体外循环灌流构建组织工程肝的生物反应器的制造方法
【技术领域】
[0001]本发明属于组织工程和生物制造领域，涉及(但不局限于)肝脏组织三维培养构建组织工程肝脏的生物反应器。可以实现组织工程肝脏体外培养过程中细胞种植、组织培养阶段的灌流和体外循环，模拟生理条件下的血流循环，主要参数可以调节。
【背景技术】
[0002]肝脏是人体重要的解毒和消化器官，肝炎、肝硬化、重症肝衰竭等终末期肝病已严重影响了人们的生存质量，成为全世界死亡率最高的疾病之一。目前，肝移植是公认的唯一有效的治疗方法。仅中国，约有30万终末期肝病患者等待肝移植手术，而能够接受肝移植手术治疗的患者仅占45%。全球范围内供肝短缺形势严峻，绝大部分患者因无法等到供肝而死亡。体外构建组织工程肝脏成为解决供肝缺乏的途径之一。
[0003]组织工程学是合运用生物学和工程学的基本原理、基本理论、基本技术和方法，研宄如何在体外条件下构建有生物活性的组织器官，用以替代病损的组织器官的学科。组织工程肝脏是该领域的研宄热点之一。构建理想的组织工程化人工肝脏，需要研宄三个关键性的问题:理想的种子细胞来源、支架材料和能够为细胞支架复合物提供接近生理环境的生物反应器。
[0004]肝组织生物反应器的发展过程中，先后出现了平板型生物反应器、旋转瓶型生物反应器、中空纤维型生物反应器、灌流床支架型生物反应器(Basak E.Uygun, GavriellePrice,Nima SaeidijMaria-Louisa Izamisj Tim Berendsenj Martin YarmushjKorkutUygun.Decellularizat1n and Recellularizat1n of Whole Livers.J.Vis.Exp.2011, (48):e2394)、肝细胞包裹/悬浮型生物反应器。由于上述生物反应器都没有解决供氧和细胞在三维支架内生长的问题，使它们的使用受到限制。目前这些生物反应器可以短时间内部分替代衰竭肝脏，但它不能完全替代肝脏功能，也不能培养出真正的组织工程肝脏(Yu CB, Pan XP, Li LJ.2009.Progress in b1reactors of b1artificiallivers.Hepatobiliary Pancreat Dis Int 8:134-140.)。
[0005]因此，在体外构建组织工程人工肝生物反应器时，应考虑到:灌流效果足够保证细胞在三维支架中的种植深度，提供模拟体内条件的持续灌流，并给细胞提供模拟体内的生物、力学环境和足够的营养交换。
[0006]本发明提供了模拟生理条件下的组织培养环境，并给细胞实施可调节的静水压力。
【发明内容】
[0007]本发明的目的是设计可以三维培养肝脏组织构建组织工程肝脏的生物反应器，用于干细胞分化的体外研宄、组织工程肝脏的体外构建，以实现生物人工肝替代人体供肝的理想状态。
[0008]该生物反应器包括:体外循环灌流系统，含封闭的体外循环管道系统、组织灌流发生器、灌流液混悬更新装置；管道内压力负反馈调节系统，含压力负反馈调节系统包括管道内压力监测系统、电脑控制模块、受电脑控制调节的灌流装置(蠕动泵)；肝脏组织培养体系，含肝组织培养的无菌培养室、供培养肝组织的三维支架。
[0009]培养液储槽中的培养液通过封闭的管道系统，经蠕动泵进入肝脏培养三维支架，为支架内细胞提供营养物质，三维支架机器内部的细胞在无菌培养室中培养。培养液在支架内循环后，经支架流出口进入封闭的管道系统，在蠕动泵的控制下进入培养液储槽。封闭的管道系统内有压力感受器可实时监测管道内压力，并将压力信息传入中控电脑，电脑根据压力和预先设定的压力需求，调节两个蠕动泵的速度，从而维持整个管道内的静水压。
[0010]培养液储槽另有无菌进液口和气体过滤装置，以满足培养液加氧、加二氧化碳、管道系统消除气泡和更换培养液的需求。
[0011]上述方案中，整个管道系统为密闭系统，流入管和流出管均采用无菌的生物相容性材料。肝组织培养室也采用无菌生物相容性材料。
[0012]本发明另一技术特征是，管道内有时是压力传感器，蠕动泵的泵速流量均实时通过电脑中控系统监控调节。
[0013]本发明与已存在的肝脏生物反应器相比具有以下优点:
[0014]第一，通过培养液在整个支架内完全循环，可以将细胞悬液带到整个支架的各个角落，从而提高支架上细胞的种植密度，模拟真实肝脏内细胞的分布。
[0015]第二，通过培养液在整个支架内完全循环，可为支架内所有细胞提供有效的营养供给、气体交换，提供支架内部细胞的存活率。
[0016]第三，通过蠕动泵实现脉动刺激，模拟体内血流。
[0017]第四，通过管道内压力监测器、电脑中控系统、蠕动泵负反馈调节，有效实现模拟生理条件下肝脏内静水压。以及静水压的调节，利于体外肝再生的机制研宄。
[0018]第五，电脑中控系统可通过软件调节，适应不同的研宄需求和组织构建需求。
【附图说明】
[0019]图1为体外循环灌流构建组织工程肝的生物反应器的原理结构简图。
【具体实施方式】
[0020]本发明从支架材料细胞化和组织培养两个阶段，为体外构建组织工程肝脏提供技术方案。
[0021]支架材料细胞化的阶段，即细胞种植阶段。将培养液储槽和组织培养室置于二氧化碳培养箱中，培养液储槽中的细胞悬液通过持续灌流，或两个管道交替流向输入，使细胞得以分布到支架的各个部位，提高细胞在支架材料上的附着率。细胞灌注时间及浓度可视需要而定。静置培养一段时间后，可进行组织灌流培养。
[0022]在组织培养阶段，如附图所示，培养液储槽和组织培养室亦置于二氧化碳培养箱中。细胞培养液储槽中的培养液通过封闭的管道系统，经蠕动泵进入肝脏培养三维支架，为支架内细胞提供营养物质，三维支架机器内部的细胞在无菌培养室中培养。培养液在支架内循环后，经支架流出口进入封闭的管道系统，在蠕动泵的控制下进入培养液储槽。封闭的管道系统内有压力感受器可实时监测管道内压力，并将压力信息传入中控电脑，电脑根据压力和预先设定的压力需求，调节两个蠕动泵的速度，从而维持整个管道内的静水压。
[0023]实施例1:干细胞在全肝脱细胞支架培养
[0024]无菌条件下将，大鼠全肝脱细胞后，得到具有肝脏网络结构及脉管系统的生物支架。支架入口为肝门脉，出口为肝静脉，将两个口分别连接于生物反应器的入口管和出口管。将生物反应器的入口管和出口管的另一端与培养液储槽连接，培养液储槽中再无菌条件下预置106/ml干细胞悬液。将培养液储槽、培养液混悬器和肝组织培养室置于二氧化碳孵箱内，通过蠕动泵将细胞悬液缓慢泵入全肝脱细胞支架内，灌注I个循环。静置一天后，将培养液储槽内液体更换为组织培养液，进行持续灌流培养。一周后，观察培养效果。
[0025]实施例2:培养液对肝脏生长的影响
[0026]无菌条件下切除大鼠肝，将表面及管道内红细胞冲洗干净、测量肝脏体积大小后，置于肝组织培养室内，将肝门静脉连接生物反应器入口管，肝静脉连接出口管，将生物反应器的入口管和出口管的另一端与培养液储槽连接。将培养液储槽、培养液混悬器和肝组织培养室置于二氧化碳孵箱内，通过蠕动泵将肝脏培养液持续灌流入大鼠肝内，维持肝门静脉入口处压力为1cm水柱(约为生理状态压力)，养两周后测量肝脏大小，观察培养液对肝脏生长的影响。
[0027]实施例3:不同静水压力对肝再生的影响
[0028]无菌条件下切除大鼠肝，将表面及管道内红细胞冲洗干净、测量肝脏体积大小后，置于肝组织培养室内，将肝门静脉连接生物反应器入口管，肝静脉连接出口管，将生物反应器的入口管和出口管的另一端与培养液储槽连接。将培养液储槽、培养液混悬器和肝组织培养室置于二氧化碳孵箱内，通过蠕动泵将肝脏培养液持续灌流入大鼠肝内，维持肝门静脉入口处压力为15cm水柱培养(高于生理状态)，培养两周后测量肝脏大小，观察高静水压对肝脏生长的影响。
[0029]持续灌流循环是调控细胞生长和功能的关键因素。本发明共培养装置的特点是可为三维支架内培养的细胞提供持续的模拟生理条件的体外循环，实现对细胞生长提供营养、气体交换的作用，为细胞共培养提供一种可调节的生长环境，为探索组织培养技术提供一种方法。
[0030]以上所述仅为本发明优选实例，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1.一种涉及(但不限于)肝脏组织三维培养的生物反应器，其特征在于培养肝组织的同时模拟体内血流情况，使肝内形成所需的、可调节静水压。
2.该生物反应器包括:封闭的体外循环管道系统(3)、组织灌流发生器(4)、培养液混悬更新装置(I);压力负反馈调节系统包括管道内压力监测系统(7)、电脑控制模块(8)、受电脑控制调节的灌流装置(蠕动泵(5) (6));肝组织培养的无菌培养室(9)、供培养肝组织的三维支架(10)。
3.如权利要求1所述，培养肝组织脉管系统内压力由灌流系统提供，管道内压力监测传感器(7)将管道内压力信号实时传入中控系统(8)，中控系统依此数据自动调节蠕动泵，从而控制灌流速度和灌流量，从而模拟体内血管搏动及动脉压。
4.如权利要求2所述，灌流液混悬更新装置包括混悬摇床、三通管进行液体更换和新液体添加、0.22 μπι滤膜保证组织培养液体的酸碱平衡和培养液供氧问题。
5.如权利要求2所述，肝组织培养的无菌培养室由无菌的生物相容性材料制做。
6.如权利要求2所述，细胞生长在供培养肝组织的三维支架内部，该三维支架具有模拟肝局部解剖结构的脉管系统，有可与灌流系统连接的进出管道。该三维支架可以是硬材料也可是弹性材料。
7.如权利要求4、5、6所述装置需在二氧化碳细胞培养箱内应用。
【专利摘要】本发明涉及一种组织三维培养的装置和方法。该生物反应器包括体外灌流循环系统、压力负反馈调节系统和灌流量控制模块、肝组织培养模块。体外灌流循环系统包括封闭的管道系统、组织灌注发生器及灌流液混悬更新装置。压力负反馈调节系统包括管道内压力监测系统、电脑控制模块和系统受电脑控制调节的灌流装置。肝组织培养模块包括无菌培养室和组织培养三维支架的构建。本发明可模拟体内环境，为体外培养组织工程器官提供了一种装置，为三维条件下干细胞分化和细胞生长的研究提供一种工具。
【IPC分类】C12M1-36, C12M1-04, C12M1-34, C12M3-00, C12M1-12
【公开号】CN104611225
【申请号】CN201510084465
【发明人】张蕾, 张涛
【申请人】昆明市第一人民医院
【公开日】2015年5月13日
【申请日】2015年2月16日