专利名称：糖链抗原242化学发光定量检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于体外临床检验和化学发光免疫法技术领域，具体涉及一种用于糖链抗 原对2(0々242)化学发光定量检测试剂盒及相关制备方法和使用方式。
背景技术：
糖链抗原242 (carbohydrate antigen 242，CA242)于 1985 年经单克隆抗体 C242 筛选而得。1983年Limdholm等人用结、直肠癌细胞C0LD205免疫小鼠得到系列抗体，以后 相继发现了与这些抗体相应的系列抗原，包括CA 19-9, CA 50, CA 125, CA 242等。这一系 列抗原的决定簇均为糖链结构，且出现于同种粘蛋白表面，但又有不同的肿瘤特异性，故可 作为不同的肿瘤标志物。CA242是一种唾液酸化的糖蛋白，在健康人和良性疾病血清中含量 很低，消化道恶性肿瘤时，血清CA 242出现升高。目前胰腺癌的治疗和预后均不理想，临床确诊的病人往往已处于进展期，因此早 期诊断非常重要，现阶段用于胰腺癌诊断的肿瘤标志物主要是CA 19-9、CA 50XA 2420经 临床应用，前两者均有较好的灵敏度，但特异性不高，即两者均易受肝功能及胆汁郁积的影 响，导致在良性阻塞性黄疸及肝实质损害性疾病时出现假阳性。CA 242是胰腺癌病人中首 先出现的一种与肿瘤相关抗原，多数报告认为它与CA 19-9、CA 50具有相当或稍低的灵敏 度，但更特异，即在良性肝胆疾病和胰腺炎时，血清CA 242水平很少或仅轻微升高，其出现 的假阳性率明显低于CA 19-9，CA 50。在结、直肠癌的诊断中，目前应用最多的肿瘤标志物是CEA，但其在疾病早期灵敏 度太低。有报道通过对术前结、直肠癌病例的回顾性诊断，发现CA 242和CEA的联合检测， 灵敏度比单用CEA提高25% 50% ；在术后结、直肠癌监测中，CA 242与CEA联用对癌症 复发的诊断率是88%。CA 242水平的改变通常可证实CEA的升高，某些病例中，CA 242的 升高早于CEA的升高及临床复发症状的出现。故CA 242与CEA联用于结、直肠癌的诊断及 术后监测有较高的价值。化学发光免疫分析(Chemiluminescence Immunoassay, CLIA)于 1977 年问世， 1985年第一代化学发光免疫试剂盒研制成功并投放市场。上世纪70年代中期Arakawe首 次报道用发光信号进行酶免疫分析，利用发光的化学反应分析超微量物质，特别是用于临 床免疫分析中检验超微量活性物质。目前，这一技术已从实验室的稀有技术过渡到临床医 学的常规检测手段。化学发光免疫分析是将化学发光或生物发光体系与免疫反应相结合， 用于检测微量抗原或抗体的一种新型标记免疫测定技术。其检测原理与放射免疫(RIA)和 酶免疫(EIA)相似，不同之处是以发光物质作为底物，并藉助其自身的发光强度直接进行 测定。化学发光标记免疫分析是用化学发光剂直接标记抗原或抗体的免疫分析方法。常 用于标记的化学发光物质有吖啶酯类化合物一acridinium ester (AE)，是有效的发光标记 物，其通过起动发光试剂(NaOH-H2O2)作用而发光，强烈的直接发光在一秒钟内完成，为快 速的闪烁发光。还有以三联吡啶钌(Ru(byp)32+)标记物为发光底物，用另一反应物三丙胺(TPA)来激发光反应，在电极表面反复进行氧化还原反应从而产生高效稳定连续发光的电 化学发光免疫分析。这些免疫分析方法都需要高精度复杂的自动测量仪器，目前在国内还 难以实现。化学发光酶免疫分析是以酶标记生物活性物质(如酶标记的抗原或抗体)进行免 疫反应，免疫反应复合物上的酶再作用于发光底物，在信号试剂作用下发光，用发光信号测 定仪进行发光测定。目前常用的标记酶为辣根过氧化物酶(HRP)和碱性磷酸酶(ALP)，它们 有各自的发光底物。HRP常用的底物为鲁米诺(3-氨基邻苯二甲酰胼，luminol)或其衍生 物如异鲁米诺(4-氨基邻苯二甲酰胼)等，鲁米诺的氧化反应在碱性缓冲液中进行，在过氧 化物酶及活性氧的存在下，生成激发态中间体，当其回到基态时发光，其波长为425nm。发光 强度依赖于酶免疫反应物中酶的浓度。如果不使用增强剂，鲁米诺体系的发光基本上为闪 光型且信号弱，通过加入某些特殊的增强剂可增强发光的信号并可大大延长发光的持续时 间。化学发光免疫分析既具有放射免疫的高灵敏度(检测限度可达10_15 10_18mol/ L)，又具有酶联免疫的操作简便、快速的特点，易于标准化操作，且测试中不使用有害的试 剂。试剂保持期长，应用于生物学、医学研究和临床实验诊断工作，成为非放射性免疫分析 法中最有前途的方法之一。但是，国外的自动化学发光酶免疫分析仪及与之相匹配的试剂 盒多采用封闭体系配合使用，价格昂贵，操作复杂，在国内不易推广。
发明内容
本发明将化学发光技术与免疫分析技术相结合，提供了一种能够定量检测CA 242 的试剂盒。本发明技术方案如下一种糖链抗原242化学发光定量检测试剂盒，包括反应板，酶结合物，发光底物， 校准品，质控品，浓缩洗涤液，所述的反应板包被有糖链抗原242抗体。所述的校准品以糖链抗原242纯品配制，浓度优选为0、15、50、100、150、200U/ml。所述的质控品以糖链抗原242纯品配制，由质控品I和质控品II两部分组成，质 控品I的浓度为3-95U/ml，质控品II的浓度为105_195U/ml。所述的质控品I的浓度优选为16. 1 U/ml，质控品II的浓度优选为150. 9U/ml。所述的酶结合物为HRP标记的糖链抗原242抗体，所述的反应板材质是不透明的 聚苯乙烯或聚乙烯，所述的发光底物为鲁米诺、异鲁米诺或其衍生物，所述的浓缩洗涤液是 pH7. 0-pH8. 0的中性缓冲液。本发明提供的试剂盒具有开放性系统，可以应用于多种不同公司的化学发光检测 仪器，无需昂贵的专用配套仪器，并具有简便，快速，稳定的检测能力，易于在国内市场推
具体实施例方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本 发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照 常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New York =Cold Spring HarborLaboratoryPress, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1 :CA 242化学发光定量检测试剂盒的制备(1)抗CA 242的抗体包被板制备a.包被取 lmol/L Na2HPO4 77. 4ml 和 lmol/L NaH2PO4 22. 6ml 混勻，加入去离 子水定容至IOOOml即成10倍包被液，临用前稀释十倍，加入适量CA 242单抗(购买自 Fujirebio)混勻，然后加入到微孔板板孔中，100 μ 1/孔，4°C 16小时；b.封闭弃去包被液，在吸水纸纸上拍干，加入含有3% BSA和0.05%防腐剂 (Procl in 300)的磷酸盐缓冲液(pH 7. 4), 200 μ 1/ 孔，37°C 2 小时；c.封袋弃去封闭液，在吸水纸上拍干，室温下于真空干燥箱中抽5小时，立即进 行真空封袋，检查有无漏气，如有重新封袋，贴上标签后于2-8°C保存。(2)酶标记物的制备用含有2. 5% BSA、1. 5%的脱脂奶粉和0. 05%防腐剂(Proclin 300)的磷酸盐 缓冲液(pH 7.4)配制缓冲系统。CA 242抗体(购买自Fujirebio)用过碘酸盐氧化法与辣根过氧化物酶交联。(3) CA 242校准品的制备用含有3% BSA和0. 05%防腐剂(Proclin 300)的磷酸盐缓冲液(pH 7. 4)配制 缓冲系统。用CA 242纯品配制校准品工作液(CA 242纯品购买自Fujirebio)，分别为0、15、 50、100、150、200U/ml 6 个工作浓度。(4) CA 242质控品的制备小牛血清与去离子水6 4混合，并添加0. 05%防腐剂(Proclin 300)，配制成 质控品缓冲液。用CA 242纯品制备质控品工作液(CA 242纯品购买自Fujirebio)分装16. 1、 150.9U/ml。(5)化学发光底物液的制备使用 PIERCE 公司的SuperSignal ELISA Femto Maximum Sensitivity Substrate 作为配套检测液。A液、B液各1瓶。(6) 20 X浓缩洗涤液制备取NaCl 170g吐温-20 IOml加水定容至IL即成，临用前稀释20倍。(7)半成品及成品组成上述步骤所得产品分装后即为半成品。抽检合格后组装成试剂盒成品，成品还需 抽检，合格后才能出厂。实施例2 =CA 242化学发光定量检测试剂盒的使用方法1.试剂和样本准备(1)试剂准备a.将试剂盒置室温(1846°C )平衡20分钟。b.从试剂盒中取出浓缩洗涤液，用新鲜的纯化水1 20稀释后加入洗板机的洗液 瓶中。(2)样本准备
使用前将待测的合格血清或血浆置室温(1846°C )平衡20分钟。2.操作步骤a.取出所需的CA 242抗体包被微孔板置于微孔架上b.加入校准品1-6、质控品1、2和待测样本，每孔25 μ 1。c.加入酶标记物100 μ 1/孔。d.轻柔震荡混勻。e.室温孵育120分钟。f.弃去孔内废液。手工洗涤弃去孔内液体，洗涤液注满各孔、静置5秒，甩干，重复5次后拍干；洗板机洗涤每孔350 μ 1，重复4次，洗涤后拍干。g.加发光底物A、B每孔各50μ 1，充分混勻，立刻加入化学发光仪中检测信号值。3.实验结果的计算可以采用作图法或计算法进行结果计算作图法以标准品抗原含量的Ig值为横坐标⑴，以其对应的信号值为纵坐标⑴ 绘制出标准曲线，然后根据检测样本测得的信号值在标准曲线上查出相应的抗原含量Ig 值，再计算出抗原含量。计算法以标准品抗原含量的Ig值为自变量(X)，以其对应的信号值为因变量 (Y)，求出回归方程，将待测标本的信号值带入回归方程，求得相应的抗原含量。
权利要求
1.一种糖链抗原242化学发光定量检测试剂盒，其特征在于，包括反应板，酶结合物， 发光底物，校准品，质控品，浓缩洗涤液，所述的反应板包被有糖链抗原242抗体。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的校准品以糖链抗原242纯品配制， 浓度为 0、15、50、100、150、200U/ml。
3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的质控品以糖链抗原242纯品配 制，由质控品I和质控品II两部分组成，质控品I的浓度为3-95U/ml，质控品II的浓度为 105-195U/mlo
4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述的质控品I的浓度为16.lU/ml，质控 品II的浓度为150. 9U/ml。
5.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的酶结合物为HRP标记的糖链抗原 242抗体，所述的反应板材质是不透明的聚苯乙烯或聚乙烯，所述的发光底物为鲁米诺、异 鲁米诺或其衍生物，所述的浓缩洗涤液是pH7. 0-pH8. 0的中性缓冲液。
全文摘要
本发明公开了一种糖链抗原242化学发光定量检测试剂盒，该试剂盒包括糖链抗原242检测反应板，反应板包被有糖链抗原242抗体。糖链抗原242定量检测试剂盒，还包括酶结合物，发光底物，校准品，质控品，浓缩洗涤液。本发明可以专一的定量检测出病人血清糖链抗原242的含量，用于辅助诊断胰腺癌等消化道恶性肿瘤及其预后和疗效监测。与传统的ELISA技术相比，本发明不仅保留了ELISA技术的高度特异性，检测结果的稳定性、可靠性和操作的简便性，同时采用的化学发光法能提高检测的灵敏度。
文档编号G01N21/76GK102095846SQ200910200390
公开日2011年6月15日 申请日期2009年12月11日 优先权日2009年12月11日
发明者汪宁梅, 王通, 穆宇豪, 穆海东 申请人:上海裕隆生物科技有限公司