一种胃蛋白酶原Ⅰ化学发光定量检测试剂盒及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及免疫检测领域，具体涉及一种胃蛋白酶原I化学发光定量检测试剂盒 及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 胃蛋白酶原（pepsinogen，PG)是胃分泌的一种消化酶前体，是胃液中胃蛋白酶的 无活性前体，为一个由375个氨基酸组成的蛋白多肽链，平均相对分子质量为42, 000,人胃 粘膜中有7组胃蛋白同工酶原。PG在核糖体上合成，由高尔基体分泌出细胞，被盐酸激活后 变成胃蛋白酶。根据生化性质、免疫原性、细胞来源及组织内分布可分成PG I、PG II两个 亚群，其中1~5组分免疫原性近似，称为PG I，主要由胃腺的主细胞的粘液颈细胞分泌。
[0003] 胃蛋白酶原I被盐酸激活后变成小分子的胃蛋白酶，胃蛋白酶只在酸性环境中发 挥作用，PH>6即失去活性，pH=2时优先作用于天然蛋白质，pH=4时能消化某些特异性的肽。 在体外，胃蛋白酶的持续作用可使蛋白分子的肽键约有30%分裂。胃蛋白酶不作用于角蛋 白和黏蛋白，亦不作用于低相对分子质量的蛋白衍生物。在复合维生素与蛋白质结合和释 放上，胃蛋白酶亦起主要作用。
[0004] 血清PG浓度可作为胃酸分泌的检测指标，在幽门螺杆菌阳性体内，PG I水平和 PG I /PG II比值与胃酸分泌量显著相关，其中后者与胃酸分泌量相关性更强。在幽门螺杆 菌阴性体内，PG I的水平与胃酸分泌量显著相关，但PG I /PG II比值与胃酸分泌量无相关 性。通过血清PG浓度估计胃酸分泌量具有临床实用价值。
[0005] PG含量与良、恶性胃溃疡的鉴别有关，血清PG I水平与萎缩性胃炎和消化性溃疡 呈正相关，血清PG I水平升高者，应注意其是否存在溃疡的可能性，对于临床上无症状溃 疡的鉴别具有意义。血清PG I与胃泌酸腺细胞功能相关，PG II与胃底粘膜病变的相关性 较大，血清PG反映胃总体分泌PG水平。胃酸分泌过多引起的浅表性胃炎和幽门螺杆菌感 染引起的萎缩性胃炎都会导致PG I和PG II的分泌增加；慢性严重萎缩性胃炎当主细胞减 少时PG I含量下降；萎缩性胃炎当伴有肠化、胃窦宪假幽门腺化生时，PG II含量会随之增 尚。
[0006] 胃蛋白酶原对胃部疾病的发展历程，一般可表述为：浅表性胃炎一胃粘膜糜烂溃 疡一萎缩性胃炎，及其它疾病具有良好的诊断和筛选作用。胃蛋白酶原I /11检测试剂盒 用于检测血清中的胃蛋白酶原I / II的含量，具有简便、快速的优势，避免了 X-射线对人体 的侵害和胃镜的不便。
[0007] 20世纪70年代中期Arakawe首次报道用发光信号进行分析检测，即利用发光 的化学反应（chemiluminescence，CL)和生物反应（bioluminescence，BL)分析超微量 物质，特别是用于临床免疫分析中检验超微量活性物质。这一方法从实验室的稀有技 术过渡到临床医学的常规检测手段，近十年来获得了很大的发展。化学发光免疫分析 (chemiluminescence immunoassay，CLIA)灵敏度高（10~18mol)、快速（几秒钟内产生化学 发光信号，有的情况下信号可持续几小时)、简便、测试中不使用有害试剂，因此成为非放射 性免疫分析法中最有前途的方法之一。
[0008] 我公司采用的化学发光免疫分析方法，是利用酶催化发光底物使其发生化学反应 并释放出大量的能量，产生激发态中间体。这种激发态中间体，当其回到稳定的基态时，可 同时发射出光子，利用发光信号测量仪器即可测量光量子产额，该光量子产额与样品中的 待测物质的量成比例，由此可以建立标准曲线并计算样品中待测物质的含量。与几种传统 的免疫学检测方法对比而言，无论从最低检测限、检测时间、线性范围、试剂的稳定性、有无 环境污染等方面对比，化学发光法的优势都显得极为突出。
【发明内容】
[0009] 本发明的目的是提供一种胃蛋白酶原I化学发光定量检测试剂盒及其制备方法。
[0010] 本发明所述的胃蛋白酶原I化学发光定量检测试剂盒，包括：1)胃蛋白酶原I抗 体包被微孔板；2) HRP标记胃蛋白酶原I抗体；3)校准品稀释液稀释后的系列胃蛋白酶原 I校准品；4)发光底物A ;5)发光底物B ;6)固体洗液。
[0011] 所述胃蛋白酶原I抗体为鼠源或兔源人胃蛋白酶原I单克隆抗体。
[0012] 所述包被的微孔板为48孔或96孔的微孔板条。
[0013] 所述校准品稀释液的配方为： 去离子水 IL Na2HPO4 2.9g NaH2PO4 0. 2g NaCl 8. 2g 复合蛋白保护剂PHD 0. 5g 5%酪蛋白 IOg Tween-20 10mT, 0. 1%叠氮钠 ImL。
[0014] 调节胃蛋白酶原I校准品的稀释液pH为7. 4。
[0015] 所述发光底物A为鲁米诺和氢氧化钠溶液。
[0016] 所述发光底物B为过氧化氢和对碘苯酚溶液。
[0017] 所述固体洗液为PBST，PBST固体洗液配方为 KH2PO4 4.8g Na2HPO4* 12H20 28. 8g NaCl 155g Tween-20 10mL。
[0018] 本发明的胃蛋白酶原I化学发光定量检测试剂盒制备方法，包括以下步骤：1)配 制PBST固体洗液及其稀释液；2)胃蛋白酶原I抗体包被微孔板的制备；3)HRP标记胃蛋白 酶原I抗体的制备；4)胃蛋白酶原I校准品的制备；5)配制发光底物A、发光底物B ;6)分 装固体洗液、酶标抗体、校准品、发光底物A和发光底物B并组装为成品。其中： 所述配制PBST固体洗液及其稀释液的步骤为：混合均匀后的PBST固体洗液在气压 500Pa、温度10°C、湿度30%状态下减压低温干燥，Ih后用铝箔袋分装，使用时每5g的PBST 固体洗液溶解在500mL去离子水中混匀。
[0019] 所述制备胃蛋白酶原I抗体包被微孔板的步骤为：采用包被缓冲液将胃蛋白酶原 I单克隆抗体稀释至浓度为1~5 μ g/mL，将其吸附于微孔板上，再用固体洗液稀释液洗板两 次，采用封闭液对包被后的微孔板进行封闭和保护。
[0020] 所述包被缓冲液为碳酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液或TriS-HCl缓冲液。
[0021] 所述HRP标记的胃蛋白酶原I抗体的制备的步骤为：配制酶标抗体稀释液，用过 碘酸盐法将HRP标记在单克隆抗体上，经试验证明，胃蛋白酶原I酶标抗体的工作浓度范 围为50ng/mL以上。
[0022] 所述胃蛋白酶原I校准品的制备的步骤为：配制胃蛋白酶原I校准品稀释液，将 人工合成的胃蛋白酶原I用校准品稀释液稀释成含量分别为5yg/mL、20yg/mL、50yg/ mL、100 μ g/mL、200 μ g/mL的系列浓度，建立定量校准品。
[0023] 所述HRP标记胃蛋白酶原I抗体所用的酶标抗体稀释液的配方为： 去离子水 IL Na2HPO4 2.9g NaH2PO4 0. 2g NaCl 8. 2g 25%BSA IOg 酶稳定剂 Ig 0. 1%叠氮钠 ImL。
[0024] 本发明的技术方案：一种血清胃蛋白酶原I化学发光定量检测方法，基于化学发 光免疫分析法。胃蛋白酶原I单克隆抗体包被化学发光微孔板，形成固相抗体。检测时向 包被微孔中加入血清样品或胃蛋白酶原I校准品，再加入HRP标记的胃蛋白酶原I单克隆 抗体进行反应，形成抗体-抗原-抗体-HRP复合物。反应后用固体洗液稀释液洗去未结合 的HRP-胃蛋白酶原I单克隆抗体，然后加入发光底物，检测发光信号的强度。
[0025] 根据本发明的试剂盒，HRP标记的胃蛋白酶原I单克隆抗体与固相载体上包被的 抗体同被测样品中的胃蛋白酶原I形成"包被抗体-抗原-酶标抗体"的夹心复合物结构， 因此本发明采用的"双抗体夹心法"反应模式，既有效地利用抗原-抗体反应的高特异性， 又结合了化学发光免疫分析技术的高灵敏度，可为临床诊断提供更为特异、快速、可靠的依 据。
[0026] 根据本发明的试剂盒，反应模式为：微孔内先加入2〇μ?胃蛋白酶原I校准品或者 血清，然后加入5〇μ?的HRP标记的胃蛋白酶原I单克隆抗体，在微量振荡器上混合30s， 37°C温育lh，然后用固体洗液稀释液洗板5次，在吸水纸上轻轻拍干，加入发光底物A和B 各5〇μ?混勾5s，室温避光放置5分钟，用化学发光免疫分析仪检测发光值。
[0027] 根据本发明的试剂盒，对读取的发光值采取线性拟合方式进行处理，可选对对数 和四参数两种拟合方式计算样本中胃蛋白酶原I的含量。
[0028] 本发明的胃蛋白酶原I (PG I )化学发光定量检测试剂盒可以检测出血清中的胃 蛋白酶原I (PG I )含量。血清浓度PG可作为胃酸分泌的检测指标，在幽门螺杆菌阳性体 内，PG I水平和PG I /PG II比值与胃酸分泌量显著相关，其中后者与胃酸分泌量相关性更 强。在幽门螺杆菌阴性体内，PG I的水平与胃酸分泌量显著相关，但PG I /PG II比值与胃 酸分泌量无相关性。故通过血清PG浓度估计胃酸分泌量具有临床实用价值。PG含量还与 良、恶性胃溃疡的鉴别有关；血清PG I水平与萎缩性胃炎、消化性溃疡呈正相关；在幽门螺 杆菌的治疗中，通过监测除菌后的PG变化能够判定治疗效果。它具有无创、检测方法简单 快速、灵敏度高、检测范围宽等优点。同时该胃蛋白酶原I (PG I )化学发光定量检测试剂 盒的各项指标均已达到技术要求。
【附图说明】
[0029] 图1为实施例1所制备的试剂盒的校准品线性图。
【具体实施方式】
[0030] 实施例1应用碳酸盐包被缓冲液制备本发明的胃蛋白酶原I化学发光定量检测 试剂盒 一、PBST固体洗液及稀释液的配制： DPBST固体洗液配方为 KH2PO4 4.8g Na2HPO4* 12H20 28. 8g NaCl 155g Tween-20 IOmL ； 2)混合均匀后的PBST固体洗液在气压500Pa、温度10°C、湿度30%状态下减压低温干 燥，Ih后用铝箔袋分装，使用时每5g的PBST固体洗液溶解在500mL去离子水中混匀，制得 PBST固体洗液稀释液。
[0031] 二、包被微孔板的制备： 1) 抗体的选择：采用鼠源单克隆抗体； 2) 微孔板的包被：用0. 02mol/L的pH值为9. 6的碳酸盐缓冲液将胃蛋白酶原I单克 隆抗体稀释至浓度为5yg/mL