专利名称：一种人类免疫缺陷病毒p24抗原酶联免疫检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明书属生物制剂技术领域。具体涉及ー种人类免疫缺陷病毒P24抗原酶联免疫检测试剂盒及制备方法。
背景技术：
HIV病毒的诊断对于HIV病毒的防治具有重要的作用，目前许多国家均采用測定病毒RNA的方法来缩短检测窗ロ期，病毒RNA的检测窗ロ期短，且在HIV感染的各阶段均存在，因此这种方法也常被应用于监测病程进展和判断抗病毒治疗效果。RNA測定法较P24检测法成熟、灵敏度高，但因其操作复杂、耗时长、花费高，且需要特殊昂贵的仪器，因此，在许多发展中国家中难以推广应用，有碍疾病的治疗和控制。2004年，HIV病毒发现者之一、美国马里兰大学Dr. Gallo领导的实验室的ー篇高 灵敏度检测P24抗原的研究论文引起了广泛的关注P24抗原检测方法的灵敏度得到了大幅提高。随着其检测灵敏度的不断提高，P24抗原的检测逐渐从主要用于在窗ロ期辅助早期诊断和进ー步缩短窗ロ期，发展到用于病毒载量的測定。目前，P24抗原在以下几方面都有重要应用抗HIV-I不确定或“窗ロ期”的辅助诊断；抗111￥-1阳性母亲所生婴儿早期的辅助鉴别诊断；第4代HIV-I抗原/抗体ELISA试剂检测呈阳性反应，但抗HIV-I确认阴性者的辅助诊断；监测病程进展和抗病毒治疗效果。随着P24抗原检测技术的不断进步，低成本的P24抗原检测有望在一定程度上替代现有的昂贵的RNA測定法。但是目前普遍使用双抗体夹心法检测人类免疫缺陷病毒P24抗原，具有很好的特异性，但是单纯利用物理吸附把单克隆抗体或者多克隆抗体吸附在酶标板上会存在单抗使用量大，活性损失大，特别是批间精密度差等缺点，而将亲和素包被在板上，再加入生物素化的抗体，则可以很好的解决这ー问题，其不但可以减少批间差，而且可以在检测过程中可ー步直接加入样品血清和酶标记抗体进行反应，形成固相亲和素-生物素化抗体-人类免疫缺陷病毒P24抗原-酶标抗P24抗原抗体复合物，然后加入底物缓冲液甲和こ进行反应，就可以定量或者定性分析血清中的人类免疫缺陷病毒P24抗原。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于解决传统酶标板批间差不足的问题，设计并建立了 P24抗原的检测试剂盒。本发明提供了 “ー种人类免疫缺陷病毒P24抗原酶联免疫检测试剂盒”，该试剂盒是包括亲和素预先包被后加入生物素化抗人类免疫缺陷病毒P24抗体的酶标板包被反应条、酶标记抗P24抗原抗体、阳性对照液一支、阴性对照液一支、20倍浓洗涤液I瓶、底物缓冲液甲I瓶、底物缓冲液こI瓶及终止液I瓶组成。I.抗体制备(I)利用P24抗原基因片段通过原核表达或者真核表达制备抗原；(2)制备抗体的制备和纯化
用上述重组抗原免疫豚鼠、兔子或者羊，得抗P24抗血清或免疫Balb/C小鼠得阳性鼠脾细胞与骨髄瘤细胞融合成杂交瘤细胞，筛选阳性克隆建株，得腹水；抗血清或腹水用盐析、离子交换层析、或者亲和层析法进行纯化，得纯抗P24抗体，其纯度95%以上。(3)用亲和素预先包被酶标板，并加入生物素标记的抗人类免疫缺陷病毒P24抗体进行二次包被反应，制成抗体预包被反应条48-96孔；(4)辣根过氧化物酶(HRP)与纯化的抗人类免疫缺陷病毒P24抗体酶联，制成酶标抗体；(5)配制阳性对照液、阴性对照液；(6)配制20倍浓缩洗液；(7)配制底物缓冲液甲； (8)配制底物缓冲液こ；(9)配制终止液。(10)分装上述试剂盒除预报被板其余七种成分，按需要分装在小瓶或尖底离心管中；(11)检定试剂盒的特异性、灵敏度、精密性、稳定性合格；(12)组装成成品。2、本发明的试剂盒在使用时可以如下操作(I)取出已包被条孔或板，恢复至室温。(2)配液将浓缩洗涤液(20X)用蒸馏水或去离子水稀释备用(20倍浓洗涤液lml+19ml蒸馏水即为工作液)。(3)加样每孔加待检血清50ul，各板设阳性对照一孔(50ul)，阴性对照一孔(50ul)，空白对照一孔(加蒸馏水50ul)，然后除空白对照孔外，各孔加酶标记液50ul，(4)温育用封板膜封板后置37°C温育30分钟。(5)洗涤小心揭掉封板膜，将孔内液体甩干，用洗涤液充分洗涤5遍，扣干。(6)每孔加入显色液A、B各I滴(50ul)，轻轻振荡混匀，37°C避光显色15分钟(7)測定OD值每孔加終止液I滴(50ul)，轻轻振荡混匀，设定酶免分析仪波长于450nm处(建议用双波长450/630nm检测)，测定各孔OD值。(8)结果判定阴性对照(A值)*2. 5 =临界值(cut off值)，阴性对照高于0. 05时按实际OD值算，阴性对照小于0. 05按0. 05计算，凡待检标本孔A值大于临界值即为阳性。本发明的试剂盒能非常专一地检测患者血清中P24蛋白的浓度。它具有简便、灵敏和稳定等特点。且本试剂盒操作简便快速，比PCR检测法省时(PCR法最快需要6-8小时完成实验)，经临床试用P24蛋白检测阳性与PCR检测的HIV阳性有很好的符合率，本试剂盒和PCR法相比，PCR需贵重的仪器设备，消耗性试剂昂贵，收费价又高，而本试剂盒整个实验中无需贵重仪器设备，消耗性试剂便宜且收费价低廉，能适用于各级医院及临床测试中心，也可用于流行病学普查。本发明的试剂盒，具有简便、灵敏、重复性好的优点，能检出完整P24抗原，将可被普遍使用。
具体实施方式
下面结合具体实施两例，进ー步阐述本发明。本实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明要求保护的范围。实施例I制备人类免疫缺陷病毒P24抗原酶免检测试剂盒的生产步骤I、生物素化抗体制备(I)纯化包被抗体用重组抗原免疫豚鼠、兔子或者羊，得抗P24抗血清或免疫Balb/C小鼠得阳性鼠脾细胞与骨髄瘤细胞融合成杂交瘤细胞，筛选阳性克隆建株，得腹水；抗血清或腹水用盐析、离子交换层析、或者亲和层析法进行纯化，得纯抗P24抗体，其纯度95%以上。效价大于10万。、(2)生物素偶联抗P24抗体用常规方法将生物素(BNHS)溶于N，N_ ニ甲基酰胺(DMF)配成lmg/Ml，用0. Imol/L pH值为9. 0的NaHC03将纯化的抗P24抗体稀释成l_2mg/mL，按BNHS与抗体的容积比为I 8或重量比为I : 7左右混合，室温搅拌下反应2-4h，装入透析对0. 05mol/LpH值为
7.2的PBS，4°C透析过夜，结合物加等体积的甘油，小量分装，_20°C —下保存备用。2、酶标记抗体制备(I)抗体制备基因重组的P24Ag免疫豚鼠、兔子或者羊得抗P24抗体或重组的P24Ag免疫Balb/C小鼠得腹水，抗血清或腹水用盐析、离子交换层析、或者亲和层析法进行纯化，得纯抗P24抗体，其纯度95%以上。效价大于10万。(2)酶标记抗体制备抗P24抗体用过碘酸钠法与辣根过氧化物偶联。(3)酶标记抗体浓度选定采用方阵滴定法选择酶标记抗体的工作浓度大于I : 2000。P24重组抗原从lOug/ml倍増稀释，包被酶标板，加梯度稀释的酶标抗体測定，以确定最适稀释度。3、预包被抗体板的制备(I)包被用0. 05M的pH值为4. 5-5. O的柠檬酸缓冲液配制所需浓度的亲和素包被液，将包被液加入固相载体酶标上，置湿盒中加盖，40C过夜甩干。⑵洗涤用生理盐水洗涤三遍，以去除剩余亲和素。(3)封闭Na2HP04. 12H202. 6g
NaH2P04. 12H200. 4g
20%Tween-202. 5mL
NaCl8.2g
BSAIOg
Proclin300ImL
重蒸水定容至IOOOmL
调整PH至7. 2，将封闭液300 U L加入微孔板各孔中，静置5秒后甩干，上述操作重复三次，甩掉封闭液，拍干。(4) 二次反应包被将生物素化的抗P24抗体用0. 02M的PBS稀释至合适浓度，加110 ii L于微孔板各孔中，置湿盒中加盖，40C过夜甩干。用0. 02M的PBS溶液洗涤三遍并抽湿干燥，放入有干燥剂铝箔袋封存备用。4、阳性对照的制备HIV呈阳性的患者血清。600C放置I个小时，除菌过滤，用本药盒测定A值> 0. 3，备用，分装。5、阴性对照的制备用本试剂盒测定正常人血清A值在0-0. 03，加千分之一的Proclin300，分装备用。6、酶标单抗配置用含10%小牛血清和90% 0. 15M的PBS稀释Anti-p24_HRP，稀释20倍，分装。7、酶标单抗稀释液
BSA0.5g
Na2HP04. 12H202. 6g
NaH2P04. 2H200. 4g
NaCl8.2g
20%Tween-20100ml
Proclin300ImL调整pH 至 7. 28、底物液A
Na2HP04. 12H20I. 7g
柠檬酸.H200. 5g
3%H202200IX I
重蒸水100ml
调整pH 至 5. 09、底物液BNa2HP04. 12H20I. 7g柠檬酸 H200. 5g重蒸水IOOml调整pH 至 5. 0 后，加入 IOmlDMSO 含 60mgTMB 的溶液 25 U I10、终止液浓H2S04IOml 重蒸水80ml11、20X 洗涤液
Na2HP04.12H202. 6g
NaH2P04. 2H200. 4g
Tween-202. 5 u I
重蒸水50ml调整pH 至 7. 212、半成品及成品的组成上述⑴一(11)步骤所得产品装入小瓶及尖底离心管中，即为半成品。抽出三份经过特异性、稳定性、灵敏度及精密度检定合格才能组装成P24试剂盒。组装成盒后还需抽出三份，同半成品ー样经过检定合格才能出售。实施例2一种人类免疫缺陷病毒P24抗原酶免检测试剂盒的操作步骤I、操作步骤如下(I)取出已包被条孔或板，恢复至室温。(2)配液将浓缩洗涤液(20X)用蒸馏水或去离子水稀释备用(20倍浓洗涤液lml+19ml蒸馏水即为工作液)。(3)加样每孔加待检血清50ul，各板设阳性对照一孔(50ul)，阴性对照一孔(50ul)，空白对照一孔(加蒸馏水50ul)，然后除空白对照孔外，各孔加酶标记液50ul。(4)温育用封板膜封板后置37°C温育30分钟。(5)洗涤小心揭掉封板膜，将孔内液体甩干，用洗涤液充分洗涤5遍，扣干。(6)每孔加入显色液A、B各I滴(50ul)，轻轻振荡混匀，37°C避光显色15分钟(7)測定OD值每孔加終止液I滴(50ul)，轻轻振荡混匀，设定酶免分析仪波长于450nm处(建议用双波长450/630nm检测)，测定各孔OD值。(8)结果判定阴性对照(A值)*2. 5 =临界值(cut off值)，阴性对照高于0. 05时按实际OD值算，阴性对照小于0. 05按0. 05计算，凡待检标本孔A值大于临界值即为阳性。
权利要求
1.“ー种人类免疫缺陷病毒P24抗原酶联免疫检测试剂盒”，其特征在于该试剂盒包括 (1)用亲和素预先包被酶标板，并加入生物素标记的抗P24抗原抗体二次包被反应，制成抗体预包被反应条48-96孔； (2)酶标记抗P24抗原抗体； (3)阳性对照液I支、阴性对照液I支； (4)20倍浓缩洗液I瓶； (5)底物缓冲液甲I瓶； (6)底物缓冲液こI瓶； (7)终止液I瓶组成。
2.一种如权利I所描述的ー种“人类免疫缺陷病毒p24抗原酶联免疫检测试剂盒”的制备方法，其特征在于该方法包括下列步骤 (1)利用人类免疫缺陷病毒P24抗原基因片段，通过原核表达或者真核表达制备抗原； (2)制备抗体的制备和纯化 用上述重组抗原免疫豚鼠、兔子或者羊，得抗P24抗血清或免疫Balb/C小鼠得阳性鼠脾细胞与骨髄瘤细胞融合成杂交瘤细胞，筛选阳性克隆株，得腹水；抗血清或腹水用盐析、离子交换层析、或者亲和层析法进行纯化，得纯抗P24抗体，其纯度95%以上，效价大于10万。
(3)用亲和素预先包被酶标板，并加入生物素标记的抗人类免疫缺陷病毒P24单克隆抗体或者多克隆抗体进行二次包被反应，制成抗体预包被反应条48-96孔； (4)辣根过氧化物酶(HRP)与纯化的抗人类免疫缺陷病毒P24抗体酶联，制成酶标抗体； (5)配制阳性对照液、阴性对照液； (6)配制20倍浓缩洗液； (7)配制底物缓冲液甲； (8)配制底物缓冲液こ； (9)配制終止液； (10)分装上述试剂盒除预包被板其余七种成分，按需要分装在小瓶或尖底离心管中； (11)检定试剂盒的特异性、灵敏度、精密性、稳定性合格； (12)组装成成品。
3.根据权利I所述的ー种“人类免疫缺陷病毒p24抗原酶联免疫检测试剂盒”，其特征在于其中所述的抗体预包被反应条48-96孔、酶标记P24抗体、阳性对照液为HIV阳性血清，阴性对照液为正常人血清、浓洗涤液为磷酸-Tween-20缓冲液，底物缓冲液甲为H202、底物缓冲液こ为3. 3’，5. 5’ -四甲基联苯胺和终止液为(4N H2S04)。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在干，所述亲和素包被固相载体酶标板采用一下方法 用0. 05M的pH值为4. 5-5. 0的柠檬酸缓冲液配制所需浓度的亲和素包被液，将包被液加入固相载体酶标上，并洗涤、封闭，再加入生物素化的人类免疫缺陷病毒P24单克隆抗体进行反应后，经洗涤、抽湿干燥后用铝箔袋密封。
5.如权利要求2所述方法，其特征在于，所述浓缩洗涤液配方为含0. 02MPBS,8.9%NaCl 和 0. 5% Tween-20 o
全文摘要
本发明公开了一种人类免疫缺陷病毒P24抗原酶联免疫检测试剂盒，解决传统酶标板批间差不足的问题，设计并建立了P24抗原的检测试剂盒，该试剂盒是包括亲和素预先包被后加入生物素化抗人类免疫缺陷病毒P24抗体的酶标板包被反应条、酶标记抗P24抗原抗体、阳性对照液一支、阴性对照液一支、20倍浓洗涤液1瓶、底物缓冲液甲1瓶、底物缓冲液乙1瓶及终止液1瓶组成。本发明具有较好的均一性，特异性，灵敏度，定量精确，快速简便，适用于人类免疫缺陷病毒P24抗原早期检测。
文档编号G01N33/531GK102768274SQ20111011415
公开日2012年11月7日 申请日期2011年5月4日 优先权日2011年5月4日
发明者林志铿 申请人:武汉康苑生物医药科技有限公司