专利名称：一种微生物乳糖酶的固定化方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种酶的固定化方法，尤其涉及一种微生物胞外乳糖酶的固定化方法及由该方法制备得到的固定化乳糖酶以及该固定化乳糖酶在生产低乳糖牛奶中的应用。
背景技术：
β-半乳糖苷酶(β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶，EC3.2.1.23)通常被称为乳糖酶。该酶能将乳糖水解为半乳糖和葡萄糖，并具有半乳糖苷的转移作用。
乳糖由一分子α-D-葡萄糖和一分子β-D-半乳糖缩合而成，是以葡萄糖为苷元的β-D-半乳糖苷。乳糖是牛奶和乳清中的主要成分，乳糖约占牛奶干物质的30％，影响风味。许多人因体内缺乏乳糖酶而难以消化牛奶(因人种而异，西欧占2～8％，亚洲、非洲占60～90％)，饮用牛奶后，乳糖到了肠里，被肠道细菌分解发酵，产生大量二氧化碳气体，使肠道膨胀，并兴奋肠道蠕动，使收缩加强，造成肠鸣和腹泻，这种疾病称作乳糖不耐受症(G.G.伯奇等，酶与食品加工，轻工业出版社，1991，p93～110)。
生产低乳糖牛奶和乳制品是解决乳糖不耐受症的有效方法。去除乳糖或生产低乳糖牛奶的方法有三种物理去除法，酸水解法和酶水解法。
(1)物理去除法采用超滤技术去除乳糖，虽可将大部分乳糖去除，但维生素和矿物质也随之损失，不得不在去除乳糖后再将它们添加进去，这也造成了乳糖的极大浪费。
(2)酸解法是在极端条件下(pH1～2，温度100～150℃)用游离酸或离子交换树脂水解溶液中的乳糖。尽管酸解法在短时间内能得到高转化率，但它会导致蛋白失活，会形成一些副产物，不能用于水解牛奶，而且酸法需要抗腐蚀设备，对环境也不利。
(3)酶水解法条件比较缓和(pH3.5～8，温度5-60℃)。它是使用外源乳糖酶把乳糖降解为易被人体吸收利用的单糖。采用这种方法，产物简单，口感好，不会破坏牛奶中其它营养成分，是目前在乳制品加工中采用的好方法。
乳糖酶将乳糖分解为易被人体吸收利用的葡萄糖、半乳糖，能解决乳糖不耐受症患者食用乳制品的问题。除此之外，乳糖酶还能改良乳制品的品质和生产低聚半乳糖。低聚半乳糖作为功能性低聚糖，具有双歧杆菌增值因子及与其相关的生理功能低甜度低热量，低龋齿性，能改善脂质代谢，改善矿物元素的吸收利用。
乳糖酶广泛存在于植物、动物、微生物中。它在乳品加工中的潜力在上世纪初即为人们所知。60年代，由微生物中提取的乳糖酶商业化生产。目前，商品化的乳糖酶主要来源于黑曲霉、米曲霉、乳酸克鲁维酵母和克鲁维脆壁酵母等。现有技术中游离乳糖酶的制备通常需要从细胞中提取乳糖酶，导致乳糖酶的单位产量较低。中国农业科学院生物技术研究所等开发出了一种新乳糖酶，从Aspergillus candidus CGMCC3.2919中分离克隆到乳糖酶编码基因，利用生物反应器毕赤酵母(Pichia pastoris)高效表达，其表达产物分泌于胞外，乳糖酶活为3600u/mL；发酵生产乳糖酶蛋白占发酵液中总分泌蛋白的90％以上，杂蛋白含量很少；解决了现有技术中需要从细胞中提取乳糖酶的缺陷，大大提高了乳糖酶的单位产量，从而为乳糖酶产品工业化生产开辟了一条新途径(中国专利申请号CN 02108141.7，
公开日期2003年10月8日)。
当游离酶用于食品工业时，会造成杂蛋白污染。同时，游离酶无法反复利用，使得生产成本提高。与游离酶相比，固定化酶有着如下优点(1)具较好的机械强度，可在搅拌或装柱的方式下进行作用；(2)可用于工业化生产，适应连续化、自动化生产的要求；(3)产物纯度高、副反应少，因此产率较高；(4)可反复使用。提高了酶的利用率，降低了生产成本。
上世纪70年代，意大利用醋酸纤维素制备固定化乳糖酶成功实现了低乳糖牛奶的生产(F.Morisi，Jouranl of dairy science，1972，56(9)，1123-1127；57(3)，269-272)。但在固定化酶制备过程中使用氯仿和甲苯，这两种有机溶剂用于食品工业令人无法接受。美国(美国专利4,748,121)、日本(日本专利56051984)也报道了乳糖酶的固定化，但美国专利中的载体制备复杂，日本工艺中需要对微生物胞内乳糖酶进行提取。国内骆承庠、秦燕、王莜兰等人进行了固定化乳糖酶生产低乳糖牛奶的尝试，或用卡拉胶等包埋固定化，或用棉纤维吸附戊二醛交联方法，或用透性化细胞乳糖酶及中空纤维生化反应器，均不适用于微生物胞外乳糖酶的固定化。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种新的微生物胞外乳糖酶的固定化方法。
本发明所要解决的技术问题是通过以下技术途径来实现的一种微生物胞外乳糖酶的固定化方法，包括以下步骤(1)按现有技术方法制备胞外游离乳糖酶；(2)将游离乳糖酶吸附于孔径范围为80～200的大孔树脂上；(3)将吸附了酶的大孔树脂用海藻酸钠溶液浸泡，搅拌，滤出，再进行包埋处理；(4)将步骤(3)中经过包埋处理的大孔树脂用交联试剂，在4～20℃下交联1～4小时，滤出，即得固定化酶。
上述固定化方法中，其中步骤(1)中所述的胞外游离乳糖酶可采用现有技术中任意一种方法制备得到，作为参考可选用申请号为CN 02108141.7的专利申请所公开的方法制备得到。步骤(2)中所述的吸附方法为每1g树脂加入100～500单位的乳糖酶液，吸附温度为10～50℃，振荡吸附时间为1～4小时。步骤(2)中所述的大孔树脂的孔径优选为100～120。步骤(3)中所述的海藻酸钠溶液的重量百分比浓度优选为1％～5％；进行包埋处理所用的试剂选自CaCl2溶液、卡拉胶或明胶，优选为浓度为0.1～1.0mol/L的CaCl2溶液。步骤(4)中所述的交联试剂优选为重量百分比浓度为0.25％～2.5％的戊二醛。
本发明中所用到的大孔树脂均可从市场购买得到，只要孔径范围为80～200，即可满足本发明的使用，例如可以选用下述型号的大孔树脂D001、D001-CC、D061、D113、DA201、HPD600、HPD300、HPD100A、D202等。
本发明以普通市售树脂作为乳糖酶固定化吸附载体，经过简单的包埋、交联处理得到性能优良的固定化乳糖酶。整个操作过程不需对乳糖酶进行繁琐的提取和纯化步骤，使得生产成本大为下降。同时，固定化酶的操作稳定性很好。利用本发明的制备工艺，可实现乳糖酶的有效固定化；经测定，本发明固定化方法所制备的固定化乳糖酶的酶活大于70～100u/g，酶活收率50％～60％，能直接用于低乳糖牛奶的生产。
用本发明方法制备的固定化乳糖酶作为生物催化剂水解5％乳糖溶液，固定化酶用量为10％～100％，30℃下作用0.5～10h，乳糖水解率在80％以上，连续转化50批以上。以此固定化乳糖酶处理新鲜牛奶(其中乳糖含量3％～6％)，5～60℃下转化0.2～8小时，乳糖水解率在70～80％，单位固定化酶处理牛奶的生产效率为1.25L/g·h。
以下通过实施例进一步阐明本发明的有益效果，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的范围。
具体实施例方式
说明本申请中除特殊说明，所用到的溶液均为水溶液。
乳糖酶酶活和乳糖含量的测定方法游离乳糖酶活性测定方法取适当稀释的乳糖酶酶液1mL，30℃保温2分钟，加入10mL 5％(g/100mL)乳糖溶液，30℃反应15分钟后，沸水浴10分钟终止反应，测定反应前后乳糖含量的变化。30℃下，乳糖酶每分钟水解1μmol乳糖所需的酶量为一个酶活单位(u)。
固定化乳糖酶活性测定方法取0.5g固定化乳糖酶，加入25mL 5％(g/100mL)乳糖溶液，30℃反应15分钟后，取反应液进行沸水浴10分钟终止反应，测定反应前后乳糖含量的变化。30℃下，乳糖酶每分钟水解1μmol乳糖所需的酶量为一个酶活单位(u)。
乳糖含量测定方法HPLC测定乳糖含量，所用设备为Agillent 1100高效液相色谱仪，示差折光检测器，固定相为Agilent Zorbax CarbohydrateAnalysis Column，流动相组成，乙腈∶水＝70∶30，流速0.5mL/min。乳糖出峰时间为18.098min。以峰高为定量标准。
牛奶中乳糖含量测定前的处理方法取2mL牛奶于10mL容量瓶中，加入1mL 20％醋酸铅溶液，摇匀；再加入1mL草酸钾-磷酸氢二钠溶液(3g草酸钾和7g磷酸氢二钠溶解于100mL水中配制而成)，摇匀，定容；静置30分钟后用干燥滤纸过滤，0.45μm滤膜处理后经HPLC分析样品中乳糖含量。
实施例1按照专利申请号为CN 02108141.7的专利申请所公开的方法制备细胞外游离乳糖酶；以孔径范围为100～120的大孔树脂D113为乳糖酶吸附载体，固定化工艺为树脂用量为每1g树脂加入200单位的胞外游离乳糖酶酶液，吸附温度10℃，振荡吸附时间4小时，滤出已吸附酶的树脂，加入浓度为2％的海藻酸钠溶液中搅拌，滤出，置于0.1mol/L CaCl2溶液中浸泡5分钟，滤出树脂，再加入浓度2.5％的戊二醛中，在温度4℃下静置交联1小时。测定固定化酶活为91u/g，酶活收率为56.88％。
实施例2按照专利申请号为CN 02108141.7的专利申请所公开的方法制备细胞外游离乳糖酶；以孔径范围为80～120的大孔树脂D001-CC为乳糖酶吸附载体，固定化工艺为树脂用量为每1g树脂加入100单位的胞外游离乳糖酶酶液，吸附温度35℃，振荡吸附时间2小时，滤出已吸附酶的树脂，加入浓度为5％的海藻酸钠溶液中搅拌，滤出，置于1mol/L CaCl2溶液中浸泡5分钟，滤出树脂，再加入浓度为0.25％的戊二醛中，在温度20℃下静置交联3小时。测定固定化酶活为94u/g，酶活收率为58.98％。
实施例3按照专利申请号为CN 02108141.7的专利申请所公开的方法制备细胞外游离乳糖酶；以孔径范围为100～120的大孔树脂HPD300为乳糖酶吸附载体，固定化工艺为树脂用量为每1g树脂加入500单位的胞外游离乳糖酶酶液，吸附温度50℃，振荡吸附时间1小时，滤出已吸附酶的树脂，加入浓度为1％的海藻酸钠溶液中搅拌，滤出，置于0.6mol/L CaCl2溶液中浸泡5分钟，滤出树脂，再加入浓度为1％的戊二醛中，在温度10℃下静置交联4小时。测定固定化酶活为93u/g，酶活收率为57.76％。
试验例1树脂筛选试验按照中国专利申请号为CN 02108141.7的专利申请所公开的方法制备细胞外游离乳糖酶；用D001、D001-CC、D061、D113、DA201、HPD600、HPD300、HPD100A、D202等不同型号的、孔径范围为80～200的大孔树脂各3g，分别加入280.89u/mL的乳糖酶液3mL，于20℃下，振荡吸附4小时，测定树脂吸附固定的乳糖酶活，计算酶活收率，结果见表1。
表1 树脂筛选结果
上述筛选结果表明，采用孔径范围为80～200的大孔树脂所吸附固定的乳糖酶均有较高的酶活收率，其中优选孔径范围为100～120的大孔树脂。
试验例2本发明固定化乳糖酶催化乳糖水解效果试验一、试验材料1、供试样品本发明实施例1所制备的固定化乳糖酶。
2、乳糖溶液浓度为50g/L。
二、试验方法及结果将供试样品于30℃下转化底物为50g/L的乳糖溶液，固定化酶量为底物溶液的10％(g/100mL)，转化时间曲线见表2。
表2 转化时间曲线
确定转化时间为1小时，进行反复分批转化52批，结果见表3。
表3 本发明固定化酶反复分批转化乳糖溶液的试验结果
上述试验结果表明，本发明所制备的固定化乳糖酶酶活性高，具有较高的水解乳糖效率。
试验例3将实施例2所制备的固定化乳糖酶，30℃下转化牛奶(市售，光明牌鲜牛奶，下同)，固定化酶量为牛奶用量的10％(g/100mL)，在不同时间取样测定牛奶样品中乳糖含量，转化时间曲线见表4。
表4 固定化乳糖酶转化牛奶过程中乳糖含量变化
作用时间为8小时。进行反复分批转化30批，结果见表5。
表5 本发明固定化乳糖酶水解牛奶1-30批试验结果
*其中第16批开始换用新购的牛奶。
上述试验结果表明，本发明所制备的固定化乳糖酶酶活性高，对于牛奶中的乳糖有较高的水解率。
试验例4将实施例3所制备的同定化乳糖酶，60℃下转化牛奶(市售，光明牌鲜牛奶)，固定化酶量为牛奶用量的100％(g/100mL)，转化时间为15分钟，结果见表6。
表6 60℃下固定化酶转化牛奶
试验例5将实施例1的方法制备固定化乳糖酶，于5℃～7℃下转化牛奶(市售，光明牌鲜牛奶)，固定化酶量为牛奶用量的100％(g/100mL)，转化时间为30分钟，结果见表7。
表7 低温下固定化酶转化牛奶
权利要求
1.一种固定游离乳糖酶的方法，包括以下步骤(1)按现有技术方法制备游离乳糖酶；(2)将游离乳糖酶吸附于孔径范围为80～200的大孔树脂上；(3)将吸附了酶的大孔树脂用海藻酸钠溶液浸泡，搅拌，滤出，再用包埋试剂进行包埋处理；(4)将步骤(3)中经过包埋处理的大孔树脂用交联试剂，在4～20℃下交联1～4小时，滤出，即得固定化酶。
2.按照权利要求1的方法，其特征是步骤(2)中所述的吸附方法为每1g树脂加入100～500单位的乳糖酶液，吸附温度为10～50℃，振荡吸附时间为1～4小时。
3.按照权利要求1的方法，其特征是步骤(2)中所述的大孔树脂的孔径为100～120。
4.按照权利要求1的方法，其特征是步骤(3)中所述的海藻酸钠溶液的重量百分比浓度为1％～5％；所述的包埋试剂选自CaCl2溶液、卡拉胶或明胶。
5.按照权利要求4的方法，其特征是所述的包埋试剂为浓度为0.1～1.0mol/L的CaCl2溶液。
6.按照权利要求1的方法，其特征是步骤(4)中所述的交联试剂为浓度为0.25％～2.5％的戊二醛。
7.一种固定化乳糖酶，其特征是由权利要求1～6任一所述方法制备得到的产品。
8.权利要求7所述的固定化乳糖酶在食品生产中的用途。
9.按照权利要求8所述的用途，其特征是在生产低乳糖牛奶中的用途。
全文摘要
本发明涉及一种乳糖酶的固定化方法及固定化乳糖酶的应用。该发明利用发明人筛选得到的树脂作为载体吸附固定用重组毕赤酵母发酵得到过滤清液中的胞外游离乳糖酶；再将这种吸附了酶的载体用海藻酸钙包埋方法与戊二醛交联方法处理，制备成高结合强度的固定化乳糖酶。以该方法制备的固定化乳糖酶作为生物催化剂水解5％乳糖溶液，固定化酶用量为10～100％(w/v)，5～60℃下作用0.5～1小时，连续转化52批，乳糖水解率保持在75％以上；以该方法制备的固定化乳糖酶处理新鲜牛奶，5～60℃下转化0.2～8小时，连续转化30批，乳糖水解率保持在70％以上。
文档编号C12N11/08GK1724662SQ20051008049
公开日2006年1月25日 申请日期2005年7月6日 优先权日2005年7月6日
发明者孙志浩, 范云六, 张伟, 姚斌, 伍宁丰, 王磊, 余宏峰 申请人:江南大学, 中国农业科学院生物技术研究所