应用于大规模悬浮培养的表达目的蛋白cho细胞株的筛选方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种应用于大规模悬浮培养的表达目的蛋白CHO细胞株的筛选方法。
【背景技术】
[0002] 从上世纪60年代开始，人们就开始了利用哺乳动物细胞培养技术生产各种大分 子生物制品。并且，伴随着永久性细胞株的大量开发和应用，以及在实际需要和商业利益需 求下，以哺乳动物细胞为工具的药用蛋白研宄与生产开始快速的发展起来，如病毒疫苗、抗 体、干扰素、激素、免疫调节剂、和生长因子等的研宄与生产。
[0003] 常用于外源蛋白表达的哺乳动物细胞有CHO、NS0、杂交瘤等细胞，其中，CHO细 胞来源于中国仓鼠的卵巢，常用于生物学和医学研宄，中国仓鼠卵巢（Chinese hamster ovary，CH0)细胞是外源真核基因的最佳表达系统，是生物制药中最常用的哺乳动物细胞。
[0004] 1984年Genentech公司利用r-CHO细胞表达的组织型纤溶酶原激活剂t-PA，成为 第一个运用哺乳动物细胞培养技术大规模生产的生物技术药物。当今，CHO细胞已经是工 业上生产重组蛋白最常用的细胞系。在已经上市和正在进行临床研宄的基因工程药物中， 约60-70%为哺乳动物细胞表达产品，而CHO细胞表达产品占其中的绝大部分。
[0005] 中国仓鼠最早用于研宄是在1919年，当时是用于替代老鼠进行肺炎双球菌的测 定。1949年，中国仓鼠被带到美国，并在实验室中进行繁育。次年，人们发现，中国仓鼠仅含 有11对染色体，因此被认为是放射细胞遗传学和组织培养的理想模型。1957年，Theodore T Puck得到一个雌性中国仓鼠，并从由此获得原始的中国仓鼠卵巢细胞系，这种细胞的生 长需要培养基中含有脯氨酸。从此以后，CHO细胞由于生长快速以及蛋白产量高而被广泛 使用。
[0006] CH0-K1来自于原始的CHO细胞系，与原始CHO细胞系相比，它含有较少的DNA。 CH0-K1突变产生了 CH0-DXB11 (也称作CHO-DUKX或CH0-DUK-XB11 )，它是二氢叶酸还 原酶（DHFR)缺陷型的，其中一个二氢叶酸还原酶等位基因（dhfr)位点缺失，另外一个位 点的dhfr发生了错义突变。之后，人们使用原始CHO细胞系中一株脯氣酸依赖的细胞株 (CH0-pro3)，经过突变产生了 CH0-DG44,这株细胞的dhfr等位基因的两个位点都是缺失 的。CH0-DXB11和CH0-DG44是两株DHFR缺陷的细胞，他们生长需要甘氨酸、次黄嘿呤和胸 苷(称为GHT)，这两株细胞常作为宿主细胞，用于转染外源基因。由于外源基因和dhfr基因 一起转染到DHFR缺陷CHO细胞中，因此可以在不含GHT的培养基中生长，因此，GHT缺陷培 养基可以用于筛选转染阳性细胞。
[0007] 使用DHFR缺陷的CHO细胞作为宿主，表达外源基因的步骤为： 1.表达载体构建：克隆目的基因，把目的基因和dhfr基因整合到一个载体上或者两者 在不同的载体上。
[0008] 2.转染：把表达载体转染到DHFR缺陷的CHO细胞中。
[0009] 3.选择：转染后的细胞在GHT缺陷的培养基中生长，存活下来的即为dhfr阳性细 胞，通常也含有目的基因。
[0010] 4.基因扩增：上一步骤中获得的阳性细胞常常仅含有目的基因的单个拷贝，为了 提高基因拷贝数，在培养基中添加甲氨蝶呤(MTX，二氢叶酸还原酶的竞争性抑制剂）用于扩 增dhfr，并进而使得目的基因得到扩增。
[0011] 5.细胞筛选：从经过基因扩增的细胞中挑选出产量高的细胞，并评估其稳定性。
[0012] 以上步骤是传统的筛选方法。
[0013] CHO细胞大规模悬浮培养这个蛋白药物生产制备的核心环节，是确保蛋白药物的 研发、临床用药和生产销售用量的根本。应该可以这么认为：蛋白药物，特别是治疗性单克 隆抗体及其融合蛋白药物的发展是推动这一技术发展的主要动因。在国内，治疗性单抗及 其融合蛋白药物的研发和生产才刚起步，在这方面没有多少技术积累。
[0014] 目前，国际上重组抗体及其融合蛋白的制备主要采用CHO细胞培养工艺，主要 为补料批式培养方式，其单位产量一般可达3~5g/L。（最高可达13g/L，但这是个例，同 时，与产品本身也有较大关系。）大型制药企业的培养规模超过二十万升如：Amgen公司 200000L，Genentech公司250000L等，国内重组抗体及其融合蛋白生产水平低于lg/L，流加 培养规模不超过3000L(中信国健。另，该公司单罐5000L规模，总30000L规模的生产线在 建中。），灌注培养规模不超过（500L )。
[0015] 蛋白药物生产过程中单反应器培养的规模每提高10倍，其综合的生产成本就可 以降低20%以上。可见，目前国内的CHO细胞培养规模与单位产量导致了居高不下的生产 成本，不能满足国内市场所要达到的低成本要求，同时，高企的生产成本也制约了针对国际 市场的委托加工（CMO)服务。
[0016] 与单位产量密切相关的活细胞密度方面，国外已经能够达到5X107cell S/ml的水 平，而最高还不到2X107cells/ml的水平，平均在0. 7X10Tcells/ml左右的水平。在CHO细胞 的培养过程中密度及单位产量的提高，不仅仅受到非常重要的培养基系统及其补料工艺的 影响，还与工艺参数精细控制有关，在培养规模放大的过程中需要即时和精密的调控，经验 不丰富的培养工程师，要做到这一点很难。在这个领域中，国内的所谓核心技术和国际水平 有很大差距，相应的生产工艺根本没有自主知识产权，只是对过期专利技术的照搬或模仿， 是相对落后的。同时，与细胞株的本身以及其筛选过程也有非常大的关系，这也是本项研宄 产生的原因。
[0017] 在目前，许多研宄单位和企业，对于细胞株筛选也是非常看重，关注点主要集中在 蛋白药物的表达量情况和质量情况。同时，也会对细胞培养基及补料策略相关的效果进行 关注，这方面主要是用一致的未经过个性化优化的初步培养工艺在小规模条件下，对各个 候选细胞株进行比较，挑选出获得的蛋白符合质量要求及表达量最高的细胞株，并确定其 活性等基本情况。
[0018] 但是，在细胞株筛选时，对于各个细胞株规模放大培养和工艺优化的适应性比较 方面，或者是对于细胞株能否适应将来规模放大培养及其工艺进一步优化要求方面，无论 是文献报道，还是实际研宄中鲜有出现。
[0019] 在细胞培养规模放大过程及其工艺优化中，需要比较，或者是会产生的要求主要 有：在非常明确的同等条件下，细胞群整体单位产量和乳酸积累情况的比较，对剪切力的耐 受，对渗透压的耐受等情况的要求与区别。
[0020] 同时，在各细胞株经过前期筛选后，当遇到仍然有较多基本情况相似的候选细胞 株时，如果再进行规模放大过程及其工艺优化的后续比较，将会产生极大的时间和资金成 本，因此，在实际工作中基本上是不会进行后续的比较，而是根据非常接近的前期筛选数 据，对现有的各后续细胞株进行类似于随机方式的选择。这样，其实所选择的细胞株并不一 定是最适合于后续大规模悬浮培养的细胞株，会让许多项目失去获得尽量向最佳成果靠近 的机会。
[0021] 因此，需要有一种应用于大规模悬浮培养的表达目的蛋白CHO细胞株的筛选方 法，以便从众多在前期筛选中基本情况相似的候选细胞株中，选择出综合情况更适合于大 规模悬浮培养的细胞株，即通过这种筛选方式获得的细胞株，将比在此阶段通过类似于随 机方式选择出的细胞株，在进行大规模悬浮培养时得到更高的蛋白表达产量。
【发明内容】
[0022] 本发明的目的在于提供一种应用于大规模悬浮培养的表达目的蛋白CHO细胞株 的筛选方法。
[0023] 为实现上述目的，本发明提供如下技术方案： 一种应用于大规模悬浮培养的表达目的蛋白CHO细胞株的筛选方法，其特征在于该方 法的具体步骤为： a. 使用传统筛选方法获得若干个候选细胞株，简要步骤如下：采用的细胞株为CHO细 胞，在无血清悬浮培养进行目的蛋白的表达，根据实际需要，筛选出Qp值符合要求的细胞 株作为种子进行保存； b. 对步骤a所得到的细胞株进行连续式培养筛选，具体步骤如下： b-Ι.取步骤a所筛选出的细胞株进行复苏操作后，分别接种于无血清培养基中，接种 的密度为1~5X105cellS/ml，得到细胞悬浮液，进行后续的互不干扰的平行培养过程； b-2.将步骤b-Ι所得各细胞悬液进行摇瓶培养，摇床速度50~150rpm，二氧化碳浓度 3~8%，培养温度35~37°C，培养48~92小时后，在离心条件为800~1500rpm下，离心 分离3~8分钟，取细胞沉淀接种于无血清培养基中，得到接种密度为3±0. 15X105Cells/ ml的细胞悬液； b-3.将b-2步骤所得各细胞悬液进行摇瓶培养，摇床速度50~150rpm，二氧化碳浓度 3~8%，培养温度35~37°C，至活细胞密度达到2~3X106cells/ml ; b-4.将步骤b-2所得各细胞悬液进行离心分离，离心条件为800~1500rpm，3~8分 钟，收集上清，在-25~-15°C条件下，密封保存； b-5.将步骤b-4所得各细胞沉淀悬于无血清培养基中，该无血清培养基的量与步骤 b-2中所使用的无血清培养基体积相同； b-6.将步骤b-5所得各悬浮液进行摇瓶培养，摇床速度50~150rpm，二氧化碳浓度 3~8%，培养温度35~37°C，培养20~28小时后，取样计量活细胞密度； b-7.取步骤b-6所得悬浮液重复步骤b-4到步骤b-6,至活细胞密度达到稳定值，进入 连续式培养的稳定期，维持稳定期操作3~10天； b-8.检测各上清液中的每20~28小时的目的蛋白的单位产量，按实际需要筛选出蛋 白单位产量符合要求的细胞株； C.对步骤b筛选出的各细胞株的悬浮液进行通气干涉连续式培养筛选，具体步骤如 下： c-Ι.在20~30ml/min的流速通入空气的条件下，重复步骤b-4到步骤b-6,到活细胞 密度达到稳定期后3~10天； c-2.调整通气量，增幅为20~30ml/min，并重复步骤b-4到步骤b-6,到活细胞密度达 到稳定期后3~10天； c-3.重复步骤c-2,直至细胞群全部死亡； c-4.根据能够重复步骤c-2的次数和实际需要，筛选出符合要求的细胞株； d. 对步骤c所筛选出的各细胞株进行渗透压干涉连续式培养筛选，具体步骤如下： d-Ι.实行步骤b-Ι到b-7的操作，不保存上清； d-2.调整其渗透压值，增幅为40± lOmOsm/kg，在新的渗透压条件下，重复步骤b-4到 步骤b-6,不保存上清，到活细胞密度达到稳定期后3~10天； d-3.重复步骤d-2，直至细胞群基本全部死亡； d-4.根据能够重复步骤d-2的次数和实际需要，筛选出符合要求的细胞株； e. 对步骤d中所筛选出的各细胞株进行补料批式培养筛选，最后筛选出符合要求的 细胞株。
[0024] 与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明通过实际实验的