专利名称：一种组织工程化肝移植物的构建与植入方法
技术领域：
本发明涉及再生医学和组织工程领域，具体涉及一种可植入的组 织工程化肝移植物的构建及其植入方法。
背景技术：
肝脏是人体最大的内脏器官，它担负着重要而复杂的生理功能，
对维持生命和内环境的稳定起重要作用。全世界大约有3亿多肝病患 者，其中三分之一在我国，我国是世界上终末期肝病发病率最高的地 区之一。对于急、慢性肝功能衰竭及各种遗传性代谢紊乱肝病的治疗， 目前肝移植是有效的治疗手段。然而，由于供体器官的严重匮乏使得 该项技术的广泛应用受到限制。现有体外人工肝辅助装置可以作为移 植前的过渡手段，但难以提供连续的治疗，且只能完成过滤、净化等 单一功能，无法代替肝脏的全部生化功能。肝细胞移植技术虽然在治 疗急、慢性肝衰竭及遗传代谢类疾病方面显示出重要潜能，但是在通 过门脉系统进行细胞输入时， 一次性过多输入会导致门脉高压、细胞 栓塞等严重问题；而且，迄今为止植入细胞的肝替代效率也非常低， 长期治疗效果非常有限。
随着组织工程学的不断发展，釆用组织工程技术构建的可植入工 程化肝移植物以其独有的优势逐渐成为治疗终末期肝病的新的潜在 方法。肝组织工程是通过将肝脏细胞接种在生物可降解的天然的或化 学合成聚合物支架材料上，在一定的微环境下，经过诱导培养，形成 一定量的肝实质细胞和组织，再移植到患者体内发挥代偿或替代肝功 能的作用。
由于目前所创建的工程化肝移植物受到植入初期缺血和之后血 管化不足的限制，所形成的工程化肝组织体积非常有限，难以提供有
3效功能支持。在中国专利(专利号200510096042.0)所提供的方法中，
采用快速成型技术制造出具有血管网系统和肝细胞孔洞的管状仿生 支架，可同时接种肝细胞和血管内皮细胞。该方法虽然能够创建具有 仿生结构工程化肝移植物，但是该移植物在植入体内后难以克服初期 缺血的影响。在中国专利(专利号200610113181.4)所提供的方法中， 釆用骨髓基质干细胞分化来的肝细胞和血管内皮细胞作为种子细胞 创建工程化肝构建物，通过将种子细胞与含有诱导因子的蛋白胶复合 后填充到一管状支架的内壁和外侧。该方法虽然复合了诱导因子，但 是由于诱导因子只简单与生物蛋白胶复合，在植入体内后会快速失 活，不能诱导出足够量的肝实质，难以提供有效的功能支撑。
为克服上述缺点，本发明提供一种可有效促进肝脏细胞植入、成 活、增殖的工程化肝移植物构建与植入方法，该移植物可在体内诱导 厚的、血管化的工程化肝组织，为各种肝病提供有效的功能支持，并 能够促进肝组织的再生和修复。
发明内容
本发明的目的是提供一种组织工程化肝移植物及其构建方法。 本发明工程化肝移植物的构建方法，包括如下步骤，如图l所示
1) 将水凝胶材料作为生物活性支架，与肝脏细胞复合创建工程 化的肝脏细胞/支架复合物；
2) 将肝脏细胞/支架复合物打散成直径为0.5-4mm的肝移植物单元。
其中，水凝胶材料是选自包括液态I、 II、 IV型胶原、纤维蛋白 胶、壳聚糖水凝胶及其它天然和人工合成的水凝胶中的一种或多种。
肝细胞为原代分离或各种干细胞分化来的肝细胞或经基因修饰 的肝细胞等肝实质细胞，或内皮细胞、星形细胞等肝内非实质细胞， 所述干细胞是各种成体干细胞、胚胎干细胞、诱导干细胞和采用治疗 性克隆技术创建的干细胞等。肝脏细胞的加入量是本领域的公知技术， 一般加入量为1()5/ml以上，优选106~ 108/ml。
步骤l)所述创建如下进行根据本领域的公知技术将上述水凝 胶材料先处理为溶液，再与肝脏细胞混合，得到肝脏细胞/支架复合 物。整个操作在冰上进行。
步骤2 )所述打散是指肝脏细胞/支架复合物变成凝胶后，机械破 碎成直径为0.5-4mm的肝移植物单元，但优选如下方法进行将步骤 1)的肝脏细胞/支架复合物吸入注射器中，置于37。C、 5% C02培养 箱孵育10-15min，待复合物形成凝胶后推出，并将其切成长度为 0.5-2mm的小段，形成直径为0.5-4mm、高度为0.5-2mm的圆柱形的 肝移植物单元。
为使构建物尽快诱导出足量肝实质细胞和新生血管，上述生物活 性支架还包括加入多种诱导因子和/或生物活性物质，其构建方法包 括将含有多种诱导因子和/或生物活性物质的诱导因子缓释微球与 水凝胶材料复合，构建生物活性支架。
所述诱导因子缓释微球可外购，或根据本领域公知技术将诱导因 子和/或生物活性物质用琼脂糖或明胶荷载、或用壳聚糖或聚乳酸纳 米颗粒包被处理，制成诱导因子缓释微球。由于诱导因子缓释微球所 用的原料不同，制得的诱导因子缓释微球的直径差别较大，有5~ 2000nm的纳米级颗粒，也有0.1 ~2mm的颗粒，因此本发明所用的 诱导因子缓释微球的粒径范围为5nm ~ 2mm。诱导因子缓释微球的加 入量可根据需要决定， 一般是0.1-100ug/ml。
其中所述诱导因子是促血管生成细胞因子，如血管内皮生长因子 ((Vascular endothelial growth factor, VEGF)和表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)，促肝细胞生长细胞因子，如肝细胞生长因子 (hepatocyte growth factor, HGF),碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF )等相关细胞因子中的一种或多种； 所述生物活性物质是地塞米松、胰岛素和转铁蛋白中的一种或多种；具体步骤如图2所示，本发明提供的肝移植物单元的应用方法 为用注射或充填的方式将肝移植物单元植入肝外位点或多位点植入 肝实质中，或将肝移植物形成片层单元贴敷于肝包膜下。
本发明釆用水凝胶材料作为创建工程化肝移植物的支架，有利于 肝脏细胞同支架高密度混合，形成组织样细胞密度的复合物，促进肝 细胞间的有效接触；同时所形成的复合物可以打散成小块肝单元，有 利于代谢产物的扩散和营养物质的传输，克服植入初期缺血的影响，
和促进移植物的血管化，从而提高肝细胞的植入、成活和组织形成；
所形成的工程化肝单元可通过注射的方式植入体内，有效减小对植入 位点血管和组织的损伤。而且，本发明所釆用的构建与植入方式可在 病变肝脏原位多点播撒新生岛样工程化肝组织，为在体内创建工程化 肝组织治疗各种肝病提供一种新的方法。
图l为工程化肝移植物的构建流程图； 图2为使用诱导因子的工程化肝移植物的构建流程具体实施例方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。 实施例l工程化肝移植物单元的构建
将生长因子溶解在5%的琼脂糖中，生长因子HGF和VEGF的 终浓度为分别为5ug/ml，琼脂糖凝聚后釆用机械破碎的方式将其打 散成小微球，即可获得琼脂糖缓释微球。
然后在冰上操作，将凝胶缓释微球与水凝胶材料复合构建生物活 性支架；将液态I型胶原(来自SD大鼠尾腱)与2XDMEM (Sigma, US)等比例混合，用0.1mol/LNaOH溶液调整pH为7.4,得混合物，加 入凝胶缓释微球，构建生物活性支架。
取原代分离的肝脏细胞(SD大鼠，200-250g)与生物活性支架混 合(在冰上进行)，创建肝脏细胞/支架复合物。将肝脏细胞/支架复合
6物吸入lml—次性注射器中，置于37。C、 5。/。C02培养箱孵育15min，待 复合物形成凝胶后推出，并将其剪成长度为lmm的小段，即可形成直 径为0.5mm、高度为lmm的圆柱形的肝移植物单元。 实施例2
将制备的肝单元皮下植入，构建工程化肝组织。实验如下进行 将液态I型胶原(来自SD大鼠尾腱)、2xDMEM培养基等比例混 合，用0.1mol/LNaOH将混合物的pH值调为7.2-7.4。新鲜分离的肝细 胞与上述混合物复合构建肝细胞/胶原凝胶复合物，并置于37。C、 5% CO2培养箱孵育10min。待复合物形成凝胶后，将其打散成小块肝细 胞单元。大鼠腋下造成皮下囊后，将肝细胞单元植入囊中。
体外实验结果表明肝细胞与液态I型胶原复合后，细胞均匀 分布在整个复合物中，可呈三维立体生长；在整个体外培养过程中， 肝细胞始终保持圆形的形态；肝细胞在培养初期活性稍有下降，但直 至第7天时仍然保持活性的87%，之后随培养时间延长而活性逐渐降 低，经过2周培养，肝细胞仍具有白蛋白的合成功能。体内实验观察 到，肝细胞单元皮下植入l周后，肝细胞/胶原复合物形成工程化灶性 肝组织，免疫组化染色证实这种工程化的肝组织具有白蛋白的合成功 能。
实施例3
以骨髓基质干细胞为种子细胞在肝脏原位构建工程化肝组织 取常规方法培养至第四代的SD大鼠骨髓基质干细胞与液态I型胶 原、浓缩的DMEM(2x)培养液和巿售的肝细胞培养基复合，加入生 长因子HGF和VEGF，终浓度分别为5ug/ml。将该复合物吸入l.ml注 射器中并将其置于37i:、 5。/。C02孵箱中15分钟，待复合物形成半固 体凝胶后推出，并将其切成长度为lmm的小段，即可形成直径为 0.5mm、高度为lmm的圆柱形肝移植物单元。
将构建的肝移植物单元通过注射的方式植入同基因大鼠肝脏内。一周后移植区域有类肝样组织形成。组织学和免疫组织化学检测可 见；l)植入区域形成岛样肝细胞团簇，细胞白蛋白染色呈阳性；2)出
现胆管样结构,且胆管细胞标志物CK19染色阳性；3)可见新生血管形成。
权利要求
1、一种组织工程化肝移植物的构建方法，包括如下步骤1)将水凝胶材料作为生物活性支架，与肝脏细胞复合创建工程化的肝脏细胞/支架复合物；2)将肝脏细胞/支架复合物打散成直径为0.5～4mm的肝移植物单元。
2、 如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述生物活性 支架还包括含有诱导因子和/或生物活性物质的诱导因子缓释微球， 将诱导因子缓释微球与水凝胶材料复合构建生物活性支架。
3、 如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述水凝胶材 料是包括液态I、 n、 IV型胶原、纤维蛋白胶、壳聚糖水凝胶的天然 或人工合成水凝胶中的一种或多种。
4、 如权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述诱导因子 是促血管生成细胞因子，促肝细胞生长细胞因子以及成纤维生长因子 中的一种或多种；所述生物活性物质是地塞米松、胰岛素和转铁蛋白 中的一种或多种。
5、 如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述肝脏细胞 是包括原代分离，干细胞分化来的肝细胞、经基因修饰的肝实质细胞， 以及包括内皮细胞、星形细胞的肝内非实质细胞。
6、 如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述肝移植物 单元是直径为0.5-4mm、高度为0.5-2mm的圆柱形的肝移植物单元。
7、 一种由权利要求l-8任一所述构建方法构建的肝移植物。
8、 一种如权利要求9所述的肝移植物的使用方法，其特征在于， 釆用注射的或充填的方式将肝移植物单元植入肝外位点或多位点植 入肝实质中，或将肝移植物形成片层单元贴敷于肝包膜下。
全文摘要
本发明涉及再生医学和组织工程领域。本发明提供了一种可植入的工程化肝移植物及其构建方法。该方法采用水凝胶材料作为生物活性支架，复合含有促血管生成细胞因子、促肝细胞诱导因子(和生物活性物质)的缓释微球，复合肝脏细胞，构建工程化的肝脏细胞/支架复合物，促进肝脏细胞的增殖和工程化肝移植物的血管化，待肝脏细胞/支架复合物转变为凝胶后，将其打散成肝移植物单元。通过将肝移植物单元植入肝外位点或多位点植入肝实质中，克服现有工程化肝组织植入初期的缺血问题，有效地解决工程化肝组织体内再生所面临的问题，为采用组织工程方法体内创建工程化肝组织治疗各种肝病提供一种新的方法。
文档编号A61L27/52GK101530632SQ20091012928
公开日2009年9月16日 申请日期2009年4月9日 优先权日2009年1月20日
发明者刘巨超, 张博峰, 徐迎新, 力 李, 荣 李, 赵云山 申请人:中国人民解放军总医院