基于d-丙氨酸缺陷型筛选标记的表达d-阿洛酮糖3-差向异构酶的重组枯草芽孢杆菌的构 ...的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明一种基于D-丙氨酸缺陷型筛选标记的表达D-阿洛酮糖3-差向异构酶的 重组枯草芽孢杆菌的构建方法，涉及一种DPE酶在枯草芽孢杆菌中的食品级表达，属于酶 基因工程技术领域。
【背景技术】
[0002] D-阿洛酮糖3-差向异构酶（DPE酶)属于D-塔格糖3-差向异构酶(简称DTE)家 族酶，可以催化多种酮糖C3位的差向异构，是生产稀有糖的良好的生物催化剂，可单独或 与其他酶偶联合成多种碳水化合物，被广泛的应用于化学、食品和制药等领域。目前，DPE酶 可催化D-果糖和D-阿洛酮糖之间的转化，利用D-果糖生产D-阿洛酮糖。
[0003] 随着由过量高能量食物摄入引发的一系列慢性病在世界范围内的爆发，膳食结构 越来越受到人们的关注。新型的蔗糖替代品的开发和研宄仍是功能性甜味剂领域具有重要 的经济价值的当务之急。D-阿洛酮糖是一种天然己酮糖，D-阿洛酮糖拥有蔗糖甜度的70%， 能量值却只有蔗糖的〇. 3%，具有较高的溶解度，较低的血糖反应。因此它是一种理想的甜味 剂，也是蔗糖的完美替代品。D-阿洛酮糖已于2011年被FDA认定为GRAS食品。此外D-阿 洛酮糖还可以减少脂肪堆积和清除活性氧等生理作用，在制药业中有很大的应用前景。
[0004] 自然界中，D-阿洛酮糖的含量极少，近年来通过新技术开发可实现其大规模生产。 D-阿洛酮糖的生产方法有化学法和生物法。化学合成法存在工艺复杂、副产物多、分离纯化 困难、食品安全性等问题。而通过D-阿洛酮糖3-差向异构酶（D-psicose 3-epimerase， DPEase，EC 5. I. 3. 30)把D-果糖差向异构化为D-阿洛酮糖的生物转化法因具有反应简 单、产物单一、纯化步骤容易等优点而逐渐吸引了众多科学家的关注，也成为D-阿洛酮糖 商业化生产的热点和焦点。
[0005] 枯草芽孢杆菌是芽孢杆菌的一个种，有长期制备发酵食品 的历史，是非致病的，且不产生毒素和致热致敏蛋白，被美国食品药物管理局（FDA)和中国 农业部等部门批准为食品级安全菌株。表达系统没有明显的密码子偏 好性，表达产物不容易形成包涵体，具有很强的蛋白分泌功能，有利于目的蛋白的回收和纯 化等后续操作，并且遗传背景研宄比较清楚，并具有多年的工业生产技术基础。
【发明内容】
[0006] 本发明目的是提供一株表达D-阿洛酮糖3-差向异构酶的食品级安全的重组枯 草芽孢杆菌，并可用于转化D-果糖生成D-阿洛酮糖。对D-阿洛酮糖的食品生产具有重要 的意义。
[0007] 本发明的技术方案：一种基于D-丙氨酸缺陷型筛选标记的表达D-阿洛酮糖 3_差向异构酶的重组枯草芽孢杆菌，其组成为lA751-pUB-P43-DPE-dal，分类命名为枯草 芽孢杆菌（AaciBw1S SK38. 001，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号 CCTCC NO ：Μ 2015257ο
[0008] 所述基于D-丙氨酸缺陷型筛选标记的表达D-阿洛酮糖3-差向异构酶的重组 枯草芽孢杆菌的构建方法，包括敲除枯草芽孢杆菌1Α751染色体上的D-丙氨酸消旋酶基 因 ?Λ得到宿主D-丙氨酸缺陷型的枯草芽孢杆菌1Α751 (?Γ);将来源于梭状芽胞杆菌 (C/oWrii/i腫sciflifeas ) ATCC 35704的D-阿洛酮糖3-差向异构酶DPE基因和Ρ43启 动子构建至质粒PUBllO中得到pUB-P43-DPE ;用D-丙氨酸消旋酶基因 W代替抗性基因 卡那霉素 Kan和博来霉素 Blm作为筛选标记的可复制质粒pUB-P43-DPE-dal ;并转化枯草 芽孢杆菌1A751 中表达，获得一株基于D-丙氨酸缺陷型筛选标记的表达D-阿洛 酮糖3-差向异构酶的重组枯草芽孢杆菌lA751-pUB-P43-DPE-dal，命名为枯草芽孢杆菌 SK38. 001，即 CCTCC NO :M 2015257。
[0009] 具体步骤为： (1)在枯草芽孢杆菌1A751染色体上的D-丙氨酸消旋酶基因乃的上下游各选 取800-900bp长度的片段作为同源臂。通过PCR将两段同源臂扩增，并胶回收。选取 抗性基因片段作为筛选标记。将上下游同源臂和片 段通过融合PCR将三段基因连接在一起。将PCR产物转入枯草芽孢杆菌1Α751感受态 中，在含有壮观霉素（5/7C)的平板上筛选。由于同源臂的存在，发生同源重组，敲除枯草 芽孢杆菌1Α751染色体上的D-丙氨酸消旋酶基因乃，得到D-丙氨酸缺陷型的宿主 1Α751 -spc。
[0010] (2)将pTSC质粒导入上述宿主lA751(W〇-spc中，在含有红霉素的平板上筛选。 在IPTG的诱导下，表达重组酶Cre，在重组酶Cre的作用下，和位点发生重组， 将5/7C抗性基因删除。并获得一株D-丙氨酸缺陷型的枯草芽孢杆菌1Α751 ( WO。
[0011] (3)在DPE酶基因的上游通过PCR技术融合强启动子Ρ43,并与DPE酶基因组成表 达单元P43-DPE，然后构建至质粒pUBl 10中，得到质粒pUB-P43-DPE。
[0012] (4)敲除质粒pUB-P43-DPE上的抗生素抗性基因 Kan和Blm，将D-丙氨酸消旋酶 基因（W)构建至表达载体pUB-P43-DPE中，得到质粒pUB- P43-DPE-dal。
[0013] (5)将重组质粒pUB- P43-DPE-dal转入宿主1A751 (?Γ)感受态中，在LB平板 上筛选，从而获得重组枯草芽孢杆菌lA751-pUB-P43-DPE-dal，即枯草芽孢杆菌 SK38. 001。
[0014] 为增强表达，在DPE基因的上游添加 P43启动子，P43启动子的核苷酸序列如SEQ NO. 1中1-300位所示。
[0015] 质粒pUB-P43-DPE-dal，其中含有所述SEQ ID NO. 1中301-1170位所示的DPE酶 基因和SEQ ID NO. 2所示的D-丙氨酸消旋酶基因 W，代替抗生素抗性基因卡那霉素 Kan 和博来霉素 Blm作为筛选标记。
[0016] 所述的重组枯草芽孢杆菌lA751-pUB-P43-DPE-dal的应用，可用于生产D-阿洛酮 糖，在化学、食品及制药领域中的应用。
[0017] 本发明的有益效果：本发明提供一株表达D-阿洛酮糖3-差向异构酶的重组枯草 芽孢杆菌 lA751-pUB-P43-DPE-dal，命名为枯草芽孢杆菌SK38. 001， 其可以D-果糖为底物生产D-阿洛酮糖。该重组菌在化学、食品和制药领域中具有重要的 应用价值。
[0018] 生物材料样品保藏：一株枯草芽孢杆菌5·?Α??75·)3Κ38. 001，已保藏于 中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，地址：中国武汉武汉大学，保藏编号CCTCC NO : M 2015257,保藏日期2015年4月28日。
【附图说明】
[0019] 图I :D-丙氨酸缺陷型枯草芽孢杆菌1A751 WO的构建过程。
[0020] 图2 :食品级安全质粒pUB- P43-DPE-dal构图。
[0021] 图3 :重组菌SK38. 001的发酵及酶活曲线。
【具体实施方式】
[0022] 实施例1 :D_丙氨酸缺陷型的枯草芽孢杆菌1A751 WO的构建
以质粒P7S6为模板，引物对P3/P4将^?71-577^抗生素抗性基因片段扩增并回 收。在枯草芽孢杆菌1Α751染色体上的D-丙氨酸消旋酶基因两侧选择800-900bp长 度的片段作为同源区域，将两端的同源区域分别用引物对P1/P2及P5/P6扩增并回收。
[0023] 用引物对P1/P6将两端同源臂片段与抗生素通过PCR技术融合 在一起。
[0024] PCR反应体系：0. 2mL PCR管中按顺序加入以下试剂：上下游引物各I. 5 yL ;5 UL Phusion HF buffer (5X) ;2 μ L IOmM dNTP mix (2. 5mM each) ;2yL 上游同源臂；0.5 yL 下游同源臂；0.5 yL Phusion high-fidelity DNA聚合酶；加蒸馈 水至终体积50 μ L。
[0025] PCR 扩增条件：98°C预变性 30s ;98°C变性 30s，55°C退火 15s，72°C延伸 Imin (30