能与β淀粉样蛋白结合的生物大分子及其编码DNA、β淀粉样蛋白检测试剂盒及其用图
【专利摘要】本发明涉及能与β淀粉样蛋白结合的生物大分子及编码该大分子的DNA、β淀粉样蛋白检测试剂盒及其用途。首先使用抗原43肽β淀粉样蛋白免疫小鼠，确定免疫成功后，分离出小鼠脾脏和淋巴结，提取总RNA，反转录成cDNA，通过PCR扩增出抗体的轻、重链基因；然后组装与扩增scFv DNA，构建pCANTAB5E?scFv重组质粒；再转化质粒得到单链抗体噬菌体库，通过筛选得到目标抗体；最后组装成人β淀粉样蛋白检测试剂盒。本发明筛选得到的抗体检测范围较广，为0~1000pg/ml，线形相关系数高，检测灵敏度可达3.0pg/ml，且非常稳定。
【专利说明】
[0001] 能与β淀粉样蛋白结合的生物大分子及其编码DNAj淀粉样蛋 白检测试剂盒及其用途
技术领域
[0002] 本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及能与β淀粉样蛋白结合的生物大分子 及编码该大分子的DNA、份定粉样蛋白检测试剂盒及其用途。
【背景技术】
[0003] 人口老龄化是当今世界各国面临的重大社会问题，已经引起国际社会的广泛关 注。截至2014年底，我国60岁以上老年人口已经达到2.12亿，占总人口的15.5%。预计2033年 前后将翻番到4亿，到2050年左右，老年人口将达到全国人口的三分之一，"银发潮"将对我 国的经济、社会、政治、文化发展产生深远的影响。老年人的心理及身体健康问题日益成为 全社会关注的焦点。老年痴呆症是老年人脑部功能失调的一种表现，是以智力衰退、行为及 人格变化为特征。典型临床症状包括有记忆力、抽象思考、定向力障碍等，同时伴有社会活 动能力减退。主要表现为健忘、目光呆滞、口齿迟钝，继而影响知觉神经，失去自理能力。它 已成为老年人健康的一大克星。
[0004] 阿尔兹海默病(Alzheimer's disease，AD)是老年痴呆症一种常见形式。目前全世 界大约有2500万AD患者。患者多为老年人，AD目前尚无有效疗法。该病患不仅患者自身痛 苦，而且对于其家庭乃至整个社会都会造成极为消极的影响。迄今为止，AD发病的确切机理 尚未完全清楚。但大量研究揭示:淀粉样前体蛋白（Amyloid precursor protein，APP)产生 的淀粉样蛋白（amyloid l_Peptide，Al)在AD的病理学上起了重要作用。患者大脑中β淀粉 样蛋白出现异常蓄积，常在患者脑细胞内形成脑纤维组织纠结(n euro f i br i 11 ary tang I e， NFT)、脑细胞外形成老年斑（senile plague，SP)。因此，NFT和SP也被认为AD的病理诊断依 据。β淀粉样蛋白（β-Amyloid)是由前体物质β淀粉样前体蛋白（Αβ)经酶解作用形成40到43 个氨基酸的多肽。在机体内，APP普遍存在于人体的心脏、脑、肾、肺、肠等器官。在脑中，中枢 神经系统神经元、星形细胞、小胶质细胞、少突胶质细胞、内皮细胞均能表达ΑΡΡ。正常情况 下，β淀粉样蛋白仅有极少量表达，低浓度的β淀粉样蛋白对未分化、不成熟的神经元有营养 作用，而高浓度的β淀粉样蛋白对已分化的成熟神经元则有毒性作用。β淀粉样蛋白的沉淀 与APP的过度表达和异常加工有关，APP经Ig分泌酶降解，产生淀粉样蛋白生成可溶性和 不可溶性两种状态，不溶的以β折叠为主，上述构象有利于β淀粉样蛋白的聚集。β淀粉样蛋 白在形成高密度、纤维状的聚合体后可引起神经毒性，从而妨碍神经细胞的正常生长与传 导。
[0005] 目前，临床对于老年痴呆症的治疗，首先考虑的是对症治疗，如，神经节苷脂能有 效修复受损或濒死的脑神经细胞，促进神经的修复再生及神经网络的重塑;补充胆碱类药 物能改善其记忆和思维能力。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种非常稳定的能与β淀粉样蛋白结合的生物大分子，该 生物大分子包含SEQ ID NO.2氨基酸序列。
[0007] 本发明的还提供上述生物大分子的用途，即该生物大分子用于定性或/和定量检 测人的体液中人β淀粉样蛋白含量的用途，该生物大分子包含SEQ ID NO.2氨基酸序列。
[0008] 本发明的还提供编码上述生物大分子的DNA，该DNA含有如SEQ ID NO. 1的序列。
[0009] 本发明的还提供β淀粉样蛋白检测试剂盒，其包括： -固相，上述固相上固定了捕捉用抗体，上述捕捉用抗体包括抗人β淀粉样蛋白单链抗 体， -导致变性的溶液，和 -含有检测用抗体的液相，上述检测用抗体包括抗人β淀粉样蛋白多克隆抗体。上述抗 人β淀粉样蛋白单链抗体或抗人β淀粉样蛋白多克隆抗体具有如SEQ ID NO.2的序列。
[0010]采取的进一步优化措施包括： 上述检测用抗体能与上述捕捉用抗体包夹检测β淀粉样蛋白。
[0011] 上述抗人β淀粉样蛋白多克隆抗体经生物素标记；上述液相还包括用于定量测试 参照的标准品。
[0012] 上述液相还包括显色剂;上述显色剂为四甲基联苯二胺；上述导致变性的溶液为 反应终止液;上述反应终止液为HCl。
[0013] 上述液相还包括洗涤液;上述洗涤液为pH值为7.2的含有吐温20的磷酸盐缓冲液； 上述液相还包括浓缩酶结合物，上述浓缩酶结合物包括但不限于辣根过氧化物酶标记 的亲和素。
[0014] 本发明优点在于： 1、 本发明筛选的抗体非常稳定，检测时采用双抗夹心法的反应模式，此方法具有操作 简便、反应快捷的优点，对实验室条件及设备要求不高，易于掌握和推广； 2、 本发明的试剂盒检测范围较广，其检测范围为0~1000pg/ml，该试剂盒线形相关系数 更尚； 3、 本发明的试剂盒灵敏度较高，其检测灵敏度最高可达3.0pg/ml，可用于老年痴呆症 早期预防。
【附图说明】
[0015] 图1是本发明的质粒载体图谱； 图2是本发明使用份定粉样蛋白免疫小鼠后抽血用ELISA方法检测效价； 图3是本发明PCR样品琼脂糖凝胶电泳图。
【具体实施方式】
[0016] 以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
[0017] 实施例:本发明的技术路线是，首先，使用抗原43肽β淀粉样蛋白免疫小鼠，确定免 疫成功后，分离出小鼠脾脏和淋巴结，提取总的RNA，反转录成cDNA，通过PCR扩增出抗体的 轻、重链基因。然后组装与扩增scFv DNA，构建pCANTAB5E-scFv重组质粒。再转化质粒得到 单链抗体噬菌体库，通过筛选得到目标抗体。最后组装成人β淀粉样蛋白检测试剂盒。
[0018] 通过噬菌体展示技术构建和筛选单链抗体 细胞及细胞株采用coh· TGl，用于pCANTAB-5E的转化coh· ΗΒ2151，用于scFv的 表达。
[0019] Triz〇 1总RNA抽提试剂盒、M-MLV反转录酶、RNA酶抑制剂购自Invitrogen公司。Taq DNA聚合酶、T4 DNA连接酶及内切酶均购自NEB公司。DNA胶回收试剂盒购自天根公司。 Ml 3K07辅助噬菌体购自GE公司。某闵扩增的引物序列如下表： 实验方法
动物免疫： β淀粉样蛋白抗原与等量的弗氏完全佐剂混匀后，采用腹部和背部皮下多点注射方式 免疫Balb/C小鼠。每隔14天免疫一次，4次免疫后，抽血用ELISA方法检测效价，具体方法为： 1)用磷酸盐缓冲液将血清按一定比例稀释后（稀释比例见图），每孔50μ1加在包被板 上，于4 °C放置过夜； 2) 用200μ 1含牛血清白蛋白为2%(W/V)、蔗糖为3%(W/V)的磷酸盐缓冲液封闭液封闭包 被板； 3) 同时加入生物素化的抗人β淀粉样蛋白（Αβ)抗体和标准品、样品，每孔为50μ1;样品 中的人β淀粉样蛋白会与加入于孔中的生物素化的抗人β淀粉样蛋白抗体及包被于酶标板 上的多抗结合，形成免疫复合物； 4) 用磷酸盐缓冲液洗涤包被板，游离的成分被洗去； 5) 加入辣根过氧化物酶标记的亲合素，亲合素与生物素特异性结合，游离的成分被洗 去； 6) 反应孔中有人β淀粉样蛋白，辣根过氧化物酶会使无色的显色剂变蓝，加终止液变 黄。在490nm处测OD值。
[0020] 分离纯化淋巴细胞： 取出小鼠脾脏和淋巴结。用PBS洗涤并移除多余脂肪组织，将脾脏和淋巴结置于20目不 锈钢网膜中，轻轻研磨组织，使淋巴细胞通过网膜流入平皿中。用PBS轻轻冲洗不锈钢网膜 和平皿后，轻轻吹打均匀后将细胞悬液置于15ml离心管中，离心收集细胞。
[0021] 提取淋巴细胞总RNA: 按照Invitrogen公司的Tr izol总RNA抽提试剂盒说明书提取淋巴细胞总RNA。
[0022] 反转录合成cDNA: 反应程序为:94°C 5min，42°C 60min，反应产物即为cDNA。
[0023] 反转录体系如下： 暴 Ci:嫌壤_:》..： ISj成 5彻物' .補' dNTi5 MSsiEtf? 1 # ??Μ:> l|sl .、·:夠1:細*!梅. iL辦 :濟莰||爨翁 轉纏纖： 寧 2.5扩增轻、重链基因 轻、重链基因扩增体系如下： 班吻iidte 2ji ?>ΝΑ 袖 <Γ?<?Τ Mbtoj! ? si / ? 试 凝:篸:義錄凝Ci_0 #_ 'Γ????ΟΝΑ 聚会稼 IfM 鉢賴终:纖 麵 扩增程序为:94 °C预变性5min，94 °C变性30s，56 °C退火30s，72 °C延伸30s，30个循环，72 °C延伸lOmin。电泳胶回收纯化轻、重链基因片段。轻链可变区基因片段的扩增：以cDNA为模 板，以VL的上、下游引物VAback和MJAfor-Mix进行PCR扩增。将VL下游引物MJAlfor、MJA 2for、MJX3f〇r和MJA4for混合为MJAfor-Mix。重链可变区基因片段的扩增：以cDNA为模板， 以VH的上、下游引物VH back和VH for进行PCR扩增。
[0024] 2.6 scFv DNA的组装与扩增 Linker引物和轻、重链基因扩增片段，通过重叠延伸拼接PCR( S0E-PCR)，使抗体Vh、Vl 基因与Linker组装成VH-Linker-VL单链抗体。然后通过scFv单链抗体引物扩增scFv DNA。其中正向引物为 Sf i I back，反向引物为 JAI-No 11、JX2-No 11、JX3-No 11 和 JA4-No 11 的 混合物。
[0025] 重叠延伸拼接PCR扩增条件为:94°C lmin，63°C 4min，作用7个循环;添加ScFv单 链抗体引物后再扩增scFv DNA，程序为94°C lmin，55°C lmin，72°C lmin，作用30个循环， 最后72 °C延伸IOmin。
[0026]重叠延伸拼接PCR反应体系为： 寧 '雖灸I 备 1.0辩域〉： j|S| Llists# 1;? 备頌街壤 獄僉藝; :3:辦 H iX 糊 单链抗体库的构建和鉴定 单链抗体scFv片段和噬菌粒载体pCANTAB-5E分别用S/?Ι和NoiI进行酶切，之后连接、 电转化入E. coh TGl感受态细胞。转化的细胞加入培养基37°C振荡培养，当0D600为0.8时， 加入M13K07辅助噬菌体，继续培养至终浓度10 1()pfu/ml。加氨苄青霉素至终浓度lOOug/ml， 继续培养过夜，即可得到单链抗体噬菌体抗体初级库。通过ELISA筛选最理想的单链抗体， 并纯化出质粒，转入[coh HB2151用于scFv的表达。
[0027]实验结果 ELISA方法检测血清效价 使用β淀粉样蛋白免疫小鼠后，抽血用ELISA方法检测效价，结果见图2,结果表明稀释 倍数增加到1:50000时血清中的抗体依然可明显检测到，表明免疫小鼠是成功的。
[0028]重链、轻链基因扩增结果 取7μ I PCR样品琼脂糖凝胶电泳，琼脂糖凝胶浓度为1.3%，6V/cm电泳20min。结果如图3 所示，Vh和Vl均位于250bp和500bp之间。
[0029] Vh和Vl连接后的ScFv基因 取7μ I PCR样品琼脂糖凝胶电泳，琼脂糖凝胶浓度为1.2%，6V/cm电泳20min。结果如图3 所示，Vh和Vl拼接后，得到的ScFv基因约为750bp，其序列如SEQ ID NO. 1所示，所编码的氨基 酸序列如SEQ ID NO.2所示，具体如下： ScFv基因，SEQ ID NO. 1: ATGGCCCAGGTCAAACTGCAGGAGTCAGGCGGCGACCTGAAGAAGCCCGCCGCCACCGTGAGAATCAGCTGCA AGGCCACCGCCTACAGCTGGAGCACCTACGGCATGCACTTCGTGAAGAACGCCCCCGGCCAGCACCTGGAGTTCATG GGCTTCATCAACGCCGGCCAGGGCGCCAGCCACTACAGCCAGAGATTCAACGGCAGAGTGAGCATCACCAAGGAGAG CACCGCCAGCACCGGCTACATGGACGTGACCACCATCAGAAGCGACGAGACCGCCGTGTTCTACTGCGCCCACAGCA GAAAGAAGAACTTCGGCCAGGGCAGCCTGGTGACCGTGAGCAGAGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGC GGCGGCGGCAGCAGCGACATCACCAACGACCCCGGCGTGACCCTGGCCCTGGGCAACACCGTGAGACTGACCTGCCA GGGCGAGAGCATCAAGAGCTACTACGGCAGCTGGTACAACAACAAGCCCGCCCAGGCCCCCCTGGTGCTGATCTACG GCAAGCAGAACAAGCCCAGCGGCCTGCCCGACAGAAAGTTCAGCGGCACCACCAGCGGCCAGACCGGCAGCGTGACC ATCACCGCCGCCCAGGCCGACGAGGAGGCCGAGTTCTACTGCAACACCAGAGAGACCAGCGCCAACCACCTGGTGTT CGGCGCCGCCACCAGAATCAGCCTGGTGGGCGCCGGCGCCGAGCAGGGCACCAAGCTGGAAATCAAACGGGCGGCCG CAGAATGACTC ScFv基因的氨基酸序列，SEQ ID NO.2: MAQVKLQESGGDLKKPAATVRISCKATAYSWSTYGMHFVKNAPGQHLEFMGFINAGQGASHYSQRFNGRVSIT KESTASTGYMDVTTIRSDETAVFYCAHSRKKNFGQGSLVTVSRGGGGSGGGGSGGGGSSDITNDPGVTLALGNTVRL TCQGESIKSYYGSWYNNKPAQAPLVLIYGKQNKPSGLPDRKFSGTTSGQTGSVTITAAQADEEAEFYCNTRETSANH LVFGAATRISLVGAGAEQGTKLEIKRAAAE* SEQ ID NO. I和NO. 2对应如下： λλλ CS：<5- CSsS 'ΓΓ?5· .??: Ο?-ΟΓ ?·> ?? λ ：?5·.： ·ν· ：?： ?.立 S 丨-5 ^ &： ：￡.： ：Χ；： 'K; 5* A 义 ?： V λΛΧ λ?'Λ'： iOvVi >.^5 Λ.·Λ\' Λν.5Τ'Χ* Λ?.* '： 汉 i S G Λ i X ? JS 次 Ι? ? X ?? ：??. Λ； Λ' V K Α··.ν： χ,'ΛΟ ?：.'V Ki-'-y： ?.λ* ^ >, ? C ^ ·? ? 1 % λ ?； i A $ Λ??； ^.W.' .??- ?Υ：·.·： .\λ.： ?,.??; :5tVV AS···： ·'： ??? >；· 'S' is ?5 %. .ST ..Α? ·?? ?? 'λ :5：: Τ. :7:._ ?? R S "S A ?? λ- AS--C .?Λν； *?.<； NXiV? ν?Χ" ：；^Χ? > ?Λ；ν ?ν?, ν??? ^ v ^ V 5-i C V T ^ T S. ? ? A V $' ? 、Γ >, K ΑΛ"; =?? '5^ir '怒.'? 靶::：氣滅： f:. '洛 益：_:杳_ 致.. ψ 'i..吻 ：s.. .趣歲.：威.. ΝΛΧ' *C；', <X'C ?：^ s: '?Λ·；' ..:这...窣....承.费.疫.，S::.:嘁 象凑.:卷..:簽.努： Z % .誇...SS..::这.,杳.V A.cr C-Tii v?<^ Ctr-i λλ-C ^?'? λ-?-Α OTC： ：·：Λ?〇 -S-Ai λν? J^C rA'；s < '???? t ?.. Λ Α、 Λ： η Y K ?· Y $ 兌 S c ：? A ?? ? Tix \ν；ν：； ?·5>? ????? ·?.^·. ；%Λ.Ο Χλ-s ^.'C ??.ν·：： WAi； -.'XX' C5\> ?>Γ·5 .VAT:? VAi" ^ Y Q S V 文 ?? 攻 K χ· Α. 公 ,λ·: ：\· λ、 ? V ? K ΑΛΟ <：Ci： ^ ?.Τ-ν Α??λ .?Α?； Χ5Χ" C^X ^ λ??； ^ 'χΑ-?? <. *<：$ 〇· ?? .St··: S ? -S： Λ； 公 l> .5? . _;Κ_ y_ S： S .7: S ?? T ,5ν^ \：?^ Λ?.ν Α??： AO '： ???.ν： ?，Κ；0 \ν?<： ?；Α* ? :\' ?Λ?Λ AA V As：；V 令 * V ? λ ? λ· * ·? iS. S： > & ? ?? C j ·? .?^? (6.?-:? ?；<χ； .?.?^ ·??'Χ· ·ΤΧ'￥. <SSS -:5^- Α：??τ .?:? ?.·><： ν^·$ ^?·'； <. Λ：ζ·> ? δ T SS ·\ ?! ￥1 X· Sf <5 A Sf S ? -S 乙 \s <5 sHV： s<.C?ir ?λ^Λ iS.T^ νν：^ ?.Λν： ??*：^ χ"^. < "、·· 义 众 λ S. 公 <5 T K Ss 5i .? ?? R A 备各:iV + 单链抗体的鉴定 筛选获得步骤3.3所述序列的单链抗体后，纯化出质粒，转入I C〇2i HB2151用于ScFv 的表达，所得单链抗体分子量约为25KD。
[0030]组装人β淀粉样前体蛋白试剂盒 ELISA筛选出合适单链抗体后，组装成人β淀粉样蛋白试剂盒。该试剂盒包括抗体包被 板条、标准品、浓缩生物素化抗体(单链抗体标记生物素 ）、浓缩酶结合物、试剂稀释液、浓缩 洗涤液、显色剂及终止液。具体组成如表1所示。
[0031] 表1本发明人β淀粉样蛋白试剂盒的组成
抗体包被板条的制备包括以下步骤：用pH值为7.2的磷酸盐缓冲液将本发明制备的鼠 抗人β淀粉样蛋白单链抗体稀释至lμg/ml，加在包被板上，用封板纸封板，在4°C放置24h过 夜后，将包被板置于洗板机上，用pH值为7.2的吐温20含量为0.1%(V/V)的磷酸盐缓冲液洗 板一次，然后加入pH值为7.2、含牛血清白蛋白为2%(W/V)、蔗糖为3%(W/V)的磷酸盐缓冲液， 在室温下放置2h，甩干封闭液，风干。风干的包被板装入铝箱袋中，加入干燥剂，密封即得抗 体包被板条。
[0032]标准品的制备包括以下步骤：以pH值为7.2，含牛血清白蛋白为5%(W/V)的磷酸盐 缓冲液为溶剂，将人β淀粉样蛋白重组蛋白标准品配制成2000pg/50l·! 1/支的溶液，将该溶液 置于_70°C低温环境中冻干2h，然后将其置于冷冻干燥机中冻干8h，密封即得标准品。
[0033]浓缩生物素化抗体为生物素标记的抗人β淀粉样蛋白单链抗体，具体采用Thermo Fisher:Sulfo-NHS-LC-Biotin Kit来标记本发明的抗人β淀粉样蛋白单链抗体。浓缩酶结 合物为辣根过氧化物酶标记的链亲和素。试剂稀释液为PH值为7.2、牛血清白蛋白含量为1% (W/V)的磷酸盐缓冲液。浓缩洗涤液为pH值为7.2、吐温20含量为0.1%(V/V)的磷酸盐缓冲 液。显色剂为四甲基联苯二胺。终止液为IN HCUlN盐酸）。
[0034]利用本发明的试剂盒进行人β淀粉样蛋白检测，采用双抗体夹心ELISA法。抗人β淀 粉样蛋白单链抗体包被于酶标板上，同时加入标本、标准品和生物素化的抗人β淀粉样蛋白 单链抗体，标本、标准品中的人β淀粉样蛋白会与加入于孔中的生物素化的抗人β淀粉样蛋 白抗体及包被于酶标板上的单抗结合，形成免疫复合物，游离的成分被洗去。加入辣根过氧 化物酶标记的亲合素，亲合素与生物素特异性结合，游离的成分被洗去。加入显色底物（显 色剂），若反应孔中有人β淀粉样蛋白，辣根过氧化物酶会使无色的显色剂变蓝，加终止液变 黄。在490nm处测OD值，人β淀粉样蛋白浓度与OD 49q值之间呈正相关，可通过绘制标准曲线求 出标本中人β淀粉样蛋白浓度。具体包括以下步骤： 试验所需自备试验器材： 1.酶标仪(490nm检测波长滤光片，570nm或630nm校正波长滤光片）； 2 ·高精度加液器及一次性吸头:0 · 5-10μ 1，2-20μ 1，20-200μ 1，200-1000μ 1; 3.微孔板振荡器，双蒸水或去离子水，坐标纸。
[0035] 标本收集： 1.收集血液的试管应为一次性的无热原，无内毒素试管； 2. 血浆抗凝剂推荐使用EDTA，避免使用溶血，高血脂标本； 3. 标本应清澈透明，悬浮物应离心去除； 4. 标本收集后若不及时检测，需按一次使用量分装，冻存于-20°C或-70°C冰箱内，避 免反复冻融； 5. 可根据标本的实际情况，做适当倍数稀释； 注:血清或血浆样本冻存后聚合的蛋白会遮盖抗原的表位，建议用试剂稀释液将血清 或血浆样本做1:2稀释后检测。计算样本含量时应乘以稀释倍数。
[0036] 注意事项： 1. 试剂盒使用前请保存在2-8tC，除复溶后的标准品，其它成分不可冻结； 2. 浓缩生物素化抗体、浓缩酶结合物体积小，运输中颠簸和可能的倒置会使液体沾到 管壁或瓶盖。因此使用前请用手甩几下或1000 rpm离心1分钟，以使附着管壁或瓶盖的液体 沉积到管底； 3. 从冰箱中取出的浓缩洗涤液可能有结晶，属于正常现象，微加热至40°C使结晶完全 溶解后再配制洗涤液； 4. 若需要分次使用标准品，在标准品复溶后应按每一次用量分装，将其放在-20或-70 °C贮存。避免反复冻融； 5. 不同批号的试剂盒组份不能混用(洗涤液和反应终止液除外）； 6. 充分轻微混匀对反应结果尤为重要，最好使用微量振荡器(使用最低频率），如无微 量振荡器，可在反应前手工轻轻晃动酶标板，使加入孔中的反应液混匀； 7. 酶免试验中标准品和样本检测时建议作复孔。
[0037] 检测前准备工作： 1. 提前20分钟从冰箱中取出试剂盒，以平衡至室温； 2. 将浓缩洗涤液用双蒸水稀释（1:20)，未用完的放回4°C冰箱； 3. 标准品：加入试剂稀释液1.0 ml至冻干标准品中，静置15分钟，待其充分溶解后，轻 轻混匀（浓度为2000pg/ml)。然后根据需要进行稀释。建议标准曲线使用以下浓度：1000、 500、250、125、62·5、31·25、15·625、0 pg/ml; 4. 生物素化抗体工作液:按当次试验所需用量，用试剂稀释液稀释浓缩生物素化抗体 (1:100)配置成生物素化抗体工作液。使用前30分钟准备。仅供当日使用； 5. 酶结合物工作液：按当次试验所需要用量，用试剂稀释液稀释浓缩酶结合物（1: 100)配置成酶结合物工作液。使用前30分钟准备。仅供当日使用。
[0038]洗涤方法： 1. 自动洗板机:要求注入的洗涤液为350μ 1，注入与吸出间隔20-30秒。洗板4次； 2. 手工洗板:每孔加洗涤液350μ1，静置30秒后甩尽孔内液体，在厚迭吸水纸上拍干。 洗板5次。
[0039] 操作步骤： 1. 从已平衡至室温的密封袋中取出试验所需板条，未用的板条和干燥剂请放回铝箱 袋内封存于4°c; 2. 留空白孔(若使用双波长读板，空白孔可以不设）； 3. 提前准备好样本、标准品和生物素化抗体工作液； 4. 先将不同浓度标准品（OmIU/ml孔加试剂稀释液)分别加入相应孔中（100μΙ/孔）;在 每个样本孔中加入50μ1样本稀释液和50μ1样本(此时样本已做了 1:2倍稀释，计算结果时样 本含量要乘以2);随后在样本和标准品孔中加入50μ1生物素化抗体工作液，用封板胶纸封 住反应孔； 5. 室温(20~25°C)孵育120分钟。最好使用微量振荡器(最低频率，IOOrpm); 6. 提前15分钟制备酶结合物工作液。室温避光放置； 7. 洗板5次； 8. 除空白孔外，加入酶结合物工作液(100μ 1/孔）。用封板胶纸封住反应孔； 9. 室温(20~25°C)避光孵育60分钟。最好使用微量振荡器(最低频率，IOOrpm); 10. 洗板5次； 11. 加入显色底物(包括空白孔）1〇〇μ1/孔，室温(22~25°C)，避光孵育15分钟； 12. 加入终止液(包括空白孔）100μ 1 /孔，混匀后即刻测量0D490值（10分钟内）。
[0040] 结果判断： 1. 每个标准品和标本的OD值应减去零孔的OD值(若不减零孔值，标准曲线的零孔应相 交于Y轴）； 2. 手工绘制标准曲线。以标准品浓度作横坐标，OD值作纵坐标，以平滑线连接各标准 品的坐标点。通过标本的OD值可在标准曲线上查出其浓度； 3. 若标本OD值高于标准曲线上限，应适当稀释后重测，计算浓度时应乘以稀释倍数。 [0041 ]本发明试剂盒的稳定性和灵敏度测试 比较本发明人β淀粉样蛋白试剂盒与目前市场上的人体β淀粉样蛋白试剂盒的稳定性 和灵敏度。
[0042] 1实验方法 (1) 用磷酸盐缓冲液将鼠抗人β淀粉样蛋白抗体稀释至lμg/ml，每孔50μ1加在包被板 上，于4 °C放置过夜； (2) 用200μ 1含牛血清白蛋白为2%(W/V)、蔗糖为3%(W/V)的磷酸盐缓冲液封闭包被板； (3) 同时加入标准品和生物素化的抗人β淀粉样蛋白抗体，每孔为50μ1，每个浓度梯度 重复三次;标准品中的人β淀粉样蛋白会与加入于孔中的生物素化的抗人β淀粉样蛋白抗体 及包被于酶标板上的单抗结合，形成免疫复合物； (4) 用磷酸盐缓冲液洗涤包被板，游离的成分被洗去； (5) 加入辣根过氧化物酶标记的亲合素，亲合素与生物素特异性结合，游离的成分被洗 去； (6) 反应孔中有人β淀粉样蛋白，辣根过氧化物酶会使无色的显色剂变蓝，加终止液变 黄。在490nm处测OD值。如下表。
尽管已结合优选的实施例描述了本发明，然其并非用以限定本发明，任何本领域技术 人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，能够对在这里列出的主题实施各种改变、同 等物的置换和修改，因此本发明的保护范围当视所提出的权利要求限定的范围为准。
【主权项】
1. 份定粉样蛋白检测试剂盒，其特征是:包括 -固相，所述的固相上固定了捕捉用抗体，所述的捕捉用抗体包括抗人β淀粉样蛋白单 链抗体， -导致变性的溶液，和 -含有检测用抗体的液相，所述的检测用抗体包括抗人β淀粉样蛋白多克隆抗体。2. 根据权利要求1所述的一种β淀粉样蛋白检测试剂盒，其特征是:所述的抗人β淀粉样 蛋白单链抗体或抗人β淀粉样蛋白多克隆抗体具有如SEQ ID NO.2的序列。3. 根据权利要求2所述的一种淀粉样蛋白检测试剂盒，其特征是:所述的检测用抗体 能与所述的捕捉用抗体包夹检测β淀粉样蛋白。4. 根据权利要求1至3任一权利要求所述的一种β淀粉样蛋白检测试剂盒，其特征是:所 述的抗人β淀粉样蛋白多克隆抗体经生物素标记;所述的液相还包括用于定量测试参照的 标准品。5. 根据权利要求1至3任一权利要求所述的一种β淀粉样蛋白检测试剂盒，其特征是:所 述的液相还包括显色剂;所述的显色剂为四甲基联苯二胺;所述的导致变性的溶液为反应 终止液;所述的反应终止液为HC1。6. 根据权利要求1至3任一权利要求所述的一种β淀粉样蛋白检测试剂盒，其特征是:所 述的液相还包括洗涤液;所述的洗涤液为pH值为7.2的含有吐温20的磷酸盐缓冲液;所述的 液相还包括浓缩酶结合物，所述的浓缩酶结合物包括但不限于辣根过氧化物酶标记的亲和 素。7. 能与β淀粉样蛋白结合的生物大分子，其特征是：所述的生物大分子包含SEQ ID NO. 2氨基酸序列。8. -种能与β淀粉样蛋白结合的生物大分子的用途，其特征是:该生物大分子用于定性 或/和定量检测人的离体体液中人β淀粉样蛋白含量的用途;所述的生物大分子包含SEQ ID NO. 2氨基酸序列。9. 一种编码能与β淀粉样蛋白结合的生物大分子的DNA，其特征是：该DNA含有如SEQ ID NO. 1的序列。
【文档编号】C07K16/18GK105938145SQ201610120602
【公开日】2016年9月14日
【申请日】2016年3月3日
【发明人】陶新博, 张守涛, 郭亚楠
【申请人】浙江聚康生物工程有限公司