大规模培养动物细胞的系统的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种动物细胞培养技术，尤其涉及一种大规模培养动物细胞的系统。
【背景技术】
[0002]根据WHO统计:全球有6.5亿感染各种肝病患者，最新统计每年约有200万人死于各种肝病。我国急慢性肝功能衰竭十分常见，据统计国内每年此类患者达30万。病死率高达80%。目前治疗肝衰竭方法主要有:(I)内科治疗。(2)肝脏移植治疗。(3)人工肝治疗。而内科治疗效果不佳，外科治疗中肝脏移植手术是目前公认的最为有效的治疗方法，但由于供体缺乏、技术难度高等原因，极大地限制了肝移植手术的广泛开展，绝大部分病人在等待肝移植的过程中死亡。生物人工肝具有肝细胞解毒、转化、合成等功能，可代替肝脏大部分功能。生物反应器是整个生物人工肝的核心部分，其性能将直接关系到生物人工肝的支持效果。理想的生物人工肝生物反应器应达到如下标准:(I)细胞密度达IXlO8 1(]个细胞/ml水平；(2)反应装置能根据需要任意增容，细胞培养量可达数升；(3)实现有效的营养物质、氧气及代谢产物双向物质传输，尽可能模拟肝细胞在体内的微环境；(4)可进行自动化在线细胞状态、培养液PH值、氧浓度等方面检测和调节功能，以便于医护人员的监督和操作；(5)肝细胞代谢功能至少达单层培养的水平，并至少保持2周以上；(6)便于冻存、运输和装配。
[0003]目前生物人工肝发展的核心问题是设计最佳的新型生物反应器，实现体外肝细胞的大规模培养及其培养过程中肝细胞功能与活率的有效维持，同时能够满足临床应用的需要。目前国内外在生物反应器的结构上，至今为止可以分为以下4大类:
[0004]1、单层培养/平板式的生物反应器:该类反应器是将肝细胞直接种植于平板上，使得表面积与体积之比下降，反应器细胞为单层培养，不能长期有效存活并保持功能与活性，且不易放大，无法达到临床要求。
[0005]2、中空纤维型生物反应器:目前该反应器的研究上也取得了如下一些进展:1)整合独立的管道氧供系统，如混合型LSS-MELS系统；2)寻找新的膜材料或对现有的膜材料进行改进；3)在进行肝细胞生物治疗的基础上整合增加活性炭等物理解毒治疗，如LIVERaid系统；4)运用新的培养模式，如LSS系统通过共培养方式提高肝细胞的活性与功能。但该反应器仍存在以下问题:(I)容积有限，细胞装载量小，培养液与肝细胞交换面积有限，不利于体外规模化扩增；(2)半透膜的侧孔易被细胞团堵塞，影响交换效率，亦不利于肝细胞的功能与活力的长期有效维持。
[0006]3、灌注床/支架生物反应器:该反应器是通过搅拌来使细胞及支架材料达到悬浮状态，这种生物反应器机械搅拌会产生一定剪切力，容易对细胞造成较大程度上的损伤，因而限制了其进一步的运用。
[0007]4、包被悬浮生物反应器:该生物反应器是将肝细胞用一种半透膜材料包裹，制成多孔微囊，然后进行灌注培养.其缺点是由于半透膜的存在以及肝细胞间的相互聚集，导致囊内外物质能量的交换受限。肝细胞为贴壁依赖性细胞，如失去对支架材料的贴附，可促发细胞发生凋亡。
[0008]纵观以上现有技术，其一般存在反应器物质交换效率低下以及管路结构繁杂等技术问题。
【发明内容】
[0009]本发明的目的是提供一种增加反应器物质交换效率的、管路结构简洁的大规模培养动物细胞的系统，
[0010]为达到以上技术目的，本发明采用的技术方案如下:
[0011]—种大规模培养动物细胞的系统，其包括为动物细胞提供生长场所的细胞工厂生物反应器、为所述细胞工厂生物反应器提供氧气的供氧器、储存培养基的储液瓶、用于驱动所述培养基在该系统内流动的蠕动栗，以及将所述细胞工厂生物反应器、供氧器、储液瓶、蠕动栗导通连接的循环管路；所述循环管路包括:第一分管路和第二分管路，其分别设有两个夹管阀和开设在该两个夹管阀之间的第一接口和第二接口 ；所述两个分管路的左端相互连接形成第三接口 ；所述两个分管路的右端相互连接形成第四接口 ；第三分管路，其左端和右端分别与所述第一接口和第二接口连接，并且所述第三分管路将所述供氧器、储液瓶及蠕动栗串接起来；连接所述第一接口和细胞工厂生物反应器的第四分管路；以及连接所述第二接口和细胞工厂生物反应器的第五分管路。
[0012]对应地，所述细胞工厂生物反应器设有分别与所述第四分管路和第五分管路连接的第一端口和第二端口。
[0013]优选地，所述细胞工厂生物反应器为微载体生物反应器。
[0014]进一步地，该系统还包括在线检测器；所述循环管路还包括以三通阀连接在所述第三分管路上的并且与所述在线监测器串接的第六分管路。
[0015]更进一步地，该系统还包括借助所述第三分管路而串接在所述蠕动栗与储液瓶之间的加热盘。
[0016]优选地，所述供氧器为膜式氧合器。
[0017]为实现自动化，该系统还包括调节该系统中影响细胞培养条件的各组成部分的控制参数的总控制器。
[0018]与现有技术相比较，本发明具有如下优势:
[0019](I)本发明的大规模培养动物细胞的系统，由蠕动栗提供循环动力，通过合理设计循环管路以及利用两对夹管阀交替开放和关闭来控制液体(培养基)进入反应器罐体的方向，培养基的周期性双向灌注可以防止反应器罐体细胞代谢产物在一处堆积，以及避免发生灌注入口细胞供氧良好而罐体出口细胞缺氧和营养物质的情况，有效消灭培养死腔形成；
[0020](2)本发明的大规模培养动物细胞的系统，采用在外科手术中广泛使用的膜式氧合器来作为供氧器，有效改善了动物细胞培养过程中的气体交换情况，有助于提高动物细胞培养的质量；
[0021](3)本发明的大规模培养动物细胞的系统，设有在线检测器，用于检测培养基的PH和溶解氧含量，可以实时了解生物反应器内的微环境，可以及时根据监测的数值对反应器参数作出调节而改善反应器罐体内微环境，也可以避免因取样检测而发生污染；
[0022](4)本发明的大规模培养动物细胞的系统，对动物细胞采用微载体培养技术，把悬浮培养和贴壁培养融合在一起，兼具两者的优点。
【附图说明】
[0023]图1为本发明大规模培养动物细胞的系统的结构示意图，示出当第一夹管阀和第四夹管阀打开、第二夹管阀和第三夹管阀关闭时该系统内培养基的流动方向。
[0024]图2为本发明大规模培养动物细胞的系统结构示意图，示出当第一夹管阀和第四夹管阀关闭、第二夹管阀和第三夹管阀打开时该系统内培养基的流动方向。
[0025]图3为采用本发明大规模培养动物细胞的系统所培养的人肝细胞的生长情况。
【具体实施方式】
[0026]以下结合附图和【具体实施方式】对本发明作进一步详细描述。
[0027]参考图1，本发明的大规模培养动物细胞的系统包括细胞工厂生物反应器1、储液瓶2、加热盘3、蠕动栗4、供氧器5、在线检测器6以及将上述各个部件有序导通连接的循环管路7。本实施例中，上述各部件的连接顺序依次为细胞工厂生物反应器I一一储液瓶2一一加热盘3—一蠕动栗4一一供氧器5—一细胞工厂生物反应器1，上述连接形成本系统的主循环管路；进一步地，所述在线检测器6并联连接在所述细胞工厂生物反应器I和储液瓶2之间。
[0028]具体地，所述细胞工厂生物反应器I是动物细胞的生长场所，培养过程完成后可以从该细胞工厂生物反应器I中收获动物细胞或者动物细胞的目标代谢物。针对动物细胞的生长特点，所述细胞工厂生物反应器I优选采用微载体生物反应器；进一步地，针对人肝细胞C3A的培养，可以采用Cytodex3微载体。为优化动物细胞的培养微环境，所述细胞工厂生物反应器I的罐体的上下两侧分别开设用于灌注培养基的第一端口 11和第二端口 12。
[0029]所述储液瓶2用于储存新鲜的液体培养基，该储液瓶2的瓶口设有双孔瓶塞，所述瓶塞的两孔分别连接用于流入或流出液体培养基的管道。
[0030]所述加热盘3为电致发热器件，该加热盘3会对流经该加热盘3的液体培养基进行加热，以满足动物细胞在体外扩增中对温度的要求。
[0031]所述蠕动栗4为在所述培养动物细胞的系统内流动的液体培养基提供流动的驱动力，可以利用对应的控制装置调节该蠕动栗4的流速等影响液体培养基循环的参数。
[0032]所述供氧器5为所述细胞工厂细胞反应器I提供动物细胞体外扩增所需的氧气，所述“氧气”并不是纯氧，而是5%的二氧化碳和95%氧气的混合气，据此，采用在外科手术中广泛使用的膜式氧合器来作为所述供氧器5，可以优化液体培养基的气体交换过程，保证液体培养基的氧含量满足动物细胞体外扩增的要求。
[0033]所述在线检测器6通过一个三通阀761与该系统的主循环管路并联连接，用于根据需要在线检测培养基的PH值和溶解氧的含量，检测所得的实时数据用于指导该培养动物细胞的系统的其他器件的参数的调节。
[0034]所述循环管路7包括第一分管路71、第二分管路72、第三分管路73、第四分管路74、第五分管路75和第六分管路76。其中，所述第一分管路71上设有第一夹管阀712和第二夹管阀713，并且在所述两个夹管阀之间的管路上开设第一接口 711 ;所述第二分管路72上设有第三夹管阀722和第四夹管阀723，并且在所述两个夹管阀之间的管路上开设第二接口 721 ;进一步地，所述第一分管路71的左端和第二分管路72的左端相互连接形成第三接口 731，所述第一分管路71的右端和第二分管路72的右端相互连接形成第四接口 732 ;所述第三分管路73的左端与所述第三接口 731连接，该第三分管路73的右端与所述第四接口 732连接，并且该第三分管路73将所述储液瓶2、加热盘3、蠕动栗4和氧合器5串接；所述第四分管路74—端与所述第一接口 711连接，另一端通过所述第一端口 11与所述细胞工厂生物反应器I连接；所述第五分管路75的一端与所述第二接口 721连接，另一端通过所述第二端口 12与所述细胞工厂生物反应器I连接；所述第六分管路76的一端通过三通阀761与所述第三分管路73连接，另一端连接所述在线检测器6。
[0035]进一步地，所述第一夹管阀712、第二夹管阀713、第三夹管阀722和第四夹管阀723的开、闭状态影响了该培养动物细胞的系统中液体培养基的流动方向，具体情况如下:
[0036](I)如图1所示，假设所述蠕动栗4驱动液体培养基向左流动，所述第一夹管阀712和第四夹管阀723处于打开的状态，所述第二夹管阀713和第三夹管阀722处于关闭的状态；该系统中的液体培养基从所述储液瓶2从左侧流出，沿所述第三分管路73依次经过所述