种DNA序列连接。每种序列可以克隆入同一载体或不同的载体中。
在每种将按照本发明的构成物核苷酸序列引入所述植物中的方法后，可能必需存在和/或插入其它的DNA序列。如果例如使用Ti质粒或Ri质粒转化所述植物细胞，则可以连接Ti质粒和Ri质粒T-DNA的至少右边界，然而通常是右边界和左边界，来作为所引入序列的侧翼区。已经深入研究了使用T-DNA转化植物细胞，并且在EP-A-120516；Hoekema，The Binary Plant Vector System Offset-drukkerij Kanters B.B.，Alblasserdam，1985，第V章；Fraley等，Crit.Rev.Plant Sci.，41-46；和An等，EMBO J.(1985)4277-284中进行了描述。
用农杆菌直接感染植物组织是一种已经广泛使用的简单技术，在Butcher D.N.等(1980)，Tissue Culture Mehtods for Plant Pathologists，编辑D.S.Ingrams和J.P.Helgeson，203-208中有描述。对于该主题的其它内容，参见Potrykus(Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol42205-225)和Christou(Agro-Food-Industry Hi-Tech 1994年3月/4月17-27)。用该技术，可以对该植物的某一部分或组织进行感染植物，所述部分或组织即叶、根、茎或该植物另一部分的一部分。
通常，对于用携带本发明核苷酸序列的农杆菌直接感染植物组织，对待感染植物制造创伤，例如通过用剃刀切割或用针穿刺该植物或用磨料摩擦该植物而进行。然后，用农杆菌接种伤口。接种的植物或植物部分然后在合适的培养基上生长，并让其发育为成熟的植株。
当构建植物细胞时，这些细胞可以按照熟知的组织培养方法进行培养和维持，诸如将所述细胞在合适的补充必需生长因子(诸如氨基酸、植物激素、维生素等)的培养基中培养。
用已知用于从细胞或组织培养物再生植株的方法，例如通过用抗生素选择转化的苗并且将苗在含有合适营养物、植物激素等的培养基上传代培养，可以将转化细胞再生为遗传修饰的植物。
在EP-A-0449375中可以找到关于植物转化的进一步的内容。
可以在丹麦专利申请第940662号(于1994年6月10日申请)和/或英国专利申请第9702592.8号(于1997年2月7日申请)中，找到对于植物转化的其它有用的内容。
甚至可以参考Spngstad等(1995 Plant Cell Tissue Organ Culture 40第1-15页)，因为这些作者提出关于转基因植物构建的综述。
作为实例，通过用按照Joersbo和Okkels的方法(PCT/DK95/00221)的方法，用根癌农杆菌LBA4404转化瓜尔豆子叶外植体，可以得到按照本发明的转基因瓜尔豆植物。
以下样品根据布达佩斯条约，于1997年5月23日保藏于承认的保藏单位国立工业和海洋微生物保藏有限公司(NCIME)，23 St.MacharDrive，Aberdeen，Scotland，英国，AB21RY1.大肠杆菌DH5αpGEPI42.保藏号为NCIMB 40881。NCIMB40881含有克隆GEPI42-该克隆包含SEQ ID No.1。2.大肠杆菌DH5αpGEPI48.保藏号为NCIMB 40882。NCIMB40882含有克隆GEPI48-该克隆包含SEQ ID No.2。
因此，按照一个优选实施方案，本发明的核苷酸序列是UDP-半乳糖差向异构酶编码序列的反义序列，所述编码序列得自保藏号NCIMB 40881或NCIMB 40882号、或其变异体、同系物或片段。
按照一个更优选的实施方案，本发明的核苷酸序列是UDP-半乳糖差向异构酶编码序列的反义序列，所述编码序列得自保藏号NCIMB40881或NCIMB 40882号。
现在仅通过实施例描述本发明。从瓜尔豆(Cyamopsis tetragonoloba)中克隆UDP-半乳糖差向异构酶基因并对其进行部分特征鉴定对瓜尔豆的UDP-半乳糖4-差向异构酶(EC 5.1.3.2.)进行的生化研究已经表明，即使发现该酶的活性相当高，但UDP-半乳糖差向异构酶蛋白的量非常少，阻碍了用于氨基酸分析的制备性纯化。因此，选择的克隆策略是在galE-大肠杆菌突变体中进行功能互补。cDNA文库在质粒pcDNAII(Invitrogen Corporation)中构建代表来自未成熟瓜尔豆种子的mRNA的cDNA表达文库，并将其转化入大肠杆菌菌株Top10F’中。通过从大量随机挑出的分离的Top10F’菌落中纯化质粒，控制cDNA文库的质量。限制性酶切分析表明，所有检查的质粒均是重组的。UDP-半乳糖差向异构酶缺陷型大肠杆菌菌株大肠杆菌菌株PL-2由于galE基因缺陷而不能代谢半乳糖，而gal操纵子的两种其它基因galE和galT是完整的(Buttin，J Mol Biol，7，164-182(1963)；Wu和Kalckar，Proc Nat Acad Sci，USA 55，622-629(1966)。因此，将有活性的UDP-半乳糖差向异构酶基因插入PL-2中，将允许该菌株在半乳糖上生长。PL-2的转化和选择用Hanahan的方法(Techniques for transformation of E.coli IRLPress，Oxford(ISBN 0-947946-18-17)，109-135(1985)，使PL-2细胞为感受态。获得的滴度为5×106细胞/μg文库质粒。
选择培养基基本上是加入半乳糖的基本培养基，包含M9盐(Maniatis等，分子克隆-实验手册，Cold Spring Harbor，New York(ISBN 0-87969-136-0)，并加入0.05g/l苏氨酸、0.05g/l亮氨酸、0.05g/l甲硫氨酸、1.0g/l盐酸硫胺素、50mg/l氨苄青霉素、0.8g/l果糖、0.9g/l琼脂糖和6或8g/l半乳糖。该培养基在下文称为M9-ES6(含有6g/l半乳糖)或M9-ES8(含有8g/l半乳糖)。
用瓜尔豆cDNA文库转化感受态PL-2细胞，将细胞平板接种至选择基质M9-ES6或M9-ES8上。于37℃2天后，出现菌落(约转化子总数的1％)。选择了总共48个菌落。对选定菌落的UDP-半乳糖差向异构酶分析为了确立获得的在半乳糖上生长的能力是否由于存在UDP-半乳糖差向异构酶活性，用通过超声处理并随后通过离心澄清而产生的粗提取物，测试了所有选定菌落的UDP-半乳糖差向异构酶活性。UDP-半乳糖差向异构酶分析基本上按照Dey的方法(Phytochem，23，729-732(1984))进行。如预期的一样，PL-2提取物中UDP-半乳糖差向异构酶活性为零(阴性对照)，而在DH5α(阳性对照)中发现显著量的活性。选择表现出高水平UDP-半乳糖差向异构酶活性的转化PL-2菌落，用于进一步的分析。用来自菌落42和48的质粒DNA进行重新转化纯化来自菌落42和菌落48的质粒，重新转化入感受态PL-2细胞中，并细胞平板接种至M9-ES6或M9-ES8。在两个重新转化实验中，于37℃2天后，出现大量的菌落。每个实验分析了约10个独立菌落的UDP-半乳糖差向异构酶活性，所有的提取物含有的UDP-半乳糖差向异构酶活性均与在原始菌落42和48中发现的高水平相似。该实验证明，在PL-2衍生的菌落42和48中检测到的UDP-半乳糖差向异构酶活性由所述cDNA插入片段编码。
对菌落42和48中插入片段的DNA序列分析用Termo序列荧光周期测序试剂盒(Amersham)和ALF DNA测序仪(Pharmacia)，测定的所述含UDP-半乳糖-4-差向异构酶的克隆的部分核苷酸序列。
序列ID No.1和No.2分别显示了菌落42和48中插入片段的部分核苷酸序列以及推导的氨基酸序列。反义实验制备上述目的克隆的反义核苷酸序列，并用来通过上述技术转化瓜尔豆胶。
所得的分析揭示，通过插入一种或多种那些反义序列，可能提高瓜尔豆胶的甘露糖与半乳糖之比。因此，本发明基于下述令人惊奇的发现通过插入为反义核苷酸序列的核苷酸序列，可能提高瓜尔豆胶的甘露糖与半乳糖之比。
本发明的其它修改方法对于本领域技术人员而显而易见的。
参考文献Bojsen等(1993)PCT专利申请WO 94/20627Bulpin P V，Gidley M J，Jeffcoat R，Underwood D R.用植物α-半乳糖苷酶修饰半乳甘露聚糖的生物技术方法的开发。Carbohydr.Polymers 1990，12155。
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Maniatis T，Fritsch E F，Sambrook J(1982)，分子克隆-实验手册。Cold Spring Harbor Laboratory.Cold Spring Harbor，New York.ISBN0-87969-136-0。
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Reid J S G，Edwards M E.种子中的半乳甘露聚糖和其它细胞壁储存多糖。Food polysaccharides and their application.编辑A MStephen，Marcel Dekker，1995，第155-186页。
*****************核酸序列的翻译*****************在DNA序列GEPI42上进行。碱基总数为381。
102030405060| | | | | |GAATTCCTGAAATCTGAAGTGTGAAGAAGAATAATAATAAGGAACAGTGAGTGGGATTTG708090100110 120| | | | | |AAGGGAAAGAAGAAGAAGAAGAAGATGGTGTCGTCGAGGATGGCGTCAGGGGAAACAATTM V S S R M A S G E T I130 140 150 160 170 180| | | | | |CTGGTAACTGGAGGAGCTGGATTCATCGGATCTCACACGGTGGTTCAGCTTCTGAAGCAAL V T G G A G F I G S H T V V Q L L K Q190 200 210 220 230 240| | | | | |GGGTTTCACGTATCCATCATCGACAATCTCTACAACTCCGTCATCGACGCCGTCCATAGGG F H V S I I D N L Y N S V I D A V H R250 260 270 280 290 300| | | | | |GTTCGCCTTTTGGTGGGTCCACTCCTCTCCAGCAACCTCCATTTCCATCACGGCGACCTCV R L L V G P L L S S N L H F H H G D L310 320 330 340 350 360| | | | ||CGCAACATCCATGACCTCGACATCCTCTTCTCTAAAACCAAATTTGATGCCGTGATCCAAR N I H D L D I L F S K T K F D A V I Q370 380| |CTTGCGGGCCCCAAAGGTGTGL A G P K G VSEQ ID NO.1*****************核酸序列的翻译*****************在DNA序列GEPI48上进行。碱基总数为351。
102030405060| | | | | |GAATTCCTTCAAAGCTATCCATACCGCTTACGCATTCATTCACTCCACCTTCTCTTTCTC708090 100 110 120| | | | | |TCTCAGCTCCCTTCAATTATGTCATCCCAAACGGTTCTCGTCACCGGCGGAGCCGGTTACM S S Q T V L V T G G A G Y130 140 150 160 170 180| | | | | |ATCGGCAGCCACACCGTCCTTCAGCTTCTCCTCGGTGGTTTCAAGGCCGTTGTCGTTGACI G S H T V L Q L L L G G F K A V V V D190 200 210 220 230 240| | | | | |AACCTCGATAATTCTTCCGAGACCGCCATCCACAGAGTCAAGGAACTCGCCGGTAAATTCN L D N S S E T A I H R V K E L A G K F250 260 270 280 290 300| | | | | |GCCGGTAATCTCTCCTTTCACAAGTTAGACCTTCGGGACAGAGATGCGCTGGAAAAAATTA G N L S F H K L D L R D R D A L E K I310 320 330 340 350| | | | |TTTTCTTCCACAAAGTTTGATTCTGTCATACATTTTGCTGGACTGAAAGCAF S S T K F D S V I H F A G L K ASEQ ID NO.权利要求
1.体内修饰方法，该方法影响或者能够产生含甘露糖/半乳糖化合物的生物(或其部分)的甘露糖与半乳糖之比、或含甘露糖/半乳糖的化合物的甘露糖与半乳糖之比，其中所述体内修饰方法包括表达影响以下比率的核苷酸(a)含甘露糖/半乳糖化合物的甘露糖和半乳糖组分的甘露糖与半乳糖之比；和/或(b)含甘露糖/半乳糖化合物的甘露糖和半乳糖前体的甘露糖与半乳糖之比；并且其中所述核苷酸序列是UDP-半乳糖差向异构酶基因的至少一部分的反义核苷酸序列。
2.一种核苷酸序列的用途，所述核苷酸序列体内影响或者能够产生含甘露糖/半乳糖化合物的生物(或其部分)的甘露糖与半乳糖之比、或者含甘露糖/半乳糖的化合物的甘露糖与半乳糖之比，其中所述核苷酸序列是UDP-半乳糖差向异构酶基因的至少一部分的反义核苷酸序列，并且其中所述核苷酸序列影响(a)含甘露糖/半乳糖化合物的甘露糖和半乳糖组分的甘露糖与半乳糖之比；和/或(b)含甘露糖/半乳糖化合物的甘露糖和半乳糖前体的甘露糖与半乳糖之比。
3.按照权利要求1或权利要求2的发明，其中所述含甘露糖/半乳糖化合物为半乳甘露聚糖。
4.按照权利要求1-3中任一项的发明，其中所述能够产生含甘露糖/半乳糖化合物的生物是瓜尔豆植物。
5.按照权利要求1-4中任一项的发明，其中所述生物(或其部分)或其含甘露糖/半乳糖化合物的体内甘露糖与半乳糖之比高于所述瓜尔豆植物或其半乳甘露聚糖的所述比率。
6.按照权利要求1-5中任一项的发明，其中所述生物(或其部分)或其含甘露糖/半乳糖化合物的体内甘露糖与半乳糖之比与所述角豆或其半乳甘露聚糖的所述比率大致相似。
7.包含一种核苷酸序列的构成物，所述核苷酸序列为UDP-半乳糖差向异构酶基因至少一部分的反义序列。
8.包含一种核苷酸序列的载体，所述核苷酸序列为UDP-半乳糖差向异构酶基因至少一部分的反义序列。
9.包含一种核苷酸序列的质粒，所述核苷酸序列为UDP-半乳糖差向异构酶基因至少一部分的反义序列。
10.包含一种核苷酸序列的转基因生物(或其部分)，所述核苷酸序列为UDP-半乳糖差向异构酶基因至少一部分的反义序列。
11.按照权利要求10的转基因生物(或其部分)，其中所述生物为瓜尔豆植物。
12.按照任一前述权利要求的发明，其中所述核苷酸序列为UDP-半乳糖差向异构酶编码序列至少一部分的反义序列。
13.用权利要求1或其任一从属权利要求的方法制备的含甘露糖/半乳糖化合物。
14.包含按照权利要求13的含甘露糖/半乳糖化合物的食料。
15.一种组合物，包含与另一多糖混合的一种按照权利要求13的含甘露糖/半乳糖化合物。
16.一种组合物，包含与黄原胶、角叉藻聚糖和琼脂糖中任何一种或多种混合的一种按照权利要求13的含甘露糖/半乳糖化合物。
17.制备组合物或食料的方法，包括将按照权利要求13的含甘露糖/半乳糖化合物与另一合适的组分混合。
18.基本上如本文所述的方法。
全文摘要
描述了一种体内修饰方法。该方法影响或者能够产生含甘露糖/半乳糖化合物的生物(或其部分)的甘露糖与半乳糖之比、或含甘露糖/半乳糖的化合物的甘露糖与半乳糖之比,其中所述体内修饰方法包括表达影响以下比率的核苷酸:(a)含甘露糖/半乳糖化合物的甘露糖和半乳糖组分的甘露糖与半乳糖之比;和/或(b)含甘露糖/半乳糖化合物的甘露糖和半乳糖前体的甘露糖与半乳糖之比;并且其中所述核苷酸序列是UDP－半乳糖差向异构酶基因的至少一部分的反义核苷酸序列。
文档编号C12N9/90GK1264428SQ98807406
公开日2000年8月23日 申请日期1998年5月27日 优先权日1997年5月28日
发明者M·乔尔斯贝, J·布伦斯特德特, S·G·彼得森 申请人:丹尼斯科有限公司