专利名称：固定化乳糖酶及其制备方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明是关于一种固定化乳糖酶及其制备方法与应用，同时还关于包含所述固定 化乳糖酶的生产低乳糖牛奶的反应装置、利用所述固定化乳糖酶生产低乳糖牛奶的方法， 以及所述固定化乳糖酶的微生物污染防治方法。
背景技术：
牛奶中含有4. 8 %左右的乳糖，全脂牛奶中约30 %的热量是由乳糖提供的。正常 情况下，乳糖可在人体小肠上皮细胞的乳糖酶作用下，水解成葡萄糖和半乳糖后被吸收而 进入血液。但随着人类的生长发育，体内乳糖酶活性呈规律性衰减，结果造成乳糖吸收障 碍。世界上很多人都存在不同程度的乳糖不耐症现象，他们如果一次摄入较多乳糖，乳糖不 能及时被消化吸收，不能被吸收的乳糖进入结肠后被肠道微生物分解，产生大量乳酸、甲酸 等短链脂肪酸和氢气，造成渗透压升高，使肠腔中的水分增多，引起腹胀、肠鸣、肠绞痛、腹 泻等症状。据调查，在亚洲、非洲、特别是我国人群中，大约80%的人都有不同程度的乳糖不 耐症症状。乳糖不耐症已经成为制约我国乳制品消费的重要因素之一，解决这一问题的行 之有效的方法之一就是用乳糖酶将牛奶中的乳糖水解，制成低乳糖牛奶。传统的低乳糖牛奶的制备方法是直接将游离的乳糖酶添加到牛奶中，在一定的温 度下水解一段时间，制成低乳糖牛奶。这种制备低乳糖牛奶的方法中，乳糖酶不能回收，在 一定程度上造成资源的浪费，生产成本高，而且残留在牛奶中的乳糖酶可能会对牛奶的品 质产生不良的影响，如乳糖酶中掺杂的其他蛋白酶会在低乳糖牛奶的贮存期间使牛奶蛋白 质分解产生苦味。近年来，相关人员对固定化乳糖酶的技术进行了研究，以期能把游离的乳糖酶固 定在载体上制成固定化乳糖酶来生产低乳糖牛奶，以解决游离乳糖酶生产低乳糖牛奶的缺 点。固定化乳糖酶有重复使用的特点，可以节省低乳糖牛奶的生产成本，加工时间也会缩 短，并且乳糖酶也不会残留在最终的低乳糖牛奶产品中，有利于保护产品的品质，而且可实 现工业化连续生产低乳糖牛奶。已有报道的乳糖酶固定化方法多为包埋法、吸附法、交联法或多种方法组合使 用或其他方法，例如CN 1818061A公开了海藻酸钠包埋法固定化乳糖酶；CN1258452A公 开了以微孔玻璃珠或硅胶珠为支持物吸附嗜热菌乳糖酶以应用于生成低乳糖牛奶；CN 1724662A公开了用树脂吸附、海藻酸钠包埋、戊二醛交联三种方法结合固定乳糖酶；CN 1769440A公开了一种以壳聚糖为载体、三羟甲基膦为交联剂固定化高温β _半乳糖苷酶的 方法；CN2390887Y公开了利用带有超滤膜壁的中空纤维截留法固定乳糖酶；此外，王静等 人研究了以阳离子交换树脂D151为载体、戊二醛为交联剂，吸附交联黑曲霉乳糖酶制备固 定化乳糖酶，并用于连续生产低乳糖乳(阳离子交换树脂D151固定化乳糖酶研究，河北农 业大学学报.第29卷第4期，2006年7月；利用固定化乳糖酶连续生产低乳糖乳的研究， 食品工业科技.2 008年第09期)；潘晓亚等人对以明胶为载体包埋固定乳糖酶技术进行了 研究(明胶载体固定化乳糖酶技术研究，乳品加工.2006. 03)；……。
上述目前已有的固定化乳糖酶的技术研究中，大多停留在对固定化过程的研究， 通常酶活损失较大，所固定的酶普遍具有针对性，或选用的载体稳定性较差，与酶之间的结 合力较差；虽有研究提到固定化酶的装置，但其适用性较差，不容易实现工业化生产。另外， 在固定化乳糖酶的工业化应用中，还应注意固定化酶的清洗问题，以防止固定化酶被微生 物污染，然而，上述研究中均未涉及对固定化酶的微生物污染防治技术，难以满足工业化生 产的要求。因此，固定化乳糖酶技术仍有待进一步研究。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种固定化乳糖酶，以降低工业化生产低乳糖牛奶的成本，并解决低乳糖牛奶的品质问题。本发明的另一目的在于提供制备所述固定化乳糖酶的方法。本发明的另一目的在于提供所述固定化乳糖酶的应用，具体是其在生产低乳糖牛 奶中的应用。本发明的另一目的在于提供一种包含所述固定化乳糖酶的生产低乳糖牛奶的反
应装置。本发明的另一目的在于提供一种利用所述固定化乳糖酶生产低乳糖牛奶的方法。本发明的另一目的在于提供一种所述固定化乳糖酶的微生物污染防治方法。一方面，本发明提供了一种固定化乳糖酶，该固定化乳糖酶是利用带有氨基基团 (-NH2)的载体经戊二醛处理制成活化载体、然后再固定乳糖酶而成。另一方面，本发明还提供了一种制备所述固定化乳糖酶的方法，该方法包括步骤 取带有氨基基团的载体，经戊二醛处理使载体的氨基与戊二醛的醛基结合，制成活化载体； 在活化载体上固定乳糖酶，使活化载体的醛基与酶的氨基结合，得到固定化乳糖酶。为解决现有技术中固定化乳糖酶技术所存在的酶活损失高、酶与载体结合不牢固 等问题，本案发明人对固定化乳糖酶技术进行了研究。发明人在研究中发现，载体种类的选 择以及合适的固定化方式对固定化酶的活性和稳定性是至关重要的，本发明针对乳糖酶的 结构特性，找到了一种适合固定化乳糖酶的载体，即本发明中所述的带有氨基基团的载体， 所述的氨基基团是具有活性的氨基基团，该载体经戊二醛处理，可使载体的活性氨基与交 联剂戊二醛的一个醛基结合，然后再将乳糖酶固定于戊二醛的另一个醛基上，制成的活性 载体对乳糖酶的结合程度较高，使得固定化酶的活性稳定，能有效提高固定化酶的利用效 率。本发明中，所述带有氨基基团的载体可以商购获得，也可以按照现有技术的记载 自行制备得到，现有技术中主要是利用带有氨基基团的载体负载一些药物活性组分或催化 剂等。本发明中所述的氨基基团包括氨基、胼基、酰胼基等含有活性-NH2W基团。根据本发 明的具体实施方案，为使所制备得到的固定化乳糖酶具有一定的刚性结构，即不可压缩型， 以利于将固定化乳糖酶应用于低乳糖奶的工业化生产，本发明中要求所选用的载体具有一 定的机械强度。根据本发明优选的具体实施方案，本发明中可选用氨基化二氧化硅、含有氨 基的树脂聚合物或含有酰胼基的树脂聚合物作为本发明的载体，其活性基团为氨基。在本 发明的一更优选的具体实施方案中，所述载体颗粒粒径0. 5 1. 2毫米，其形状可为基本上 微球状颗粒等，颗粒密度100 150毫升/100克抽干载体，120 160毫升/100克风干载体。本发明中对所固定的乳糖酶无特殊要求，可以为各种微生物来源或动植物来源的乳糖酶，可以是商购乳糖酶产品。根据本发明的具体实施方案，本发明的固定化乳糖酶，其酶活> 100U/g，最适反应 PH值为6. 5 7. 0，最适反应温度38 41°C。在本发明的更具体的一实施方案中，所述固定 化乳糖酶的活性为100 200U/g，反应动力学常数Km为250 300mmol/L，Vmax为0. 1 1.Ommol/g · min。根据本发明的具体实施方案，本发明的制备固定化乳糖酶的方法包括步骤取带有氨基基团的载体，加入戊二醛溶液，在室温下处理5 10小时，使载体的氨 基与戊二醛的醛基结合，制成活化载体；发明人在研究中发现，该步骤中戊二醛溶液的浓度 将直接影响固定化酶产品的活性，本发明中优选使用戊二醛浓度 5% (除特别说明 夕卜，本发明中所述比例和含量均为重量比例和含量)的水溶液处理带有氨基基团的载体以 制备活化载体。戊二醛溶液的量能浸没载体即可；将活化载体浸入到乳糖酶溶液中(优选控制酶溶液浓度> 2000U/mL，酶溶液的量 能浸没载体即可)，在室温下反应5 10小时(期间可适当间歇轻微搅拌，例如可隔20 30分钟)，使乳糖酶的氨基与活化载体的醛基充分结合，制成固定化乳糖酶。根据本发明的优选具体实施方案，本发明的制备固定化乳糖酶的方法还包括用无 菌的中性(PH值为6. 5 7. 0)磷酸缓冲溶液清洗活化载体和/或固定化乳糖酶的步骤。 即，在使载体的氨基与戊二醛的醛基结合制成活化载体后，可用磷酸缓冲溶液清洗掉活化 载体上的残留戊二醛，然后再固定乳糖酶；在完成乳糖酶的固定化后，可用磷酸缓冲溶液清 洗掉固定化乳糖酶上的残留乳糖酶。利用本发明制备固定乳糖酶的方法，酶的活力回收率可达到> 80%，固定化酶的 活性> 100U/g(本发明中酶活性单位U，定义为在37°C，pH值为6. 8条件下，每克游离酶 或固定化酶每分钟从5%的乳糖溶液(由0. IM的磷酸缓冲溶液配制)中释放出1 μ mol葡 萄糖，定义为1个酶活单位)，最适反应pH值为6. 5 7. 0，在牛奶的自然pH值之间，非常 适合牛奶中乳糖的水解，最适反应温度为38 41°C，耐热性较游离乳糖酶增强，耐pH值较 游离乳糖酶PH值增大，反应动力学常数Km为250 300mmol/L，Vmax = 0. 1 1. Ommol/ g · min。另一方面，本发明还提供了所述固定化乳糖酶在生产低乳糖牛奶中的应用。由 于本发明的固定化乳糖酶具有稳定性强、活性高、反应PH值适宜等特点，其特别适用于水 解牛奶中的乳糖而生产低乳糖牛奶。另外，虽然本发明的固定化乳糖酶的最适反应温度为 38 41°C，其在低温下(例如10°C左右)也具有良好的生物活性，适合低乳糖牛奶的生产。另一方面，本发明还提供了一种利用固定化乳糖酶生产低乳糖牛奶的反应装置， 其中填充有本发明所述的固定化乳糖酶。本发明利用固定化乳糖酶生产低乳糖牛奶的反应 装置，具体可以是固定床反应器，例如填充柱等。反应装置中除填充本发明的固定化乳糖酶 夕卜，装置的其他具体结构可参照现有技术。另一方面，本发明还提供了一种利用本发明所述固定化乳糖酶生产低乳糖牛奶的 方法，该方法包括使牛奶与所述固定化乳糖酶接触以分解牛奶中乳糖的过程。根据本发明的具体实施方案，在利用本发明所述固定化乳糖酶生产低乳糖牛奶的方法中，优选控制牛奶与固定化乳糖酶的接触过程中酶的环境温度为8 41°C，牛奶与固 定化乳糖酶的接触停留时间为20 30分钟。在本发明的一更具体的实施方案中，所述生产低乳糖牛奶的方法为工业化连续生 产，其中是将所述固定化乳糖酶填充到一固定床反应器中，使牛奶以一定的流速通过反应 器中的固定化乳糖酶，其中，控制固定床反应器中的温度为10 40°C，并控制牛奶流速，使 其在固定床反应器中停留20 30分钟，实验表明，乳糖含量为4. 8%的牛奶流经该反应器 后，其中乳糖水解率大于70%。
另一方面，本发明还提供了所述固定化乳糖酶的微生物污染防治方法。本发明中， 由于乳糖酶在与活化载体结合后，酶的结构会发生一定的改变，且本发明的固定化酶中，酶 的活性基团是暴露在外面的而保持有较高的酶活性，在对该固定化乳糖酶进行微生物污染 防治时，应考虑尽可能减少对酶活性基团的损害以避免酶失活。根据本发明的具体实施方 案，本发明的固定化乳糖酶的微生物污染防治方法包括用Rozone S16、双季铵盐或新洁尔灭等杀菌剂冲洗固定化乳糖酶10 20min以 杀菌；根据本发明的优选具体方案，可用0. 05% 0. 的RozoneSie冲洗固定化乳糖酶 10 15分钟，用稀释500倍的双季铵盐冲洗固定化乳糖酶10 20分钟，或用200ppm的 新洁尔灭冲洗固定化乳糖酶10分钟，在上述杀菌剂浓度和作用时间下能达到良好的杀菌 效果，且对固定化酶的活性损失较小；经杀菌后的固定化乳糖酶置于中性的40% 60%的 甘油溶液(甘油的水溶液)保存，保存温度优选为3 5°C，以防止微生物的进一步生长繁 殖。本发明所提供的固定化乳糖酶的微生物污染防治方法，特别是指固定化乳糖酶在 生产应用中的微生物污染防治方法，主要是通过冷杀菌的方式并采用一定的保存方式来达 到微生物污染防治的方法。实际应用中，在装载固定化乳糖酶的固定床反应器每反应2 5个批次(每天固定化乳糖酶与牛奶连续反应8小时为一个批次)后用0. 05% 0. 的 Rozone S16冲洗10 15min，微生物杀灭率可达到95%以上，而固定化酶的活性下降小于 0.5% ；经冷杀菌后的固定化酶在不用时于生产时置于40% 60%的甘油溶液中保存能进 一步保护固定化乳糖酶的活性并防止微生物的进一步生长繁殖。在本发明的一具体实施方 案中，通过本发明所提供的固定化乳糖酶的微生物污染防治方法处理，应用本发明的固定 化乳糖酶在10°C下生产低乳糖牛奶，通过65个批次反应，酶活性仅下降15.8%，完全满足 工业化生产的要求。综上所述，本发明具有以下有益效果本发明选取含有氨基基团的载体，采用共价 结合的方法，将载体与交联剂的醛基结合，制成的活性载体对乳糖酶的结合程度提高，使得 固定化乳糖酶的活性稳定，能有效提高固定化乳糖酶的利用效率；适合本发明技术的乳糖 酶可为各种商业化乳糖酶；将本发明的固定化乳糖酶应用于制备低乳糖奶，易于满足工业 化生产的要求，能进行连续化、自动化生产；而且本发明还对所述固定化乳糖酶的使用过程 中微生物的污染防治采取了一定的措施，使得固定化乳糖酶生产低乳糖牛奶实现工业化成 为可能。
图1为显示本发明实施例2中利用本发明的固定化乳糖酶生产低乳糖牛奶时，牛奶中乳糖水解率与酶的使用周期之间的关系的曲线图。图2为显示本发明实施例3中利用本发明的固定化乳糖酶生产低乳糖牛奶时，牛 奶中乳糖水解率与酶的使用周期之间的关系的曲线图。
具体实施方式
以下通过具体实施例详细说明本发明的技术及特点，旨在帮助阅读者更好地理解 本发明的技术实质和所能产生的有益效果，不能理解为对本发明实施范围的限定。实施例1 乳糖酶固定化本实施例的制备固定化乳糖酶的方法包括称取500g带有活性氨基的树脂聚合物载体(商购，来源于上海恒然生物科技有限 公司，商品名称氨基载体(LZ-A)，载体形状为微球状颗粒，颗粒密度130毫升/100克抽干 载体，140毫升/100克风干载体；颗粒直径0. 5 1. 2毫米)，将该氨基载体加入3%的戊 二醛(0HC-CH2-CH2-CH2-CH0)溶液中，在室温(约25V )下交联6小时，戊二醛的一个醛基 (-CH0)将和载体的氨基(-NH2)结合，制成活化的载体；该过程中，由于一个氨基仅能和一 个醛基结合，而戊二醛的链较短，所以戊二醛的另一个醛基和载体上其他氨基结合的几率 较小，戊二醛能露出一个醛基，得到活化的载体，该载体具有游离的醛基，因同性相斥，这些 游离的醛基基团不能相互结合到一起，可以保持有活性；交联后用pH值为6. 8的灭菌的磷酸缓冲溶液清洗掉残留的戊二醛；将活化的载体上浸入商业化乳糖酶溶液中，乳糖酶溶液活性约2300U/ml，在室温 下放置6小时，让乳糖酶的氨基与活化载体的游离醛基充分结合(通过测定所得固定化乳 糖酶的活性即可评价酶与活化载体的结合效果)，即制成本实施例的固定化乳糖酶，将固定 化乳糖酶浙干，可用无菌的PH值为6. 8的磷酸缓冲溶液冲洗掉残余的乳糖酶(或酶液)，即 可用于低乳糖牛奶的生产。该固定化乳糖酶可贮存在中性的40% 60%的甘油溶液中待 用。对本实施例的固定化乳糖酶的特性进行分析，得到固定化时酶的活力回收率为 85 %，固定化酶的活性为112U/g，最适反应pH值为6. 5 7. 0，最适反应温度为38 41°C， 耐热性和耐PH值较游离酶增大，反应动力学常数Km为285. 87mmol/L, Vmax = 0. 23mmol/g
mirio实施例2 利用固定化乳糖酶在室温水解牛奶中乳糖操作稳定性试验将实施例1制备得到的固定化乳糖酶填充到固定床反应器(带有夹套的填充柱) 中，填充高度18cm，总共酶活为3700U，夹套通过循环水浴锅通入设定温度的水来保持系统 的温度(本实施例中设定温度为室温，24 26°C )，通过蠕动泵将乳糖含量为4. 8%的牛奶 从填充柱的底端流入、顶端留出，牛奶在管柱中停留约23min，这样，从填充柱顶端出来的牛 奶即为低乳糖牛奶。本实施例中，反应器每天运行7个小时，每天运行完毕后用灭菌蒸馏水对填充有 固定化乳糖酶的填充柱进行反复冲洗，然后置于PH值为6. 8、浓度为0. IM的磷酸缓冲溶液 中，于4°C贮存；使用前再用灭菌蒸馏水对填充柱冲洗干净；重复使用65天。实验过程中固定化乳糖酶的活性变化趋势可参考图1，其中显示了牛奶中乳糖水 解率与固定化酶的使用周期之间的关系变化。从图1可以看出，本发明的固定化乳糖酶在室温重复使用时活性下降较快，经过65个批次反应，牛奶中乳糖水解率从最初批次的 78. 6%下降到最终批次的39.7%，活性下降了 49.5%。分析其原因，主要是因为固定化乳 糖酶在使用的过程中受到微生物污染以及温度较高时酶的活性基团容易失活。实施例3 固定床反应器在10°C条件下的运行试验将实施例1制备得到的固定化乳糖酶填充到固定床反应器(带有夹套的填充柱) 中，填充高度14. 5cm，总共酶活为2650U，夹套通过循环水浴锅通入设定温度的水来保持系 统的温度(本实施例中设定温度为10°C )，通过蠕动泵将乳糖含量为4. 8%的牛奶从填充柱 的底端流入、顶端留出，牛奶在管柱中停留约22min，这样，从填充柱顶端出来的牛奶即为低 乳糖牛奶。本实施例中，每天运行7个小时，每天运行完毕后用灭菌蒸馏水对填充有固定化 乳糖酶的填充柱进行冲洗，然后置于PH值为6. 8、浓度为50 %的甘油溶液中，于4°C贮存； 每使用3天后用0. 的Rozone S16冲洗lOmin，蒸馏水冲洗干净后再置于50%的甘油溶 液中贮存，使用前再用灭菌蒸馏水对填充柱冲洗干净继续使用；重复使用65天。实验过程中固定化乳糖酶的活性变化趋势可参考图2，其中显示了牛奶中乳糖水 解率与固定化酶的使用周期之间的关系变化。从图2可以看出，本发明的固定化乳糖酶 在室温重复使用时活性下降较快，经过65个批次，反应牛奶中乳糖水解率从最初批次的 74.0%下降到最终批次的62.3%，活性仅下降了 15.8%。该实施例表明，本发明的固定化 乳糖 酶适宜在温度较低情况下用于生产低乳糖牛奶，本发明进一步通过配备有效的固定化 乳糖酶微生物防治手段，所以固定化乳糖酶在低温下完全可以实现工业化。
权利要求
一种固定化乳糖酶，该固定化乳糖酶是利用带有氨基基团的载体经戊二醛处理制成活化载体、然后再固定乳糖酶而成。
2.根据权利要求1所述的固定化乳糖酶，其中，所述载体为氨基化二氧化硅、含有氨 基的树脂聚合物或含有酰胼基的树脂聚合物，载体颗粒粒径0. 5 1. 2毫米，颗粒密度 100 150毫升/100克抽干载体，120 160毫升/100克风干载体。
3.根据权利要求1所述的固定化乳糖酶，该固定化乳糖酶的活性为100 200U/g， 最适反应PH值为6. 5 7.0，最适反应温度为38 41°C，反应动力学常数Km为250 300mmol/L, Vmax 为 0. 1 1. Ommol/g · min。
4.一种制备权利要求1 3任一项所述固定化乳糖酶的方法，该方法包括步骤取带有氨基基团的载体，经戊二醛处理使载体的氨基与戊二醛的醛基结合，制成活化 载体；在活化载体上固定乳糖酶，使活化载体的醛基与酶的氨基结合，得到固定化乳糖酶。
5.根据权利要求4所述的方法，该方法包括步骤取带有氨基基团的载体，加入 5%的戊二醛溶液处理5 10小时，使载体的氨基 与戊二醛的醛基结合，制成活化载体；将活化载体浸入乳糖酶溶液中，反应5 10小时，使乳糖酶的氨基与活化载体的醛基 充分结合，制成固定化乳糖酶。
6.权利要求1 3任一项所述的固定化乳糖酶在生产低乳糖牛奶中的应用。
7.一种利用固定化乳糖酶生产低乳糖牛奶的反应装置，其中填充有权利要求1 3任 一项所述的固定化乳糖酶。
8.一种利用权利要求1 3任一项所述固定化乳糖酶生产低乳糖牛奶的方法，该方法 包括使牛奶与所述固定化乳糖酶接触以分解牛奶中乳糖的过程。
9.根据权利要求8所述的方法，其中，控制牛奶与固定化乳糖酶的接触过程中酶的环 境温度为10 40°C，且牛奶与固定化乳糖酶的接触停留时间为20 30分钟。
10.权利要求1 3任一项所述固定化乳糖酶的微生物污染防治方法，该方法包括 用0.05% 0. 的Rozone S16、稀释500倍的双季铵盐或200ppm的新洁尔灭冲洗所述经使用过的固定化乳糖酶10 20min以杀菌；经杀菌后的固定化乳糖酶置于中性的40% 60%的甘油溶液中于3 5°C保存。
全文摘要
本发明是关于一种固定化乳糖酶及其制备方法与应用，所述的固定化乳糖酶是利用带有氨基基团的载体经戊二醛处理制成活化载体、然后再固定乳糖酶而制成。本发明同时提供了制备所述固定化乳糖酶的方法，所述固定化乳糖酶在生产低乳糖牛奶中的应用，包含所述固定化乳糖酶的生产低乳糖牛奶的反应装置，以及利用所述固定化乳糖酶生产低乳糖牛奶的方法；本发明另外还提供了所述固定化乳糖酶的微生物污染防治方法。
文档编号A61L101/32GK101845431SQ20091012974
公开日2010年9月29日 申请日期2009年3月26日 优先权日2009年3月26日
发明者云战友, 卜建斌, 王彩云 申请人:内蒙古伊利实业集团股份有限公司