一种人体β淀粉样蛋白检测试剂盒及其用途
【专利摘要】本发明涉及一种人体β淀粉样蛋白检测试剂盒及其用途，首先使用抗原β淀粉样前体蛋白免疫小鼠，确定免疫成功后，分离出小鼠脾脏和小鼠体内明显的淋巴结，提取总的RNA，反转录成cDNA，通过PCR扩增出抗体的轻、重链基因；然后组装与扩增scFvDNA，构建pCANTAB5E-scFv重组质粒；再转化质粒得到单链抗体噬菌体库，通过筛选得到目标抗体；最后组装成人体β淀粉样前体蛋白检测试剂盒。本发明筛选得到的抗体检测范围较广，为0~1000pg/ml，线形相关系数高，检测灵敏度可达3.5pg/ml，且非常稳定，检测时可采用两步法、室温振荡的反应模式，对实验室条件及设备要求不高。
【专利说明】一种人体β淀粉样蛋白检测试剂盒及其用途
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子生物学【技术领域】，具体地说，涉及一种人体β淀粉样蛋白检测试 剂盒及其用途。
【背景技术】
[0002] 人口老龄化是当今世界各国面临的重大社会问题，已经引起国际社会的广泛关 注。据有关方面统计，我国北京、上海等大城市已迈入了老龄城市，下个世纪前半期我国就 将进入老龄社会，老年人的心理及身体健康问题日益成为全社会关注的焦点。老年痴呆症 是老年人脑部功能失调的一种表现，是以智力衰退、行为及人格变化为特征。典型临床症状 包括有记忆力、抽象思考、定向力障碍，同时伴有社会活动能力减退。主要表现为健忘、目光 呆滞、口齿迟钝，继而影响知觉神经，失去自理能力。它已成为老年人健康的一大克星。
[0003] 阿尔兹海默病（Alzheimer' s disease, AD)是老年痴呆症一种常见形式。目前全 世界大约有2500万AD患者。患者多为老年人,AD目前尚无有效疗法。该病患不仅患者自 身痛苦，而且对于其家庭乃至整个社会都会造成极为消极的影响。迄今为止，AD发病的确切 机理尚未完全清楚。但大量研究支持，淀粉样前体蛋白（Amyloid precursor protein，APP) 产生的淀粉样蛋白（amyloid 1-Peptide，A1)在AD的病理学上起了重要作用。患者大脑 中β淀粉样蛋白出现异常蓄积，常在患者脑细胞内形成脑纤维组织纠结（neurofibrillary tangle, NFT)、脑细胞外形成老年斑（senile plague, SP)。因此，NFT和SP也被认为AD的 病理诊断依据。β淀粉样蛋白（β-Amyloid)是由前体物质β淀粉样前体蛋白（Αβ)经酶 解作用形成40到43个氨基酸的多肽。在机体内，ΑΡΡ普遍存在于人体的心脏、脑、肾、肺、 肠等器官。在脑中，中枢神经系统神经元、星形细胞、小胶质细胞、少突胶质细胞、内皮细胞 均能表达ΑΡΡ。正常情况下，Αβ仅有极少量表达，低浓度的Αβ对未分化、不成熟的神经元 有营养作用，而高浓度的Α β对已分化的成熟神经元则有毒性作用。Α β的沉淀与ΑΡΡ的过 度表达和异常加工有关，ΑΡΡ经β、γ分泌酶降解产生Α β生成可溶性和不可溶性两种状 态，不溶的以β折叠为主，上述构象有利于Α β的聚集。Α β在形成高密度、纤维状的聚合 体后可引起神经毒性，从而妨碍神经细胞的正常生长与传导，最终导致神经细胞的死亡，弓丨 发AD。
[0004] 目前，临床对于老年痴呆症的治疗，首先考虑的是对症治疗，如，神经节苷脂能有 效修复受损或濒死的脑神经细胞，促进神经的修复再生及神经网络的重塑；补充胆碱类药 物能改善其记忆和思维能力。研究β淀粉样蛋白在脑神经细胞内部的早期蓄积发现，在脑 神经细胞外还未出现β淀粉样蛋白蓄积时，阿尔茨海默氏症就已经出现。这一发现或有助 于提早诊断、治疗阿尔茨海默氏症，从而尽可能延缓病情恶化。研发人体β淀粉样蛋白检 测试剂或试剂盒，尤其是操作方便、检测范围广、灵敏度高的检测抗体是十分重要的。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种分离的结合分子。
[0006] 本发明的再一的目的是，提供所述的结合分子的用途。
[0007] 本发明的另一的目的是，提供一种核酸分子。
[0008] 本发明的第四个目的是，提供所述的核酸分子的用途。
[0009] 本发明的第五个目的是，提供一种表达载体。
[0010] 本发明的第六个目的是，提供一种宿主细胞。
[0011] 本发明的第七个目的是，提供一种组合物。
[0012] 本发明的第八个目的是，提供一种检测阿尔茨海默氏症的试剂盒。
[0013] 为实现上述第一个目的，本发明采取的技术方案是： 一种分离的结合分子，其能识别并结合人体β淀粉样蛋白或人体β淀粉样前体蛋白， 所述的结合分子包含SEQ ID Ν0. 2所示的氨基酸序列。
[0014] 为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是： 所述的结合分子在制备检测、治疗和/或预防阿尔茨海默氏症的药物中的应用。
[0015] 为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是： 编码所述的结合分子的核酸分子。
[0016] 所述的核酸分子序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0017] 为实现上述第四个目的，本发明采取的技术方案是： 所述的核酸分子在制备检测、治疗和/或预防阿尔茨海默氏症的药物中的应用。
[0018] 为实现上述第五个目的，本发明采取的技术方案是： 一种表达载体，所述的表达载体中含有编码如上所述的结合分子的DNA。
[0019] 为实现上述第六个目的，本发明采取的技术方案是： 一种宿主细胞，所述的宿主细胞中含有如上所述的表达载体。
[0020] 为实现上述第七个目的，本发明采取的技术方案是： 一种组合物，所述的组合物含有有效量的如上所述的结合分子，以及药学上可接受的 载体。
[0021] 为实现上述第八个目的，本发明采取的技术方案是： 一种检测阿尔茨海默氏症的试剂盒，其包括如上所述的结合分子。
[0022] 本发明优点在于： 1、 本发明筛选的抗体非常稳定，检测时采用两步法、室温振荡的反应模式，此方法具有 操作简便、反应快捷的优点，对实验室条件及设备要求不高，易于掌握和推广； 2、 本发明的试剂盒检测范围较广，其检测范围为(TlOOOpg/ml，与市场主流产品相比， 该试剂盒线形相关系数更高； 3、 本发明的试剂盒灵敏度较高，其检测灵敏度最高可达3. 5pg/ml，可用于老年痴呆症 早期检测。
[0023] 总体来说，本发明的试剂盒其质量及使用效果都达到了国内外领先的水平。
【专利附图】
【附图说明】
[0024] 附图1是pCANTAB-5E载体图谱。
[0025] 附图2是血清抗体效价检测结果。
[0026] 附图3是重链、轻链基因扩增产物的电泳图谱。
[0027] 附图4是VH和八连接后的ScFv基因的电泳图谱。
[0028] 附图5是筛选的单链抗体的电泳图谱。
[0029] 附图6是BioSource公司试剂盒的线性拟合曲线。
[0030] 附图7是本发明试剂盒的线性拟合曲线。
【具体实施方式】
[0031] 下面结合附图对本发明提供的【具体实施方式】作详细说明。
[0032] 本发明的技术路线是： 首先，使用抗原β淀粉样前体蛋白免疫小鼠，确定免疫成功后，分离出小鼠脾脏和小 鼠体内明显的淋巴结，提取总的RNA，反转录成cDNA，通过PCR扩增出抗体的轻、重链基因。 然后组装与扩增scFv DNA，构建pCANTAB5E-scFv重组质粒。再转化质粒得到单链抗体噬菌 体库，通过筛选得到目标抗体。最后组装成人体β淀粉样前体蛋白检测试剂盒。
[0033] 实施例1通过噬菌体展示技术构建和筛选单链抗体 1实验材料 1. 1细胞及细胞株 万.TG1，用于pCANTAB-5E的转化ΗΒ2151，用于scFv的表达。
[0034] 1. 2质粒载体 PCANTAB-5E :购自Pharmacia公司（被GE收购)，载体图谱见图1。
[0035] 1. 3 试剂 Trizol总RNA抽提试剂盒、M-MLV反转录酶、RNA酶抑制剂购自Invitrogen公司。Tag DNA聚合酶、T4 DNA连接酶及内切酶均购自NEB公司。DNA胶回收试剂盒购自天根公司。 M13K07辅助噬菌体购自Pharmacia公司（被GE收购)。
[0036] 1. 4基因扩增的引物序列（见表1) 表1基因扩增的引物序列表
【权利要求】
1. 一种分离的结合分子，其能识别并结合人体β淀粉样蛋白或人体β淀粉样前体蛋 白，其特征在于，所述的结合分子包含SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列。
2. 权利要求1所述的结合分子在制备检测、治疗和/或预防阿尔茨海默氏症的药物中 的应用。
3. 编码权利要求1所述的结合分子的核酸分子。
4. 根据权利要求3所述的核酸分子，其特征在于，所述的核酸分子序列如SEQ ID NO. 1 所示。
5. 权利要求3或4所述的核酸分子在制备检测、治疗和/或预防阿尔茨海默氏症的药 物中的应用。
6. -种表达载体，其特征在于，所述的表达载体中含有编码权利要求1所述的结合分 子的DNA。
7. -种宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞中含有权利要求6所述的表达载体。
8. -种组合物，其特征在于，所述的组合物含有有效量的权利要求1所述的结合分子， 以及药学上可接受的载体。
9. 一种检测阿尔茨海默氏症的试剂盒，其特征在于，其包括权利要求1所述的结合分 子。
【文档编号】G01N33/68GK104122400SQ201410310072
【公开日】2014年10月29日 申请日期:2014年7月1日 优先权日:2014年7月1日
【发明者】郭亚楠, 秦俭, 陈刚 申请人:上海依科赛生物制品有限公司