专利名称：可视化检测抗原抗体反应的方法、试剂盒及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于免疫分析和诊断技术领域。具体地，本发明涉及对抗体标记信号放大的方法，特别是采用一种表面功能化的金纳米粒子，可以通过检测抗体标记物，直接用肉眼来判断抗原抗体反应。
背景技术：
在对某些抗原或特异性蛋白进行检测时，通常会应用到免疫标记技术。免疫标记技术是将一些既容易测定又具有高敏感性的物质标记到特异性抗原或者抗体分子上，通过这些标记物的增强放大作用来显示反应体系中抗原或者抗体的性质和含量。目前常用的标记物包括荧光素，酶和放射性核素等。但在实际应用中，这三大免疫标记技术都存在不同缺陷。例如在荧光素标记技术中，荧光素存在荧光寿命和荧光效率的问题，且标记到抗原或抗体上的方法复杂；酶标记技术中，酶容易失活，从而影响待测物的检出限；放射性核素标记技术中，核素具有放射性，存在强烈的环境污染和健康危害。此外，采用以上三种方法在对某些抗原或特异性蛋白进行检测时，在读出方式上需要借助各类仪器才能进行。其中，荧光素标记技术需要荧光显微镜，酶标技术需要酶标仪，放射性核素技术需要自动计数器等探测仪器，对仪器的依赖决定了很多检测不能在条件落后及不发达地区开展。因此，现在存在对操作简单、反应体系稳定、便于开展、对环境无污染以及对人体无危害的免疫标记和检测技术的需求。目前，纳米技术是当前的热门研究领域，其中金纳米粒子由于其表面等离子共振效应而显示独特的颜色，被广泛应用于可视化检测。Mirkin小组首次报道了用表面功能化的金纳米粒子通过比色的方法检测DNA (参考文献Mirkin，C. Α.，Letsinger，R. L.，Mucic， R. C.，Storhoff，J. J. Nature, 1996，382，607-609)。蒋兴宇小组报道了通过合成功能化金纳米粒子，利用click反应来检测溶液中的铜离子(参考文献Yang Zhou, Shixing Wang，Ke Zhang, XingyuJiang*. Angew. Chem. Int. Ed. 2008,47,7454-7456)。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种可视化检测抗原抗体反应的方法，该方法采用表面功能化的金纳米粒子，实现对抗体标记物、尤其是对标记物氧化铜纳米颗粒的检测，进而实现对抗原抗体反应的检测。本发明的另一个目的是提供所述方法的应用。本发明的又一个目的是提供一种用于可视化检测抗原抗体反应的试剂盒。本发明的再一个目的是提供所述试剂盒的应用。用于实现上述目的的技术方案如下一方面，本发明提供一种可视化检测抗原抗体反应的方法，该方法包括以下步骤1)抗原抗体反应将氧化铜纳米颗粒标记的抗体加入到待检测样品中，充分反应后去除未反应的多余氧化铜纳米颗粒标记的抗体；
2)可视化检测向步骤1)反应体系中加入酸，将氧化铜纳米颗粒中的Cu2+释放出来；反应后，加入还原剂、表面炔基功能化的金纳米粒子和表面叠氮基功能化的金纳米粒子，充分反应后根据反应体系颜色的变化判断样品中是否发生反应。优选地，在所述方法中，在步骤1)之前还包括对待检测样品进行处理的步骤，处理的目的是为了使标记的抗体能够与样品充分而稳定的反应。优选地，在步骤1)之前，还包括对待检测样品进行封闭的步骤；优选地，所述封闭剂选自胎牛血清、山羊血清、马血清；进一步优选地，所述封闭剂为胎牛血清。其中，优选地， 在步骤2)中，封闭反应时间为30 120分钟，封闭温度为25 40°C ；进一步优选地，封闭反应时间为60分钟，封闭温度为37°C。优选地，在步骤1)中，氧化铜纳米颗粒标记的抗体为一抗；优选地，在步骤1)中，氧化铜纳米颗粒标记的抗体为二抗；优选地，在步骤1)中，抗原抗体反应的孵育时间为30 120分钟，孵育温度为 25 40°C ；进一步优选地，孵育时间为60分钟，孵育温度为37°C。优选地，在步骤2)中，加入的酸选自HCl、HN03、H2SO4,进一步优选为HCl。优选地，在步骤2)中，加入的酸在反应体系中的浓度为0. 1 ImM，酸反应时间为 5 20分钟；进一步优选地，所述酸在反应体系中的浓度ImM，酸反应时间为10分钟。优选地，在步骤幻中，加入的还原剂选自抗坏血酸钠、柠檬酸钠、硼氢化钠，进一步优选为抗坏血酸钠。优选地，在步骤2)中，加入的还原剂在反应体系中的浓度为0. 01 0. 1M，进一步优选地，所述还原剂在反应体系中的浓度为0. 05M。优选地，在步骤2~)中，加入的表面炔基功能化的金纳米粒子的炔基为包含化学式 I的化合物
权利要求
1.一种可视化检测抗原抗体反应的方法，所述方法包括以下步骤1)抗原抗体反应将氧化铜纳米颗粒标记的抗体加入到待检测样品中，充分反应后去除未反应的多余的氧化铜纳米颗粒标记的抗体；2)可视化检测向步骤1)反应体系中加入酸；反应后，加入还原剂、表面炔基功能化的金纳米粒子和表面叠氮基功能化的金纳米粒子，充分反应后根据反应体系颜色的变化判断样品中是否发生；优选地，在步骤1)之前还包括对待检测样品进行处理的步骤；优选地，在步骤1)之前，还包括对待检测样品进行封闭的步骤；进一步优选地，所述封闭剂选自胎牛血清、山羊血清、马血清；更优选地，所述封闭剂为胎牛血清；优选地，封闭反应时间为30 120分钟，封闭温度为25 40°C ；进一步优选地，封闭反应时间为60分钟， 封闭温度为37°C。
2.如权利要求1的方法，其特征为，在所述方法步骤1)中，氧化铜纳米颗粒标记的抗体为一抗；优选地，在步骤1)中，氧化铜纳米颗粒标记的抗体为二抗。
3.如权利要求1或2的方法，其特征为，在所述方法步骤1)中，抗原抗体反应的孵育时间为30 120分钟，孵育温度为25 40°C ；进一步优选地，孵育时间为60分钟，孵育温度为 37°C。
4.如权利要求1-3中任一项的方法，其特征为，在所述方法步骤2)中，加入的酸选自 HCl、HNO3、H2SO4,进一步优选为 HCl ；优选地，加入的酸在反应体系中的浓度为0. 1 ImM，酸反应时间为5 20分钟；进一步优选地，所述酸在反应体系中的浓度ImM，酸反应时间为10分钟。
5.如权利要求1-4中任一项的方法，其特征为，在所述方法步骤2)中，加入的还原剂选自抗坏血酸钠、柠檬酸钠、硼氢化钠，进一步优选为抗坏血酸钠；优选地，加入的还原剂在反应体系中的浓度为0.01 0. 1M，进一步优选地，所述还原剂在反应体系中的浓度为0. 05M。
6.如权利要求1-5中任一项的方法，其特征为，在所述方法步骤幻中，所述加入的表面炔基功能化的金纳米粒子的炔基为包含化学式I的化合物
7.如权利要求1-6中任一项的方法，其特征为，在所述方法步骤2)中，所述还原剂和两种功能化金纳米粒子以检测体系的形式同时提供；优选地，还原剂在检测体系中的浓度为0. 01 0. ImM，进一步优选地，所述还原剂在检测体系的浓度为0. 05mM。
8.如权利要求1-7中任一项的方法，其特征为，所述方法步骤2)中，所述反应体系的颜色变化和沉淀现象在5 30分钟时间内出现，进一步优选在10 15分钟时间内出现。
9.如权利要求1-8中任一项的方法，其特征为，所述待检测样品包括临床检测样品；优选地，待检测样品来自患有或被怀疑患有某种疾病的患者；进一步优选地，所述疾病为免疫相关疾病；更优选地，所述疾病为病毒引起的免疫相关疾病。
10.如权利要求1-9中任一项的方法在生物、生物医学、医学检验等领域中的应用；优选地，本发明提供所述方法在免疫相关疾病的检测和诊断中的应用，进一步优选地，所述免疫相关疾病为病毒引起的免疫相关疾病；优选地，本发明提供所述方法在制备用于疾病检测和诊断的试剂中的应用；进一步优选地，所述疾病为免疫相关疾病；更优选地，所述免疫相关疾病为病毒引起的免疫相关疾病。
11.一种用于可视化检测抗原抗体反应的试剂盒，所述试剂盒包括还原剂、表面炔基功能化的金纳米粒子以及表面叠氮基功能化的金纳米粒子；优选地，所述试剂盒中还包括氧化铜纳米颗粒标记的抗体；优选地，所述试剂盒中还包括氧化铜纳米颗粒；优选地，所述试剂盒中还包括抗体；进一步优选地，所述抗体为一抗或二抗。
12.如权利要求11的试剂盒，其特征为，所述试剂盒中的还原剂选自抗坏血酸钠、柠檬酸钠、硼氢化钠，进一步优选为抗坏血酸钠；优选地，所述试剂盒中还包括封闭剂；进一步优选地，所述封闭剂选自胎牛血清、山羊血清、马血清；更优选地，所述封闭剂为胎牛血清；优选地，所述试剂盒中还包括以下试剂的一种或多种阳性对照品、阴性对照品、样品稀释液、缓冲液等。
13.如权利要求11-12的试剂盒在生物、生物医学、医学检验等领域的应用；优选地，本发明提供所述试剂盒在疾病检测和诊断中的应用；进一步优选地，所述试剂盒应用于免疫相关疾病的检测和诊断中，更优选地，所述免疫相关疾病为病毒引起的免疫相关疾病。
全文摘要
本发明涉及一种可视化检测抗原抗体反应的方法，具体地，该方法通过先使标记了氧化铜纳米颗粒与待检测样品发生反应，然后采用表面功能化的金纳米粒子，对标记在抗体上的纳米氧化铜颗粒进行检测，从而提供关于抗原抗体反应的信息，为基于免疫反应的疾病检测和诊断提供了一种新工具。本发明涉及的方法不需要借助任何仪器，通过肉眼即可完成，适合野外作业。本发明还提供该方法的应用。本发明进一步提供用于可视化检测抗原抗体反应的试剂盒及其应用。
文档编号G01N33/558GK102269758SQ20101019156
公开日2011年12月7日 申请日期2010年6月4日 优先权日2010年6月4日
发明者刘颖昳, 曲伟思, 王卓, 蒋兴宇 申请人:国家纳米科学中心