专利名称：用于治疗慢性肾脏疾病之医药组合物的制作方法
技术领域：
本发明系关于治疗慢性肾脏病之技术领域。具体而言，本发明系提供一种治疗慢 性肾脏病之医药组合物，其包括脐带间质干细胞。本发明尚提供一种脐带间质干细胞之用 途，其系用以制备供治疗慢性肾脏病之医药。
背景技术：
近年来由于人口老化再加上国人饮食习惯上的改变，造成糖尿病以及心血管疾病 不断攀升，慢性肾脏病的盛行率也逐年增加。目前慢性肾脏病已经高居国人十大死因的第 八位，有渐渐成为台湾新国病的趋势。根据统计，台湾目前约有200多万民众罹患慢性肾 脏病，而进入到末期肾衰竭洗肾的病患则约有六万多名，并且每年以6%的成长率在成长。 虽然慢性肾脏病病患的增加是全球的趋势，但根据研究指出台湾慢性肾脏病盛行率高达 11. 9%，位居于世界第三。因此，如何预防慢性肾脏病的发生及治疗慢性肾脏病是现今医学 上十分重要的课题。干细胞疗法是目前治疗的新远景。人类脐带间质干细胞是一种生产后的废物，来 源取得容易，没有道德顾虑，处理方式简单，而且数量极多、繁殖快速的一种干细胞来源。本 实验室先前也研究出，移植人类脐带间质干细胞于大白鼠纹状体中，植入的细胞可以存活 在大白鼠脑中四个月，表示人类脐带间质干细胞，不会引起宿主的免疫及排斥反应。因此， 人类脐带间质干细胞为一株适合用于进行异体移植的良好干细胞来源。同时，我们利用四 氯化碳诱发大白鼠肝纤维化后，直接植入人类脐带间质干细胞到老鼠的肝脏内，发现不但 可以有效降低大白鼠血清中的GOT与GTP，而且可以有效帮助肝纤维化的修复。
发明内容
在一方面，本发明提供一种用于治疗慢性肾脏病之医药组合物，其包括脐带间质 干细胞(umbilical mesenchymal stem cells)。特定而言，所述医药组合物可降低血清中 尿素氮、降低血清中肌酸酐，增加肌酸酐廓清率，减少尿液中蛋白质含量及降低肾脏发炎。 在一具体实例中，所述医药组合物可植入至个体之肾脏位置。在另一具体实例中，所述脐带 间质干细胞系来自人类。在另一方面，本发明是针对一种脐带间质干细胞之用途，其系用以制备供治疗肾 脏病之医药。特定而言，所述医药可降低血清中尿素氮、降低血清中肌酸酐，增加肌酸酐廓 清率，减少尿液中蛋白质含量及降低肾脏发炎。在一具体实例中，所述医药可植入至个体之 肾脏位置。在另一具体实例中，所述脐带间质干细胞系来自人类。
前文的所述以及实施方式可藉由附图达到更好的说明效果。为了加强本发明的说 明，将适当的实施例的图式列举于此。要注意的是，本发明并不受限于列举于此的说明。图1至4显示肾间质纤维母细胞经TGF β -1处理后之各种分析结果。
图5及6显示将人类脐带间质干细胞植入后，大白鼠肾脏外观型态的改变。图7至11显示经Hematoxylin-Eosin组织染色后大白鼠肾脏的组织切片图。图12至17显示经Sirius red组织染色后大白鼠肾脏的组织切片图。图18至20显示大白鼠移植人类脐带间质干细胞后之各项分析。图21显示大白鼠移植人类脐带间质干细胞后之血液尿液生化检测分析。
具体实施例方式除非另外定义，本文中所用之所有技术及科学词汇具有熟习本文所属技艺者所通 常明了之相同意义。在本文中，冠词“一”系指一个或一个以上(亦即，至少一个)之该冠词之文法客 体。举例而言，“一组件”意谓一个组件或一个以上之组件。在一方面，本发明提供一种用于治疗慢性肾脏病之医药组合物，其包括脐带间质 干细胞(umbilical mesenchymal stem cells)。本文所使用的“脐带间质干细胞” 一词系指位于哺乳类动物脐带，较佳为人类脐带 间质组织中之干细胞，可为未经纯化的细胞培养物或纯化后的细胞。以下实例说明从个体 组织取得脐带间质干细胞之流程。脐带为生产后废弃物，来源取得容易，没有道德顾虑，处 理方式简单，数量极多、繁殖快速。且本实验室先前发现，移植人类脐带间质干细胞，不会引 起宿主产生免疫排斥反应。所以人类脐带间质干细胞为一种适合用来进行异体移植的良好 干细胞来源。本文所使用的“医药组合物”是指一种作为医药之混合物，其通常含有载体，诸如， 医药可接受之载体或赋形剂，其系技艺中所习知且适合投药至对象中，以作为治疗性、诊断 性或预防性之目的，其亦可包括细胞培养物或细胞。医药组合物之形式可为溶液、悬浮液、 锭剂、丸剂、胶囊或粉末，其给药方式较佳为注射。本文所使用的“医药可接受之载体”系指任何习知类型之无毒固体、半固体或液体 之填充剂、稀释剂、包胶囊材料、调配物辅助剂或赋形剂。医药可接受之载体系在所用之剂 量及浓度下，对接受者无毒性，且可与该调配物之其它成分兼容。医药可接受之载体一般均 可由公众轻易取得。此外，医药可接受之辅助物质，诸如，PH调节及缓冲剂、渗透压调节剂、 安定剂、湿润剂及类似物，亦皆可由公众取得。适当之载体包括，但不限于，水、葡萄糖、甘油、盐水、乙醇及其组合。 载体可含有额外之试剂，诸如，湿润及乳化剂、pH缓冲剂或是佐剂，其可增强该调 配物之有效性。局部性载体包括液体石油、棕榈酸异丙酯、聚乙二醇、乙醇(95%)、溶于水 中的聚氧乙烯单月桂酸酯(5% )或是溶于水中的十二烷基硫酸钠(5% )。可视需要加入其 它材料，诸如，抗氧化剂、保湿剂、黏度稳定剂及类似试剂。本发明之医药组合物可用于治疗个体之慢性肾脏病，个体较佳为哺乳动物，更佳 为人类。特定而言，所述医药组合物可降低血清中尿素氮、降低血清中肌酸酐，增加肌酸酐 廓清率，减少尿液中蛋白质含量及降低肾脏发炎。在一具体实例中，所述医药组合物可植入 至个体之肾脏位置，特别是肾脏结缔组织被膜下层的位置。在另一具体实例中，所述脐带间 质干细胞系来自人类。在另一方面，本发明提供一种脐带间质干细胞之用途，其系用以制备供治疗慢性肾脏病之医药。特定而言，所述医药可降低血清中尿素氮、降低血清中肌酸酐，增加肌酸酐 廓清率，减少尿液中蛋白质含量及降低肾脏发炎。在一具体实例中，所述医药可植入至个体 之肾脏位置，特别是肾脏结缔组织被膜下层的位置。在另一具体实例中，所述脐带间质干细 胞系来自人类。本发明之各个具体实例的细节说明如后。本发明之其它特征将会经由以下各个具 体实例中的详细说明及申请专利范围而清楚呈现。此一领域具通常知识者可了解本发明具 有各种态样，下述具体实例仅用以说明而非作为本发明之限制。实例 以下实例先以细胞培养方式，探讨人类脐带间质干细胞对经TGF β -1刺激的肾纤维母细胞株之影响。结果显示，经TGF β _1刺激后肾纤维母细 胞株，会在S期与G2/M期的比率增加，并且造成其增生，释出大量的胶原蛋白。然而，在人 类脐带间质干细胞与肾纤维母细胞株共同培养系统中，可以观察到人类脐带间质干细胞， 可以有效减少受到TGFi3 -1刺激后肾纤维母细胞株在S期与G2/M期的增加比率，并且减少 其增生，降低其释出的胶原蛋白。后续以大白鼠肾脏进行六分之五切除术，造成肾脏纤维化的情形，立即植入人类脐带间质干细胞，在四周及六周后观察肾脏修复的情形。结果显示， 植入人类脐带间质干细胞，从外观上及横切面组织图发现干细胞可以有效减缓肾脏纤维化 的现象。经由肾脏功能上的测定，也可以发现植入人类脐带间质干细胞可以有效降低血清 中尿素氮、血清中肌酸酐，增加肌酸酐廓清率，减少尿液中蛋白质含量。并且在组织切片上 也可以观察到肾丝球内肾间质细胞的增生、肾小管的萎缩、肾脏内胶原蛋白合成量增加的 情形，以及肾丝球内含有大量的单核球及巨噬细胞和活化的纤维母细胞，都在植入人类脐 带间质干细胞后有效获得改善。实例1 人类脐带间叶细胞之制备人类脐带以无菌操作方式收集并在4°C下储存于HBSS(BiOChrOmL201-10)不超过 24小时。脐带先泡在75%之乙醇中30秒以消毒。在无菌操作台中将消毒过之脐带置于无 钙及无镁离子之缓冲溶液(CMF，Gibco 14185-052)，以消毒过之器具将脐带纵切，并将其中 之血管及间叶组织(瓦顿氏凝胶)去除。将间叶组织切成0. 5立方公分之小块，以250Xg 离心5分钟。去除上清液，并以适量之无血清DMEM(Gibco 12100-046)清洗沉淀物二次，再 以250X g离心5分钟。间叶组织在37°C下以胶原酶处理14至18小时，清洗后，再以2. 5% 之胰蛋白酶于37°C及震荡下处理30分钟。加入FBS(HycloneSH30071. 03)至间叶组织以终 止胰蛋白反应。此时间叶组织已变成间叶细胞。间叶细胞以10% FBS-DMEM使其分散并计 算其数量后，便可直接用于培养及进行后续实验。实例2 肾间质纤维母细胞株的培养正常老鼠肾间质纤维母细胞株(Normalrat kidney fibroblast cells,NRK-49F ； 购自财团法人食品工业发展研究所)，将含有NRK-49F细胞的冷冻管快速以37°C水浴解冻， 吸起管中的培养液收集到含有IOml 10% CS(PAA B15-001)DMEM的50ml离心管中，离心 1200rpm, 5分钟，去除上清液后，再加入10% CS DMEM，清洗3次，之后再加入4ml的10% CS DMEM，充分混和后计数细胞，将细胞种于10公分的培养皿内(细胞密度为5X 105/dish)，待细胞长到八分满时，即可进行下列各项实验。_丨3:入碰砠丨_〒_与丨腕佳_胞燃_胃碰+，而观1_入 类脐带间质干细胞,，可以有效减φ等到TGF β -ι mmfs, nmmmmmm^.比率，并H.有 效降低胶原蛋白的释出。我们利用PI的荧光强度，来测量肾纤维母细胞受损程度。由于经过Triton X-100 处理过的细胞，会造成细胞膜的受损，其DNA均会被PI所标示，因而使G2/M phase即为DNA 复制期，其PI所表现出的荧光强度应为Gl期的两倍，可藉此判断细胞周期之变化 。将肾间质纤维母细胞经TGFii-I处理24小时后，利用流式细胞仪分析细胞受损的 情形。结果显示，控制组细胞平均荧光强度与经TGFii-I处理肾间质纤维母细胞，其平均荧 光强度无异，所以TGFii-I并不会造成肾间质纤维母细胞死亡(图1)。同样地，利用流式细 胞仪分析细胞周期的变化。经TGF β -1处理后的肾间质纤维母细胞，在S期与G2/M期的比 率增加，表示TGFii-I会促进肾间质纤维母细胞的增生，人类脐带间质干细胞与肾间质纤 维母细胞共同培养时，给予TGFii-I刺激后，人类脐带间质干细胞可以有效降低肾间质纤 维母细胞株在S期与G2/M期的比例(图2) (η = 3，ρ < 0. 05，*表与控制组有显著差异 ’# 表与加入TGFii-I的肾间质纤维母细胞实验组有显著差异)。另外，我们以MTT作为受质，测量存活细胞粒腺体中dehydrogenase的活性，以 侦测细胞存活率，进而分析细胞的增生情形。结果发现，经TGFii-I处理24小时后，会造 成肾间质纤维母细胞的增生，人类脐带间质干细胞与肾间质纤维母细胞共同培养并给予 TGFii-I刺激后，人类脐带间质干细胞可以有效降低肾间质纤维母细胞增生的情形，且与控 制组无显著差异(图3) (η = 9，ρ < 0. 05，*表与控制组有显著差异)。再者，我们以SircolTM Soluble Collagen Assay kit侦测肾间质纤维母细胞 所释出胶原蛋白的浓度。结果显示，处理TGFii-124小时后，其肾间质纤维母细胞培养液 内胶原蛋白的含量大幅上升，当人类脐带间质干细胞与肾间质纤维母细胞共同培养并给予 TGFii-I刺激后，人类脐带间质干细胞可以降低肾间质纤维母细胞释出的胶原蛋白浓度，且 与控制组无显著差异(图4) (η = 3，ρ < 0. 05，*表与控制组有显著差异)。实例4:棺入人类脐带丨旬Jli干细朐,，可以有效降低大白薩想结利云力Mc成肾 flff纤维化的现象雄性大白鼠，根据Floege等人的肾脏六分之五切除术，将大白鼠的右侧肾脏全 部摘除，左侧肾脏结扎三分之二条血管，造成大白鼠的肾纤维化(renal mass reduction, RMR)。将人类脐带间质干细胞植入后，观察其肾脏外观型态的改变，结果显示，肾脏有明显 修复纤维化的情形(图5)。同样地，在肾脏横切面组织型态上可以观察到植入干细胞后组 织发炎的情形主要在肾脏的外围没有扩散到内部(图6)。实例言人类脐带丨旬Jli干细朐,，可以有效减缓大白薩想结利云力Mc成肾 小球纤维化的现象将组织玻片置于以滤纸过滤的Hematoxyline中作细胞核染色30分钟，染色完毕 后将组织玻片放回二次水中清洗2次每次30秒。接着将组织玻片置入以滤纸过滤的Eosin Y solution 0.2%中呈色2分钟作细胞质染色，之后将组织玻片放到Aceric acid进行退 染5秒。经Hematoxylin-Eosin组织染色后正常大白鼠左侧肾脏的组织切片图(图7)。控制组四周后的组织染色图(图8)。控制组六周后，组织染色图(图9)。大白鼠肾脏移植干 细胞四周后，经Hematoxylin-Eosin组织染色照片(图10)。大白鼠肾脏移植干细胞六周 后，组织染色图(图11)。大白鼠的肾脏造成肾纤维化后四周与六周，我们分别计算控制组 与干细胞组肾丝球内细胞数目，结果显示，控制组大白鼠在结痂区近端肾丝球内细胞数与 正常组相比，无论是四周或六周均有显著增加，而干细胞组在四周及六周时细胞数与控制 组相比有显下降(S表结痂区、P表结痂近端区、D表结痂远程区Scale bar :1mm inA, 100 μ m in B、C、D)。
_丨6:_入碰砠丨_〒_，聊捕随姑_對丨1丨__翩丨皆 脏内纤维化的面积以及胶原蛋白的合成量将组织玻片置入以滤纸过滤的0. 1% Sirius Red染剂中呈色8分钟。取大白鼠左 肾组织切片经Sirius red组织染色后，以Sirius red染剂标定胶原蛋白的含量，并且将含 有大量胶原蛋白的红色区域定义为结痂区。在正常大白鼠的肾组织中，没有观察到结痂的 区域(图12A)。在控制组四周的大白鼠，可以在肾组织外侧看到结痂区(图12B)，另外，在 控制组六周的大白鼠，其结痂区域有明显增加，且往内扩大(图12C)。在移植干细胞组四 周，其结痂区域明显减少(图12D)。在移植干细胞组六周，其结痂区域变小且分布在组织的 边缘(图12E)。(比例尺为Imm)统计结果显示，正常组几乎无结痂区域的存在，而在控制 组四周及六周，其结痂区面积百分比增加且明显高于正常组。而经由移植人类脐带间质干 细胞组四周及六周与控制组四周及六周相比都有显著减少的情形。经Sirius red组织染 色后正常大白鼠左侧肾脏的组织切片图(图13)。肾脏经六分之五切除术造成肾脏纤维化 四周后的组织染色图(图14)。大白鼠肾脏经六分之五切除术造成肾脏纤维化六周后，组织 染色图(图15)。大白鼠肾脏移植人类脐带间质干细胞四周后，经Sirius red组织染色照 片(图16)。大白鼠肾脏移植人类脐带间质干细胞六周后，组织染色图(图17)。(S表结痂 区、P表结痂近端区、D表结痂远程区，A比例尺为1mm，B、C、D比例尺为100 μ m)实例言人类脐带丨、曰IJIi干细朐,，可大白薩想结利云力McΙ^ ^成lIfflff^l 亥3求、巨卩策细朐,IU及活仆,杰的乡千维母细朐,的含量，并目.可以发现棺入的人类脐带丨旬Jli干
细胞广泛存在于肾小球内ED-I表现于大白鼠的单核球及巨噬细胞，当其大量表现表示发炎反应正进行。 α -smooth muscle actin(a-SMA)存在于血管内的平滑肌细胞，同时也存在肌肉纤维母细 胞内，所以当其表现表示有纤维母细胞被活化。利用抗体Anti-Human Nuclei标定存在于 大白鼠肾脏内人类核所在的位置。结果发现，控制组四周后(图18B)及六周(图18C)，肾脏中单核球及巨噬细胞含 量与正常组(图18A)相比有增加的趋势；而植入人类脐带间质干细胞的组别，无论是四周 (图18D)或六周(图18E)，其肾脏中单核球及巨噬细胞含量，有相对减少的情形。α -SMA表 现表示纤维母细胞被活化。结果发现，控制组四周后(图19Β)及六周(图19C)，肾脏中活 化态的纤维母细胞与正常组(图19Α)相比有增加的趋势；而植入干细胞，无论是四周(图 19D)或六周(图19Ε)，其肾脏中活化态的纤维母细胞，有相对减少的情形。大白鼠肾脏移植 人类脐带间质干细胞六周后，以Anti-human specific nuclei antigen antibody作组织 免疫染色，结果发现植入的人类脐带间质干细胞广泛存在于肾丝球内(图20A)，并且可以 从放大的图中发现人类脐带间质干细胞存在于肾丝球的微血管网管上(图20D的箭头处)。但在控制组老鼠的组织切片上，都没有被Anti-human nuclei antigen antibody染到，肾 丝球内没有发现到任何细胞(图20B、20E)。同时，我们在大白鼠肾脏移植人类脐带间质干 细胞六周后，作组织的染色，但不加入Anti-human nuclei antigen antibody，也跟控制组 一样无法发现任何一颗细胞的存在(图20C、F)。(比例尺为100 μ m)实例8 移棺人类脐带间质干细胞，可以有效降低大白鼠因结扎肾动脉所造成肾 脏功能的损失雄性大白鼠以腹腔麻醉后，将人类脐带间质干细胞5X IO5个细胞，以Hamilton针 植入大白鼠 左肾脏结缔组织被膜下层(subcapsule)的位置。实验大白鼠于手术前、肾脏六分之五切除术后四周及六周与植入人类脐带间质干 细胞后四周及六周后，抽取尾静脉的血液约Iml以及利用代谢笼收集老鼠24小时的尿液， 待送交北荣检验部以Binesion检测血清中的尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)、血清中 肌酸酐(plasma creatinine,Per)、尿中肌酸酐(urine creatinine,Ucr)的浓度以及计算 肌酸酐的廓清率(creatinine clearance，Ccr)。尿液同时也以Bradford之蛋白质定量方 法测订尿中蛋白质的含量。结果显示，造成纤维化并植入人类脐带间质干细胞的大白鼠(RMR+HUMSCs)，其血 清中BUN的含量与未移植干细胞的控制组相比，有明显降低的情形(图21A)。同样地，在植 入人类脐带间质干细胞的大白鼠(RMR+HUMSCs)，其血清中Pcr的含量与未移植干细胞的控 制组大白鼠相比，有明显降低的情形(图21B)。植入人类脐带间质干细胞的大白鼠，其血清 中Ccr的含量与控制组大白鼠相比，有明显增加的情形(图21C)。肾脏进行六分之五切除 术造成肾纤维化的控制组大白鼠(RMR)，其尿蛋白的含量，与正常组大白鼠相比，有明显增 加的情形。而植入人类脐带间质干细胞的大白鼠，其尿液中蛋白质的含量与控制组大白鼠 相比，有明显降低的情形，且与正常组大白鼠没有差异(图21D)。综上，我们证实人类脐带间质干细胞具有治疗慢性肾脏病之功效与应用价值。
权利要求
一种用于治疗慢性肾脏病之医药组合物，其包括脐带间质干细胞(umbilical mesenchymal stem cells)。
2.根据权利要求1之医药组合物，其特征为可降低血清中尿素氮、降低血清中肌酸酐， 增加肌酸酐廓清率，减少尿液中蛋白质含量及降低肾脏发炎。
3.根据权利要求1或2之医药组合物，其特征为可植入至个体之肾脏位置。
4.根据权利要求1或2之医药组合物，其特征为脐带间质干细胞系来自人类。
5.根据权利要求4之医药组合物，其特征为脐带间质干细胞系来自人类。
6.一种脐带间质干细胞用于制备供治疗慢性肾脏病之医药之用途。
7.根据权利要求6之用途，其特征为该医药可降低血清中尿素氮、降低血清中肌酸酐， 增加肌酸酐廓清率，减少尿液中蛋白质含量及降低肾脏发炎。
8.根据权利要求6或7之用途，其特征为该医药可植入至个体之肾脏位置。
9.根据权利要求6或7之用途，其特征为脐带间质干细胞系来自人类。
10.根据权利要求8之用途，其特征为脐带间质干细胞系来自人类。
全文摘要
本发明提供一种用于治疗慢性肾脏疾病之医药组合物，其包括脐带间质干细胞。
文档编号A61K35/44GK101837014SQ200910129518
公开日2010年9月22日 申请日期2009年3月20日 优先权日2009年3月20日
发明者傅毓秀 申请人:傅毓秀;郑宏志