专利名称：化学发光法定量检测乙肝病毒Pre－S1试剂盒及其制备的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物物质的测试和分析方法及所用物质，尤其涉及生物物质的检测方法及其所用试剂盒，特别涉及生物物质的化学发光检测方法及其所用试剂盒。
背景技术：
乙型肝炎是一种流行广、难治愈的传染性疾病。作为乙肝病毒复制的标志物有HBeAg、Pre-S1、HBcAg、DNA多聚酶。由于HBcAg、DNA多聚酶的检测步骤繁琐，往往不便作为常规检测项目。HBeAg是临床上应用于了解病毒传染性以及病毒复制的一项常规指标，Pre-S1则正在逐渐成为常规检测的一项指标。
Pre-S1是HBV外膜蛋白中大蛋白的一部分，它含有肝细胞受体，在HBV感染细胞和机体免疫应答方面起重要作用。在病毒感染机体的整个周期中，其能够较充分的反应机体的病毒感染和体液免疫状况，直至病程的转归过程。在临床上出现HBeAg缺陷的HBV血清型中，检测Pre-S1能较为准确的检测病毒在机体内复制状况。
关于Pre-S1的现有知识以及应用，现有技术已有丰富的积累，如中国专利申请02159941公开了一种基因重组乙肝病毒表面抗原的基因修饰序列及其产物，中国专利申请01127973公开了一种抗乙型肝炎病毒Pre-S1抗原的人源单链抗体，中国专利申请00123612公开了一种高效表达乙肝表面S(主蛋白)和S1(大蛋白)融合抗原的转基因哺乳动物细胞系，中国专利ZL01113087公开了一种乙型肝炎DNA疫苗；美国专利US6004561，美国专利US6077691以及欧洲专利EP0637631则各公开了一种带乙肝病毒修饰Pre-S1抗原的多肽的高效表达。
技术的发展，提出了进行Pre-S1检测的现实需求，理由是首先，检测Pre-S1可以弥补和加强乙肝五项检测的不足1、Pre-S1出现在急性乙型肝炎感染的早期，在转氨酶升高前即可查出，提示可作为早期诊断乙肝病毒感染的指标。2、急性乙型肝炎患者Pre-S1阴转越早，预后越好，是病毒清除的最早迹象。反之，Pre-S1持续阳性，将发展至慢性肝炎，此指标比HBeAg阴转、HBsAb阳转指标提示要早。3、HbeAb阳性的慢性乙型肝炎患者约占慢性乙肝患者的30％-50％，提示乙肝病毒在机体内仍然继续复制，此类患者更容易演变为肝硬化或肝癌。检测Pre-S1，弥补了因HBeAg缺失造成的诊断和治疗困难。4、在HBV无症状携带者中，有一定比例的HbeAb阳性患者，Pre-S1阳性提示病毒在体内还较活跃。病毒并没有清除，肝脏还有潜在的病理损伤的可能。5、抗病毒治疗乙型肝炎时，检测Pre-S1指标可作为治疗前的患者筛查和治疗后的疗效判断依据，尤其对HbeAb阳性的慢性肝炎患者抗病毒治疗的排查也起到重要作用。
其次，现有常规的HbeAg检测不能替代Pre-S1的检测对于HbeAb(+)的HBV感染者，检测Pre-S1尤为重要。在中国近3千万人的慢性乙型肝炎患者中，其中约有30％左右的患者，抗HBe阳转后，病毒在体内继续复制，病情较重，其中部分可以演变为肝硬化或肝癌，自然好转率非常低。同样，HBeAb(+)的HBV无症状携带者也占有一定的比例。这一部分HBeAb(+)的慢性肝炎和HBV无症状携带者，往往是因为病毒基因变异所致，其所携带的HBV变异毒株大多数表现为在病毒基因组前C区末端1896位发生G-A点突变，产生一个新的终止密码子(TAG)，阻断了HBeAg的形成，导致在临床上出现HBeAg缺陷的HBV血清型，因此HBeAg的缺失，造成诊断和治疗的困难。此时，检测Pre-S1既能较为准确的检测病毒在机体内复制状况，又能诊断疾病的转归和了解是否携带HBV变异毒株。充分显示了Pre-S1的临床价值。所以抗HBeAb(+)的HBV感染者中，检测Pre-S1是非常必要的。
再则，现有的检测HBV-DNA不能替代检测Pre-S11、Pre-S1是乙型肝炎病毒(HBV)外膜蛋白中大蛋白的主要部分，它含有肝细胞受体，在HBV感染细胞和机体免疫应答方面起重要作用。在病毒感染机体的整个周期中，Pre-S1的独特功能，使其能够较充分的反应机体的体液免疫状况，直至病程的转归过程，如早期诊断，急性肝炎Pre-S1阴转是病毒清除的最早迹象，反之疾病将发展至慢性肝炎，这是单一测定HBV-DNA所不能做到的。2、免疫测定技术因其有效、直接、简便的特点，已经在临床诊断应用上占主导地位。Pre-S1的检测与基因测定HBV-DNA在治疗方面能够相互补充和加强，就像HBV-DNA不能替代乙肝五项的检测一样，同样HBV-DNA也不能替代Pre-S1的检测。3、HBV DNA-PCR技术要求精密、所需要的条件高，易发生污染和假阳性，不适于做常规检测，前S1抗原测定与之相互补充和加强，使结果特异，准确无误，进而提高临床大夫的诊断和治疗水平。
技术的发展，更进一步地提出了进行Pre-S1定量检测的现实需求，理由是乙肝病人的病理生理，决定于病毒与机体免疫状态，两者的相互作用使感染者表现为病毒携带者、黄疸性肝炎、无黄疸性肝炎、急性肝炎、慢性肝炎、重症肝炎。目前治疗肝炎尚无特效药，在肝炎的诊疗过程中，需要观察病情、判断预后、考核疗效、修订治疗方案，测定乙肝病毒复制增加或减少是必不可少的。
在乙肝病程中机体HBV的量会随着治疗与机体的免疫状况变化而变化，由于s区较c区保守，突变少，检测Pre-S1能准确的检测病毒在机体内复制状况，在病情好转、治疗有效、病毒复制减少时，Pre-S1减少或消失，反之则增加、持续存在。Pre-S1则随着HBV的量发生变化，HBV增加，Pre-S1增加；HBV减少，Pre-S1减少；HBV消失，Pre-S1消失。Pre-S1的变化趋势向临床医生提供了治疗是否有效、是否需要修改治疗方案等的重要信息，测定变化趋势是以定量为基础的，准确定量就可以及时捕捉HBV复制变化的信息。
免疫学检测技术是感染病原检测的首选方法，简便快速，准确率也较高。免疫学实验的原理很简单，外来致病微生物的特异性蛋白为抗原，人体针对这种抗原的特异性免疫球蛋白为抗体。抗原抗体在体内会发生对应的免疫反应。实验室可以用严格的实验条件，在体外模拟这种免疫反应。如果抗原抗体中一种是已知的，就可以检测另一种是否存在。在体外用乙型肝炎病毒特异抗体检测病人血清，如果发生了免疫反应，便可以通过指示反应指示出来，最终说明病人受到了乙肝病毒感染。
免疫标记技术检测方法是指用酶、化学(或生物)发光剂、荧光素、放射性核素、铁蛋白及胶体金等作为示踪物，对抗体或抗原标记后进行的抗原抗体反应，藉助于酶标检测仪、发光测定仪、荧光显微镜、射线测量仪等精密仪器，对实验结果进行观察或进行自动化测定，可用于测定蛋白质、激素、抗生素、药物、病原体等多种抗原和抗体。常用的固相免疫检测方法有酶标记免疫检测方法、化学发光检测方法和时间分辨荧光免疫分析法等。
一方面，针对Pre-S1的酶标记免疫检测方法，现有技术已有所体现，如中国专利申请02157663公开了一种乙肝病毒前S1抗原酶联免疫测定试剂盒及制备方法，这是一种定性的方法。中国专利申请02151727公开了一种定量法乙肝病毒前S1抗原酶联免疫测定试剂盒及制备方法。这项专利采用酶联免疫测定方法，灵敏度低，线性范围窄，Pre-S1高浓度时需要进行多管稀释，增加了操作误差所带来的定量不准确及操作的复杂程度。在基因工程制备抗原，提示用到21-47aa和1-199aa两种片段。在关于定量所用的标准品的说明中，是通过测量乙肝病毒的DNA含量来标定，而实际上Pre-S1抗原为蛋白，由于机体的免疫反应和试剂盒中抗原与抗体反应的差异，用定量的HBV DNA做标准品来测定蛋白误差会较大。再，该技术实现过程用到有高传染性的物质，有出现生物制品事故的隐患。
另一方面，由于化学发光试剂已广泛应用于甲状腺功能、垂体功能、肿瘤标志物、过敏原、骨代谢、心脏病、药物代谢等临床指标多种测定，是目前放射免疫诊断试剂的换代产品。
可见，如何把化学发光检测方法应用于乙肝病毒复制的标志物Pre-S1，尤其是定量检测，并基于这种方法制备出常规试剂来判断乙肝病人病情、了解预后、考核治疗效果，使更广大的患者受益，现有技术并没有提供现成的解决方案。
发明内容
本发明的目的是在现有技术的基础上，提高检测的灵敏度、线性范围和定量的准确性，并提高检测效率。
本发明实现以上目的所采用的具体技术方案包括，生产制造一种化学发光法定量检测乙肝病毒Pre-S1试剂盒，包括用Pre-S1抗体预包被的板/条，标记结合物，化学发光底物以及至少六种含量不同的作为定量标尺的Pre-S1的重组表达抗原标准试剂。
所述标记结合物指用发光剂、辣根过氧化酶或碱性磷酸酶所标记的Pre-S1抗体结合物。
当所述标记结合物指碱性磷酸酶标记的Pre-S1抗体结合物时，所述化学发光底物是单组分含发光剂的溶液；当所述标记结合物指发光剂标记的Pre-S1抗体结合物时，所述化学发光底物是单组分含H2O2的碱性溶液；当所述标记结合物指辣根过氧化酶标记了的Pre-S1抗体结合物时，所述化学发光底物是双组分含H2O2的组分A和含发光剂的组分B。
所述Pre-S1的重组表达抗原标准试剂为基因工程表达的Pre-S1蛋白纯品。
所述至少六种含量不同的作为定量标尺的Pre-S1的抗原标准试剂中，包括0浓度值和线性范围高值，其它不同含量为线性范围近等分值。
所述线性范围高值指Pre-S1抗原含量为500-2000ng/ml。
本发明实现以上目的所采用的具体技术方案还包括，提出一种化学发光法定量检测乙肝病毒Pre-S1试剂盒的制备方法，包括以下步骤采用重组Pre-S1 11-119aa制备Pre-S1的抗原；采用所述Pre-S1抗原制备Pre-S1包被抗体或标记抗体；并采用所述Pre-S1抗原制备Pre-S1的重组表达抗原标准试剂。
所述Pre-S1的重组表达抗原标准试剂为基因工程表达的Pre-S1蛋白纯品。
所述制备Pre-S1的重组表达抗原标准试剂的步骤中，设置至少六种含量不同的定量标尺，包括0浓度值和线性范围高值，其它不同含量为线性范围近等分值。
所述线性范围高值指Pre-S1的重组表达抗原含量为500-2000ng/ml。
同现有技术相比，采用本发明的化学发光法定量检测乙肝病毒PRE-S1试剂盒及其制备方法，可提高检测的灵敏度、线性范围和定量的准确性，并可提高检测效率。
发明内容
图1为本发明的化学发光法定量检测乙肝病毒Pre-S1试剂盒的制备过程示意图。
具体实施例方式
以下结合附图对本发明予以详尽说明。
本发明所用的化学发光免疫检测法定量检测乙肝病毒Pre-S1抗原的反应原理是采用双抗体夹心法，将抗Pre-S1包被抗体包被于反应板上，加入标本，标本中的Pre-S1抗原与相应的抗体反应，洗去游离部分，加入标记抗体，与Pre-S1抗原反应后，分离未反应的标记物，加入底物，底物与发光剂反应或酶作用于底物，产生光化学反应，产生的光子与被测物呈线性正相关，光子被仪器采集测定后，数据自动生成并处理。
化学发光免疫测定(CLIA)是测定技术继酶联免疫测定、放射免疫测定、荧光免疫测定、时间分辨免疫荧光测定之后发展的一项新兴测定技术，具有荧光的特异性，不需要激发光，没有放射免疫测定那样存在强烈的环境污染和健康危害，凡具有抗原性的物质都可用CLIA，试剂稳定，操作简单，无放射污染，为当今最为敏感的微量免疫测定法。
化学发光免疫测定线性范围宽，可达7个数量级，仪器测定范围大，测定Pre-S1时无需将标本稀释，是一种优秀的定量分析方法。
Pre-S1多肽上有多个抗原决定簇，若仅用21-47氨基酸单个位点的合成短肽或表达的串联短肽抗原制备的抗体，则抗体只能与抗原上较少位点结合，在基因突变时，某一抗原决定簇结构发生改变，作为包被的抗体就不能识别，导致漏检造成假阴性。我们产品中的Pre-S1采用11-119aa Pre-S1克隆抗原，既包含了Pre-S1全段的抗原位点又利于高表达，用其制备的多克隆抗体，提高了试剂的灵敏度，减少了假阴性的发生。
本发明的化学发光法定量检测乙肝病毒Pre-S1试剂盒及其制备的技术路线是克隆Pre-S1基因(HBV2881-3204)，用带有6-His的表达载体表达Pre-S1蛋白，Ni-亲和柱纯化，免疫动物制备多抗和单抗，DE-52离子交换柱纯化，检测。制备预包被板、标记结合物，标准品，化学发光底物后，进行产品组装。
制备Pre-S1的重组表达抗原标准试剂的步骤中线性范围高值确定的理论依据用酶联免疫方法测定Pre-S1时，由于抗体选择模式及试剂反应选择模式不同，线性范围会有所不同，为0.05-0.1ng---50-100ng/ml，化学发光免疫检测法线性范围较酶联免疫方法提高10倍以上，因此线性范围高值500-2000ng/ml。
1、制备Pre-S1多抗或单抗1.1、制备Pre-S1多抗合成Pre-S1基因片断的引物--＞克隆Pre-S1基因(HBV2881-3204)--＞测序--＞酶切--＞与表达载体连接--＞转化原核细胞--＞选择克隆--＞酶切及测序鉴定--＞原核表达Pre-S1--＞纯化Pre-S1--＞加福氏完全佐剂免疫兔--＞4周左右抽血测效价--＞纯化的Pre-S1加福氏不完全佐剂加强免疫1-3次--＞检测--＞抽血--＞离心制备多抗血清--＞硫酸胺沉淀后用离子交换层析纯化多抗。
1.2、制备Pre-S1单抗纯化Pre-S1--＞加福氏完全佐剂免疫Balb/C小鼠→阳性鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合→筛选阳性克隆→鉴定→细胞株保存、复苏、培养→打腹水→硫酸胺沉淀后用离子交换层析纯化。
2、制备预包被板检测Pre-S1多抗或单抗做包被--＞加入包被液--＞加入反应板--＞4度过夜--＞拍干--＞加入蛋白稳定液--＞4度过夜--＞拍干--＞干燥--＞装袋3、制备酶标记物检测纯化的Pre-S1单抗或多抗或HbsAg单抗→与辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶或发光标记物偶联→检测标记抗体--＞加入相应稀释液和蛋白稳定液--＞检测--＞分装3、制备标准品检测Pre-S1--＞定量--＞加入基质液及稳定剂--＞检测--＞分装4、发光底物碱性磷酸酶为单组分，辣根过氧化物酶为双组分购买进口的发光底物或自行配制底物，检测--＞分装本发明试剂盒产品结构检测试剂的人份数48或96人份预包被板 1块，结合物 1瓶，标准品 1套6瓶或8瓶清洗液 1瓶化学发光底物 1瓶或2瓶密封袋 1个干燥剂 1包说明书 1份5、抗体选择模式包被抗体是抗Pre-S1单抗，则标记结合物抗体是抗Pre-S1多抗或抗HbsAg单抗，包被抗体是抗Pre-S1多抗，则标记结合物抗体是抗Pre-S1单抗或抗HbsAg单抗。
6、试剂反应选择模式A.一步法样品或标准品加样50ul/孔，标记抗体加样50ul/孔，混匀，37℃温育20-60分钟。
B.二步法样品或标准品加样100ul/孔，37℃温育20-60分钟，标记抗体加样100ul/孔，混匀，37℃温育20-60分钟。
实施例一Pre-S1抗原制备Pre-S1 11-119aa基因序列atggggacaa atcttgctgt ccccaatccc ctgggattct tccccgatca tcagttggac2941 cctgcattca aagccaactc agacaatcca gattgggacc tcaacacgca caaggactac3001 tggccggacg catggaaggt gggagtggga gcattcgggc cagggttcac ccctccccat3061 gggggactgt tggggtggag ccctcaggct cagggcctac tcacaactgt gccagcagct3121 cctcctcctg cctccaccaa tcggcagtca ggaaggcagc ctactccctt atctccacct
3181 ctaagagaca ctcatccaca ggcc1、扩增带有EcoR I和BamH I酶切位点的Pre-S1基因片段50ul反应体积，HBV阳性(大三阳)血清煮10分钟，吸1ul做模板，P1、P2引物各0.5umol/L(R5’-CG GAA TTC ATGGGG ACA AAT CTT GCT-3’L5’-AAA GGA TTC GGC CTG AGG ATG ACT GT-3’)，Taq DNA聚合酶1U，10mmol/L dNTP贮备液(dATP、dCTP、dGTP、dTTP各10mmol/L)，PCR缓冲液(50mmol KCl、4mmol/L MgCl2、10mmol/L Tris-HCl、pH8.5)，加入H2O至50ul反应体积，加入50μl石蜡油，将反应管置PCR扩增仪上，95℃变性1min，循环参数为95℃45s，60℃45s，72℃45s循环30次，最后72℃延伸2min。
2、酶切基因片段和酶切PrsetA0.2ug纯化的Pre-S1基因片段，2u EcoR I和2u BamH I，1ul 10x缓冲液，10ul反应体积，37℃10min。B0.5ug pRSET载体，2u EcoR I和2u BamHI，1ul 10x缓冲液，10ul反应体积，37℃10min。
3、酶切基因片段与pRSET载体连接，1u T4DNA连接酶，1ul 10x连接缓冲液，0.1ug酶切基因片段+1/2摩尔的酶切pRSET载体，16℃12hr。
4、转化感受态细菌，表达Pre-S1蛋白及纯化见Invitrogen Corporation的Xpress SystemProtein Expression pRSET和Protein Purification。
实施例二制备抗体过程，参见现代免疫学实验技术(ISBN 7-532-2093-2)，P25-53。
多抗制备纯化的Pre-S1 2mg加生理盐水1ml，加等量的福氏完全佐剂免疫新西兰兔，背部及后腿肌肉、皮下多点注射，4周左右抽血测效价，纯化的Pre-S1加福氏不完全佐剂按前述方法加强免疫1-3次，抽血测效价，抽血，离心制备多抗血清，30％饱和硫酸胺沉淀，用DE52离子交换层析纯化多抗。
单抗制备纯化的Pre-S1抗原，免疫Balb/C小鼠；培养Sp2-0骨髓瘤细胞，制备悬液细胞。制备小鼠脾细胞悬液，与骨髓瘤细胞混合，PEG融合，接种于饲养细胞孔中，HAT选择培养，分装于培养板中37℃，5％CO2温箱过夜，筛选，阳性孔细胞克隆、培养与克隆的筛选，阳性细胞冻存。阳性克隆的培养与再克隆，冻存，获得稳定分泌McAb的杂交瘤细胞株，冻存，检查杂交瘤细胞稳定性。杂交瘤培养上清或诱生腹水，饱和硫酸胺沉淀，用离子交换层析纯化。
实施例三鲁米诺标记抗体底物为含0.05％H2O2、PH10的0.2M NaOH辣根过氧化酶或碱性磷酸酶所标记抗体发光底物的选择购买Pierce或Amasham公司的化学发光底物。辣根过氧化酶发光底物也可自行制备，鲁米诺4mg溶解于DMSO 1ml，p-Iodophenol 1mg溶解于DMSO 1ml，1M Tris-Hcl，PH7.5，0.6ml，30％H2O25ul，H2O 7.5ml。
实施例四标记物的制备参见现代免疫学实验技术(ISBN 7-532-2093-2)，操作步骤1、辣根过氧化物酶标记抗体的制备有过碘酸钠法和戊二醛交联法，以过碘酸钠法为例取5mgHRP溶于1ml 0.3mol/L，PH8.1NaHCO3，加入1％DNFB无水乙醇溶液0.1ml，室温下轻微搅拌作用1h；加1ml 0.06mol/L NaIO4，室温下避光轻搅30min，溶液呈黄绿色；加1ml0.16mol/L乙二醇，室温下轻搅1h，终止氧化反应；装入透析袋，对0.01mol/L，pH9.5碳酸盐缓冲液1000ml，4℃透析过夜，换液3次；于3ml醛化HRP溶液中加入含5mg IgG的碳酸盐缓冲液1ml，室温避光轻搅下结合2～3h；加入5mg NaHB4，放4℃3h或过夜(亦可加0.2ml2mol/L，pH9.5乙醇胺，4℃度放置7h)；装入透析袋，对0.01mol/L，pH7.2PBS，4℃透析24h，换液3次；3000r/min离心30min，除去沉淀物。上清液通过Sephadex G-200凝胶柱层析，PBS洗脱。最后在结合物内加入BSA至蛋白浓度为10mg/ml。小量分装，低温保存备用。
2、碱性磷酸酶(AP)标记抗体的制备取抗体IgG(2～5mg/ml)1ml，加入AP5mg溶解。装入透析袋，用0.01mol/l，pH7.2PBS 4℃透析18h，换液3次；加入2.5％戊二醛20ul，室温放置2h。4℃对PBS透析过夜，换液3次；再移入0.05mol/L，pH8.0Tris-HCL缓冲液中，4℃透析过夜，换液3次；取出标记抗体，用含1％BSA和0.02％NaN3的Tris-HCL缓冲液稀释至4ml，即为酶标记物原液。加入1/3甘油，小量(0.1ml)分装。
3、发光剂标记抗体，发光剂可选择鲁米诺及其衍生物、吖啶酯类等，以鲁米诺标记为例。
按IgG、鲁米诺和NaNO2，进行重氮化反应。另将IgG溶于0.1mol/L的碳酸盐(pH9.5)缓冲液1ml中，冷却后，再将重氮化试剂加入到IgG溶液中，每次加5ul，边加边用1mol/L K2CO3调节pH值至9.5，共加65ul，置冰箱(4℃)过夜。次日用40mmol/L硼酸缓冲液淋洗、自动分部收集，每份测280nm及347nm波长的光密度，同时取少量测发光强度。以E347＝7100计算发光强度高峰管的鲁米诺含量，以E280＝13计算IgG含量，收集高峰部分于-30℃保存备用。
吖啶脂类标记可采用N-羟基琥珀酰亚胺活化法。
实施例五试剂盒配制1、包被板包被抗体0.1-10ug/ml加入PH9.0-9.5的碳酸盐缓冲液中，在微孔板中每孔加入100ul，4℃过夜甩去，再加入100ul/孔的1-3％BSA的PBS室温封闭4小时，甩干，37℃干燥；2、标记物(以辣根过氧化物酶标记抗体为例)标记抗体以合适的浓度加入稀释液中。稀释液配制，25％小牛血清的PBS加入0.05％T-20，0.02％硫柳汞；3、标准品Pre-S1表达蛋白每个按终浓度0，50pg，500pg，5ng，50ng，500ng，1000ng/ml加入1％BSA的PBS中稀释配制，加入0.02％硫柳汞，分装；4、底物Amasham公司的化学发光底物，组分1和2分装；5、浓缩洗涤液10xTris_HCl加5％T-20。
实施例六试剂盒使用1、取所需量的板条，每孔加入50ul样品或标准品，50ul标记抗体，混匀，37℃温育30分钟；2、洗板，甩去板中液体，加入工作洗涤液300ul/孔，放置20秒甩去；如此共洗五遍。
3、加底物，50ul/孔发光底物A，50ul/孔发光底物B，混匀后测定。
以上所述之最佳实施例意在具体说明本发明的思路采用化学发光法多标准含量试剂进行Pre-S1测量。本发明之实施，并不限于以上最佳实施例所公开的方式，凡基于本发明之设计思路，进行简单推演与替换，都属于本发明之实施。
权利要求
1.一种化学发光法定量检测乙肝病毒Pre-S1试剂盒，其特征在于，包括用Pre-S1抗体预包被的板/条，标记结合物，化学发光底物以及至少六种含量不同的作为定量标尺的Pre-S1的重组表达抗原标准试剂。
2.如权利要求1所述的化学发光法定量检测乙肝病毒Pre-S1试剂盒，其特征在于所述标记结合物指用发光剂、辣根过氧化酶或碱性磷酸酶标记的Pre-S1抗体结合物。
3.如权利要求2所述的化学发光法定量检测乙肝病毒Pre-S1试剂盒，其特征在于当所述标记结合物指碱性磷酸酶标记的Pre-S1抗体结合物时，所述化学发光底物是单组分含发光剂的溶液；当所述标记结合物指发光剂标记的Pre-S1抗体结合物时，所述化学发光底物是单组分含H2O2的碱性溶液；当所述标记结合物指辣根过氧化酶标记了的Pre-S1抗体结合物时，所述化学发光底物是双组分含H2O2的组分A和含发光剂的组分B。
4.如权利要求1所述的化学发光法定量检测乙肝病毒Pre-S1试剂盒，其特征在于所述Pre-S1的重组表达抗原标准试剂为基因工程表达的Pre-S1蛋白纯品。
5.如权利要求4所述的化学发光法定量检测乙肝病毒Pre-S1试剂盒，其特征在于所述至少六种含量不同的作为定量标尺的Pre-S1的抗原标准试剂中，包括O浓度值和线性范围高值，其它不同含量为线性范围近等分值。
6.如权利要求5所述的化学发光法定量检测乙肝病毒Pre-S1试剂盒，其特征在于所述线性范围高值指Pre-S1抗原含量为500-2000ng/ml。
7.如权利要求1所述的化学发光法定量检测乙肝病毒Pre-S1试剂盒的制备，其特征在于，包括以下步骤采用重组Pre-S1 11-119aa制备Pre-S1的抗原；采用所述Pre-S1抗原制备Pre-S1包被抗体或标记抗体；并采用所述Pre-S1抗原制备Pre-S1的重组表达抗原标准试剂。
8.如权利要求7所述的化学发光法定量检测乙肝病毒Pre-S1试剂盒的制备，其特征在于所述Pre-S1的重组表达抗原标准试剂为基因工程表达的Pre-S1蛋白纯品。
9.如权利要求8所述的化学发光法定量检测乙肝病毒Pre-S1试剂盒的制备，其特征在于所述制备Pre-S1的重组表达抗原标准试剂的步骤中，设置至少六种含量不同的定量标尺，包括0浓度值和线性范围高值，其它不同含量为线性范围近等分值。
10.如权利要求9所述的化学发光法定量检测乙肝病毒Pre-S1试剂盒的制备，其特征在于所述线性范围高值指Pre-S1的重组表达抗原含量为500-2000ng/ml。
全文摘要
一种化学发光法定量检测乙肝病毒Pre－S1试剂盒，包括用Pre－S1抗体预包被的板/条，标记结合物，化学发光底物以及至少六种含量不同的作为定量标尺的Pre－S1重组表达抗原标准试剂。所述抗原标准试剂为基因工程表达的Pre－S1蛋白纯品，而作为定量标尺的Pre－S1抗原标准试剂中，包括0浓度值和线性范围高值，其它不同含量为线性范围近等分值。所述试剂盒的制备方法，包括以下步骤采用重组Pre－S1 11－119aa制备Pre－S1的抗原；采用所述Pre－S1抗原制备Pre－S1包被抗体或标记抗体；并采用所述Pre－S1抗原制备Pre－S1抗原标准试剂。采用本试剂盒及其制备方法，可提高检测的灵敏度、线性范围和定量的准确性，并可提高检测效率。
文档编号G01N33/543GK1828302SQ20051003341
公开日2006年9月6日 申请日期2005年3月1日 优先权日2005年3月1日
发明者曹雯雯, 梁培华, 丁野青, 杜纲国, 魏球英 申请人:深圳依诺金生物科技有限公司