利用免疫共沉淀与Western blot技术相结合来检测血清中蛋白的方法
【专利摘要】本发明公开了一种利用免疫共沉淀与Western blot技术相结合来检测血清中蛋白的方法。取Dynabeads Protein G超纯水清洗，用EBC裂解液再清洗，溶于EBC裂解液中平均分成两份，对两份Dynabeads Protein G溶液进行分别孵育处理，再混合孵育获得产物，产物弃上清用EBC裂解液清洗三次，得到的沉淀用EBC裂解液重悬，再加入SDS上样缓冲液煮沸，用Western blot方法检测目的蛋白。本发明方法简单有效，特异性好，且准确率极高。因此避免了传统的用于血清中蛋白检测的ELISA方法产生的背景高，准确性低等缺点。
【专利说明】
利用免疫共沉淀与Western b I ot技术相结合来检测血清中蛋白的方法
技术领域
[0001 ]本发明涉及了一种利用免疫共沉淀与Western blot技术相结合来检测血清中蛋白的方法，属于一种血清中蛋白检测的方法。
【背景技术】
[0002]血清中一些蛋白的含量可以作为疾病诊断的指标，如甲胎蛋白等等。而现阶段常用的检测血清中蛋白的方法主要是ELISA双抗夹心法，其主要是通过将蛋白特异性的抗体固定在孔板上，将血清加入孔板孵育，之后再加入特异的一抗使其与抗原相互结合，最终通过显色的方法读取数值，计算蛋白在血清中的含量。另一种方法是直接将血清进行Westernblot实验，检测目的蛋白。
[0003]以上第一种方法中固定在孔板上的抗体也能通过与二抗结合，形成带颜色的产物，因此会造成实验背景值高，准确性低等。第二种方法中由于血清中大量白蛋白的存在，导致血清中的蛋白很难进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，且要求目的蛋白在血清中含量较高。但是血清中的蛋白含量普遍较低，所以该方法的广泛应用受到了一定的限制。目前还没有一种能非常准确和灵敏的检测血清中蛋白的方法。
【发明内容】
[0004]为了解决【背景技术】中存在的问题，本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述不足，而提供了一种利用免疫共沉淀与Western blot技术相结合来检测血清中蛋白的方法，可准确地检测血清中蛋白的含量。
[0005]本发明解决上述问题所采用的技术方案包括以下步骤:
[0006]I)取40?60μ1 Dynabeads Protein G，超纯水清洗三次后，用Iml的EBC裂解液再清洗两次，将清洗后的Dynabeads Protein G溶于200μ1的EBC裂解液中平均分成两份；
[0007]2)对两份Dynabeads Protein G溶液进行分别孵育处理，在混合孵育获得产物；
[0008]3)将步骤2)得到的产物弃上清，用EBC裂解液清洗三次，得到的沉淀用50?100μ1EBC裂解液重悬，再加入SDS上样缓冲液在100°C煮沸I Omin;
[0009]4)用Western blot方法检测步骤3)得到的产物，检测目的蛋白。
[0010]所述步骤2)所有孵育的过程都在4°C下进行，保证了蛋白的活性;所有孵育的体系中都包含了蛋白酶抑制剂，保证蛋白不被降解。
[0011]所述步骤2)具体为:
[0012]2.1)取50?ΙΟΟμΙ新鲜的或者冻存于-80°C冰箱的人血清，与900μ1 EBC裂解液混勾，与其中一份Dynabeads Protein G溶液混勾，4°C轻摇I?2h;
[0013]2.2)另一份Dynabeads Protein G溶液加EBC裂解液补齐至Iml，之后与蛋白的抗体混匀，4°C轻摇I?2h;
[0014]2.3)收集步骤2.1)的上清部分和步骤2.2)的沉淀部分，将两者混合，4 °C轻摇过夜。
[0015]所述步骤3)中重悬后的溶液与SDS上样缓冲液的体积比为4:1。
[0016]所述的EBC裂解液以水为溶剂，溶质包括50mM的Tris-HCl (pH 8.0)、120mM的NaCl和2mM的PMSF。
[0017]本发明需要的Dynabeads Protein G量为40?60μ1，且EBC裂解液极容易配置。
[0018]本发明需要50?ΙΟΟμΙ少量的人血清即能检测蛋白，且血清可长期保存于-80°C冰箱。
[0019]所述的目的蛋白的抗体容易制备，量大且成本低。
[0020]所述步骤2.1)中去除了人血清内源的免疫球蛋白，因此最终获得的样品中组分更加简单(只包含目的蛋白和目的蛋白的抗体)，电泳条带更加清晰，数据更加准确。
[0021 ]本发明与现有技术相比，具有以下优点:
[0022]本发明方法简单有效，特异性好，去除了血清内源的免疫球蛋白的干扰并起到了富集血清中微量目的蛋白的作用，准确率极高。因此本发明解决了现有传统的用于血清中蛋白检测方法而产生的背景高，准确性低等缺点。
【附图说明】
[0023]图1是本发明实施例1产物的Westernblot方法的检测结果条带图。
[0024]图2是本发明实施例2产物的Westernblot方法的检测结果条带图。
[0025]图3是本发明实施例3产物的Westernblot方法的检测结果条带图。
【具体实施方式】
[0026]下面结合附图及具体实施例对本发明作进一步详细说明，以下实施例是对本发明的解释而本发明并不局限于以下实施例。
[0027]本发明实施例是首先取少量收集到的血清稀释于缓冲液中，与DynabeadsProtein G在低温条件下孵育。收集孵育后的上清，与偶联了几丁质酶3样蛋白1(CHI3L1)抗体的Dynabeads Protein G混合，低温条件下再次孵育过夜。之后清洗Dynabeads ProteinG，将杂蛋白清洗干净，最后得到的产物包含Dynabeads Protein G及其偶联的CHI3L1蛋白一抗和CHI3L1蛋白。将该产物进行CHI3L1蛋白的Western blot检测，即可准确的鉴定血清样本中CHI3L1蛋白的含量。
[0028]实施例1
[0029]步骤如下:
[0030]I)取40μ1 Dynabeads Protein G，超纯水清洗三次后，用EBC裂解液(体系:50mMTris-HCKpH 8.0),120mM NaCl and 2mM PMSF)平衡两次，平均分成两份，备用；
[0031 ] 2)取50μ1新鲜的人血清，人血清由医院提供，与900μ1 EBC裂解液混匀，与步骤I)中的一份Dynabeads Protein G混勾，4°C轻摇Ih;
[0032]3)步骤I)中的另一份Dynabeads Protein G加EBC裂解液补齐至Iml，之后与CHI3L1蛋白的抗体混匀，4 °C轻摇I h;
[0033]4)收集步骤2)的上清和步骤3)的沉淀部分，将两者混合，4°C轻摇过夜；
[0034]5)将步骤4)得到的产物弃上清，并用EBC裂解液清洗三次，最后得到的沉淀用50μ1EBC裂解液重悬，加入5 X SDS上样缓冲液，100°(:煮沸101^11;
[0035]6)用Western blot方法检测步骤5)得到的产物，所用到的一抗为CHI3L1抗体。
[0036]结果如图1所示，其中的条带即指示的CHI3L1蛋白。
[0037]实施例2
[0038]步骤如下:
[0039]I)取50μ1 Dynabeads Protein G，超纯水清洗三次后，用EBC裂解液(体系:50mMTris-HCKpH 8.0),120mM NaCl and 2mM PMSF)平衡两次，平均分成两份，备用；
[0040]2)取75μ1新鲜的人血清，人血清由医院提供，与900μ1 EBC裂解液混匀，与步骤I)中的一份Dynabeads Protein G混勾，4°C轻摇2h;
[0041]3)步骤I)中的另一份Dynabeads Protein G加EBC裂解液补齐至Iml，之后与CHI3L1蛋白的抗体混匀，4 °C轻摇2h;
[0042]4)收集步骤2)的上清和步骤3)的沉淀部分，将两者混合，4°C轻摇过夜；
[0043]5)将步骤4)得到的产物弃上清，并用EBC裂解液清洗三次，最后得到的沉淀用75μ1EBC裂解液重悬，加入5 X SDS上样缓冲液，100°(:煮沸101^11;
[0044]6)用Western blot方法检测步骤5)得到的产物，所用到的一抗为CHI3L1抗体。
[0045]结果如图2所示，其中的条带即指示的CHI3L1蛋白。
[0046]实施例3
[0047]步骤如下:
[0048]I)取60μ1 Dynabeads Protein G，超纯水清洗三次后，用EBC裂解液(体系:50mMTris-HCKpH 8.0),120mM NaCl和2mM PMSF)平衡两次，平均分成两份，备用；
[0049]2)取ΙΟΟμΙ冻存于_80°C冰箱的正常人或胃癌病人、乳腺癌病人血清，人血清由医院提供，与900μ1 EBC裂解液混勾，与步骤I)中的一份Dynabeads Protein G混勾，4°C轻摇1.5h；
[0050]3)步骤I)中的另一份Dynabeads Protein G加EBC裂解液补齐至Iml，之后与CHI3L1蛋白的抗体混匀，4 °C轻摇1.5h;
[0051]4)收集步骤2)的上清和步骤3)的沉淀部分，将两者混合，4°C轻摇过夜；
[0052 ] 5)将步骤4)得到的产物弃上清，并用EBC裂解液清洗三次，最后得到的沉淀用100μI EBC裂解液重悬，加入5XSDS上样缓冲液，100°(:煮沸101^11;
[0053]6)用Western blot方法检测步骤5)得到的产物，所用到的一抗为CHI3L1抗体。
[0054]结果如图3所示，其中的条带即指示的CHI3L1蛋白。
[0055]图中可见，CHI3L1蛋白在胃癌和乳腺癌病人血清中较正常人高，说明可以将血清中的CHI3L1蛋白作为胃癌和乳腺癌诊断的标志蛋白。
[0056]由此可看出，本发明方法简单有效，特异性好，去除了血清内源的免疫球蛋白的干扰并起到了富集血清中微量蛋白的作用，且准确率极高。避免了传统的用于血清中蛋白检测方法而产生的背景高，准确性低等缺点。
[0057]虽然本发明已以实施例公开如上，但其并非用以限定本发明的保护范围，任何熟悉该项技术的技术人员，在不脱离本发明的构思和范围内所作的更动与润饰，均应属于本发明的保护范围。
【主权项】
1.一种利用免疫共沉淀与Westernblot技术相结合来检测血清中蛋白的方法，其特点在于包括以下步骤: 1)取40?60μ1Dynabeads Protein G，超纯水清洗三次后，用Iml的EBC裂解液再清洗两次，将清洗后的Dynabeads Protein G溶于200μ1的EBC裂解液中，平均分成两份； 2)对两份DynabeadsProtein G溶液进行分别孵育处理，再混合孵育获得产物； 3)将步骤2)得到的产物弃上清，用EBC裂解液清洗三次，得到的沉淀用50?ΙΟΟμΙEBC裂解液重悬，再加入SDS上样缓冲液在100°C煮沸I Omin; 4)用Westernblot方法检测步骤3)得到的产物，检测目的蛋白。2.根据权利要求1所述的一种利用免疫共沉淀与Westernblot技术相结合来检测血清中蛋白的方法，其特点在于:所述步骤2)所有孵育的过程都在4°C下进行，所有孵育的体系中都包含了蛋白酶抑制剂。3.根据权利要求1所述的一种利用免疫共沉淀与Westernblot技术相结合来检测血清中蛋白的方法，其特点在于:所述步骤2)具体为: 2.1)取50?ΙΟΟμΙ新鲜的或者冻存于-80°C冰箱的人血清，与900μ1 EBC裂解液混匀，与其中一份Dynabeads Protein G溶液混勾，4°C轻摇I?2h; 2.2)另一份Dynabeads Protein G溶液加EBC裂解液补齐至Iml，之后与蛋白的抗体混匀，4°C轻摇I?2h; 2.3)收集步骤2.1)的上清部分和步骤2.2)的沉淀部分，将两者混合，4°C轻摇过夜。4.根据权利要求1?3任一所述的一种利用免疫共沉淀与Westernblot技术相结合来检测血清中蛋白的方法，其特点在于:所述步骤3)中重悬后的溶液与SDS上样缓冲液的体积比为4:1。5.根据权利要求1?3任一所述的一种利用免疫共沉淀与Westernblot技术相结合来检测血清中蛋白的方法，其特点在于:所述的EBC裂解液以水为溶剂，溶质包括50mM的Tris-HCl、120mM的NaCl和2mM的PMSF。
【文档编号】G01N33/68GK105938147SQ201610307153
【公开日】2016年9月14日
【申请日】2016年5月10日
【发明人】章晓波, 陈玉磊
【申请人】浙江大学