个循环）；72°C延伸lOmin。
[0026] 将PCR产物转化至枯草芽孢杆菌1A751感受态，在含有抗生素5/7C和D-丙氨酸的 平板上进行筛选，得到一株1A751 WO- 5/7C。
[0027] 导入pTSC质粒(南京农业大学，闫新博士惠赠 ，NCBI accession no.EU864234)，在 IPTG的诱导下表达Cre重组酶，在重组酶的作用下，Iox77和Iox你位点发生重组，抗性基 因577C被删除（图1)。
[0028] 最终获得D-丙氨酸缺陷型的枯草芽孢杆菌1A751 (W)。
[0029] 实施例2 :食品级安全质粒pUB- P43-DPE_dal的构建
为增强表达，在DPE酶基因的上游融合强启动子P43,构成P43-DPE表达单元。利用引 物P7/P9扩增P43-DPE片段。以pUBllO为出发载体，利用引物对P8/P10,扩增载体骨架 pUB。然后将P43-DPE和pUB片段进行PCR，形成多聚体。
[0030] PCR反应体系：0· 2mL PCR管中按顺序加入以下试剂：5 μ L Phusion HF buffer (5X) ；2yL IOmM dNTP mix (2. 5mM each) ;2 μ L P43-DPE ;2 μ L pUB ;0· 5 μ L Phusion high-fidelity DNA聚合酶；加蒸馏水至终体积50 μ L。
[0031] PCR 扩增条件：98°C预变性 30s ;98°C变性 30s，55°C退火 15s，72°C延伸 Imin (30 个循环）；72°C延伸lOmin。
[0032] 将PCR产物直接转化宿主1A751中，在含有Kan的平板上筛选，得到质粒 PUB-P43-DPE。
[0033] 利用同样的方法，以枯草芽孢杆菌1A751染色体DNA为模板，引物对P13/P14扩 增D-丙氨酸消旋酶基因（W)。以质粒pUB-P43-DPE为模板，引物对P11/P12扩增载体 PUB-P43-DPE (KarT, ΒΙπΓ)。将片段 W和 pUB-P43-DPE (KarT, BlnO相互 PCR，转化宿主 1Α751 (W〇。在 LB 平板上筛选得到 pUB-P43-DPE-dal。（图 2)。
[0034] 实施例3:重组菌的发酵 I. DPE酶活测定方法：lmL的反应体系中，加入800 yL的用磷酸盐缓冲液（50mM， pH7. 0)溶解的100g/L的D-果糖，200 yL的发酵液，55°C保温lOmin，然后煮沸IOmin以终 止酶反应。
[0035] 2.用HPLC检测D-阿洛酮糖的生成量，计算酶活。酶活单位（U):每分钟催化产生 Iymol D-psicose所需要的酶的量。
[0036] 3.用接种环从平板上挑取新鲜的菌落接种至种子培养基中，37°C、200rpm，培养 12~14h。以3%的接种量接种至发酵培养基中，37°C、200rpm，并定时取样，测定0D_，酶活数 据（图3)。
[0037] 种子培养基：胰蛋白胨（10g/L)，酵母提取物（5g/L)，NaCl(10g/L)，以纯净水配 制。
[0038]发酵培养基：葡萄糖（15g/L)，酵母膏（15g/L)，NaCl (8g/L)，MgSO4 (lg/L)， Na2HP04(lg/L)，pH 7· 25,以纯净水配制。
【主权项】
1. 一种基于D-丙氨酸缺陷型筛选标记的表达D-阿洛酮糖3-差向异构酶的重组 枯草芽孢杆菌，其组成为lA751-pUB-P43-DPE-dal，分类命名为枯草芽孢杆菌 SK38. 001，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCCNO:M2015257。2. 权利要求1所述基于D-丙氨酸缺陷型筛选标记的表达D-阿洛酮糖3-差向异构 酶的重组枯草芽孢杆菌的构建方法，其特征在于包括敲除枯草芽孢杆菌1A751染色体上的D-丙氨酸消旋酶基因山厶得到宿主D-丙氨酸缺陷型的枯草芽孢杆菌1A751 (山尸）；将来 源于梭状芽胞杆菌ATCC35704的D-阿洛酮糖3-差向异构酶 DPE基因和P43启动子构建至质粒pUBllO中得到pUB-P43-DPE;用D-丙氨酸消旋酶基因W 代替抗性基因卡那霉素Kan和博来霉素Blm作为筛选标记的可复制质粒pUB-P43-DPE-dal; 并转化枯草芽孢杆菌1A751WO中表达，获得一株基于D-丙氨酸缺陷型筛选标记的表 达D-阿洛酮糖3-差向异构酶的重组枯草芽孢杆菌lA751-pUB-P43-DPE-dal，命名为枯草 芽孢杆菌（feci/Az1SSK38. 001，即CCTCCNO:M2015257。3. 根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于具体步骤为： (1) 在枯草芽孢杆菌1A751染色体上的D-丙氨酸消旋酶基因山/的上下游各选 取800-900bp长度的片段作为同源臂，通过PCR将两段同源臂扩增，并胶回收；选取 抗性基因片段作为筛选标记，将上下游同源臂和片 段通过融合PCR将三段基因连接在一起；将PCR产物转入枯草芽孢杆菌1A751感受态 中，在含有壮观霉素5/7C的平板上筛选；由于同源臂的存在，发生同源重组，敲除枯草 芽孢杆菌1A751染色体上的D-丙氨酸消旋酶基因山人得到D-丙氨酸缺陷型的宿主 1A751{daV)-spc； (2) 将pTSC质粒导入上述宿主lA751(W_)-spc中，在含有红霉素的平板上筛选，在 IPTG的诱导下，表达重组酶Cre，在重组酶Cre的作用下，和位点发生重组，将 spc抗性基因删除，并获得一株D-丙氨酸缺陷型的枯草芽孢杆菌1A751 (WO; (3) 在DPE酶基因的上游通过PCR技术融合强启动子P43,并与DPE酶基因组成表达单 元P43-DPE，然后构建至质粒pUBl10中，得到质粒pUB-P43-DPE; (4) 敲除质粒pUB-P43-DPE上的抗生素抗性基因Kan和Blm，将D-丙氨酸消旋酶基因 W构建至表达载体PUB-P43-DPE中，得到质粒pUB-P43-DPE-dal; (5) 将重组质粒pUB-P43-DPE-dal转入宿主1A751W0感受态中，在LB平板上 筛选，从而获得重组枯草芽孢杆菌lA751-pUB-P43-DPE-dal，即枯草芽孢杆菌 SK38. 001。4. 根据权利要求2或3所述的构建方法，其特征在于为增强表达，在DPE基因的上游添 加P43启动子，P43启动子的核苷酸序列如SEQNO. 1中1-300位所示。5. 根据权利要求2或3所述的构建方法，其特征在于质粒pUB-P43-DPE-dal，其中含有 所述SEQIDNO. 1中301-1170位所示的DPE酶基因和SEQIDNO. 2所示的D-丙氨酸消旋 酶基因山人代替抗生素抗性基因卡那霉素Kan和博来霉素Blm作为筛选标记。6. 权利要求1所述的重组枯草芽孢杆菌lA751-pUB-P43-DPE-dal的应用，其特征在于 可用于生产D-阿洛酮糖，在化学、食品及制药领域中的应用。
【专利摘要】基于D-丙氨酸缺陷型筛选标记的表达D-阿洛酮糖3-差向异构酶的重组枯草芽孢杆菌的构建方法，属于酶基因工程技术领域。以枯草芽孢杆菌1A751为出发菌株，敲除其染色体上D-丙氨酸消旋酶基因(dal)得到D-丙氨酸缺陷型的1A751(dal-)；将梭状芽胞杆菌ATCC 35704 的DPE酶基因作亲本，在其上游融合P43启动子构建成P43-DPE，将其构建至质粒pUB110 (NCBI-Gene ID:9507338)中得到pUB-P43-DPE，将pUB-P43-DPE上的抗生素抗性基因Kan和Blm用dal替代，构建成pUB-P43-DPE-dal；再转化进1A751(dal-)中，得重组枯草芽孢杆菌1A751-pUB-P43-DPE-dal，命名为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）SK38.001，保藏编号CCTCC NO: M2015257。其发酵液总酶活达16U/mL，具有重要的工业应用价值。CCTCC NO：M201525720150428
【IPC分类】C12N15/61, C12N1/21, C12P19/02, C12R1/125, C12N15/75
【公开号】CN104894047
【申请号】CN201510294626
【发明人】江波, 沐万孟, 何伟伟, 张涛
【申请人】江南大学
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月2日