用于检测食品中磺胺类药物残留的抗体芯片试剂盒及方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物芯片技术领域，尤其涉及一种用于检测食品中磺胺类药物残留的 抗体芯片试剂盒及方法。
【背景技术】
[0002] 磺胺类药物是一类人工合成的广谱抗菌药，在兽医临床上，广泛用于治疗脑膜炎、 淋病、尿道感染等疾病。在畜牧生产中，作为饲料添加剂，能够促进畜禽生长，改善产品品 质。一些人为了追求利益滥用磺胺类药物，导致这些药物在动物性食品中蓄积。人食用这 些污染的食物后，出现过敏反应、肾脏损害、白细胞减少症等不良反应。大量磺胺类药物的 滥用还会导致细菌产生抗药性，破坏生态环境。为了保证人类食品安全和生态环境的稳定， 我国规定磺胺类药物在所有可食性食品中的最高残留限量为100 μ g/kg。
[0003] 目前我国采取的检测磺胺类药物在动物组织中的残留方法有仪器分析方法、微生 物方法、免疫测定方法。仪器方法存在仪器昂贵、操作复杂、检测时间长的缺点，不便于推 广。微生物法常作为筛选方法，能同时检测多种药物，但准确度和特异性有待提高。免疫测 定依赖于抗原抗体反应，具有灵敏度高、特异性强、操作简单等优点，是目前应用最广的检 测方法。从实验原理上讲，ELISA法、胶体金试纸条、抗体芯片技术、免疫微球技术均属于免 疫测定方法，ELISA法仅能检测单一组分，胶体金试纸条的准确度和特异性不好，免疫微球 技术存在制备过程繁琐、检测时间长的缺点。
[0004] CN102608318A公开了用于检测磺胺类药物的单克隆抗体及酶联免疫方法与试剂 盒，该发明制备的单克隆抗体能够识别16种磺胺类药物，所建立的酶联免疫方法与试剂盒 以磺胺嘧啶与卵清蛋白偶联物作为包被原，但是该方法这16种磺胺类药物的检测灵敏度 不高，例如对磺胺二甲嘧啶的IC 5tl为5. 8 μ g/L，对磺胺嘧啶的IC 5(|为0. 92 μ g/L，对磺胺对 甲氧嘧啶的IC5tl为0. 76 μ g/L。试剂盒的最低检测限（LOD)为17. 47 μ g/Kg。
[0005] 抗体芯片技术是近年来迅速发展起来的检测手段，既具有其它免疫测定方法的所 有优势，又结合了芯片技术高通量的优点，非常适合用于大量样本中多种农兽药的残留检 测。
【发明内容】
[0006] 本发明的第一个目的是提供一种用于检测食品中磺胺类药物残留的抗体芯片试 剂盒。
[0007] 该试剂盒包括芯片、抗体、Cy3标记的二抗、提取试剂，所述抗体是由保藏号为 CCTCC N0:C201148的杂交瘤细胞株4E5所分泌的单克隆抗体，所述芯片固定了磺胺类包被 原，所述磺胺类包被原为2-磺酰氨基-4-甲基嘧啶-5-羧酸与卵清蛋白偶联物。
[0008] 所述的保藏号为CCTCC N0:C201148的杂交瘤细胞株4E5已在本申请人于2012年 2月27日申请的"用于检测磺胺类药物的单克隆抗体及酶联免疫方法与试剂盒"的专利中 公开，公开号为102608318A，公开日为2012年7月25日。
[0009] 优选地，所述的芯片按如下方法制备：以晶芯高分子基片G作为基片，用围栏将基 片分成12个反应区域，每个反应区域设三排三纵共9个微阵列，将磺胺类包被原溶液、以及 两种对照溶液一一卵清白蛋白溶液和Cy3标记的卵清白蛋白溶液分别点样在其中一排微阵 列上，点样完成后固定〇. 5h，用2% (重量百分比）牛血清白蛋白溶液封闭0. 5h。
[0010] 优选地，所述磺胺类包被原溶液的浓度为?ο μ g/mL，所述磺胺类包被原溶液的溶 剂是含有5% (重量百分比）甘油的pH值为9. 16的碳酸盐缓冲液。
[0011] 优选地，所述微阵列上的点样顺序是从上到下，从左至右。
[0012] 优选地，所述的Cy3标记的二抗是Cy3标记的羊抗鼠或兔抗鼠抗体。
[0013] 优选地，所述提取试剂是按如下方法配制的：准确称取KH2PO4O. 41g，K2HP045. 59g， 超纯水溶解，定容至l〇〇〇mL。
[0014] 本发明的第二个目的是提供所述的抗体芯片试剂盒在检测食品中磺胺类药物残 留的应用。
[0015] 本发明的第三个目的是提供一种用于检测食品中磺胺类药物残留的抗体芯片方 法，该方法包括以下步骤：
[0016] 1)样品前处理：样品匀浆后加入提取试剂提取；
[0017] 2)将样品液和稀释好的抗体按I : 1的体积比混合后加入到固定了磺胺类包被原 溶液、以及对照溶液一一卵清白蛋白溶液和Cy3标记的卵清白蛋白溶液的芯片上，于37°C 反应0. 5h，洗涤3次，甩干；
[0018] 3)将Cy3标记的二抗加到芯片，于37°C反应0. 5h，洗涤3次，甩干；
[0019] 4)用InnoScan 700A扫描仪对芯片进行扫描，与卵清白蛋白溶液和Cy3标记的卵 清白蛋白溶液进行对照，用Mapix分析软件进行结果分析，
[0020] 所述抗体是由保藏号为CCTCC N0:C201148的杂交瘤细胞株4E5所分泌的单克隆 抗体；
[0021] 所述磺胺类包被原为2-磺酰氨基-4-甲基嘧啶-5-羧酸与卵清蛋白偶联物；
[0022] 所述的Cy3标记的二抗是Cy3标记的羊抗鼠或兔抗鼠抗体。
[0023] 优选地，所述提取试剂是按如下方法配制的：准确称取KH2PO4O. 41g，K2HP045. 59g， 超纯水溶解，定容至l〇〇〇mL。
[0024] 优选地，所述抗体是用pH7. 4的磷酸盐缓冲液稀释的，所述抗体的稀释度为 1:800 ;所述磺胺类包被原溶液的浓度为10 μ g/mL，所述磺胺类包被原溶液的溶剂是含有 5 %甘油的pH9. 16的碳酸盐缓冲液。
[0025] 本发明的有益效果是：
[0026] 1)本发明的抗体芯片试剂盒可以同时检测16种磺胺类药物--磺胺二甲嘧啶、 磺胺间甲氧嘧啶、磺胺嘧啶、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺氯哒嗪、磺胺氯吡嗪、磺胺甲氧哒嗪、磺 胺噻唑、磺胺邻二甲氧嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基异嘧啶、磺胺喹恶啉、磺胺地索辛， 磺胺甲噁唑、磺胺甲噻二唑及磺胺异噁唑，从而为食品中的磺胺类药物残留检测提供了一 个快速、灵敏、高通量的方法。
[0027] 2)本发明所建立的抗体芯片试剂盒和检测方法准确度高，精密度好、检测效率高。 对磺胺二甲嘧啶的IC 5tl为2. 91 μ g/L，对磺胺嘧啶的IC 5Q为0. 43 μ g/L，对磺胺对甲氧嘧啶 的IC5tl为0. 68 μ g/L，对磺胺氯吡嗪的IC5tl为2. 73 μ g/L，对猪肉和牛奶的最低检测限（LOD) 低于9 μ g/kg，对16种磺胺类药物的检测灵敏度均优于CN102608318A公开的酶联免疫方法 与试剂盒。
【附图说明】
[0028] 附图1是本发明的技术路线图。
[0029] 附图2是基片优化的结果，图中1是不同基片相对荧光信号强度的比较，2是不同 基片背景值的比较。
[0030] 附图3是4种点样顺序以及点样顺序的优化结果，图中B、C、D、E是4种点样顺序， A是点样效果示意图，C是最优的点样顺序图。
[0031] 附图4是点样溶液和封闭液的优化结果，图中1是不同缓冲溶液作为点样液的优 化结果，2是不同pH的CBS作为点样液的优化结果，3是添加不同表面活性的固定效果的比 较，4是封闭液的优化结果。
[0032] 附图5是抗体稀释液和反应温度的优化结果，图中1是一抗稀释液的优化结果，2 是二抗稀释液的优化结果，3是反应温的优化结果。
[0033] 附图6是制备抗体芯片过程中各时间的优化结果，图中1是固定时间的优化结果， 2是封闭时间的优化结果，3是一抗反应时间的优化结果，4是二抗反应时间的优化结果。
[0034] 附图7是本发明采用的固相载体以及分区示意图，图中1 :玻片；2 :晶芯高分子基 片G修饰物；3 :12个分区围栏。
[0035] 附图8是建立的标准曲线。
[0036] 附图9是抗体芯片的稳定性试验结果，图中1是37°C加速稳定性结果，2是4°C长 期稳定性结果。
【具体实施方式】
[0037] 下面通过实施例对本发明作进一步说明，但不限制本发明。
[0038] 实施例1磺胺类包被原的合成
[0039] 称取62mg半抗原2-磺酰氨基-4-甲基嘧啶-5-羧酸，34mg NHS，45mg DCC，加入 I. 5mL DMF溶解，磁力搅拌下，于4°C反应18h，过滤除去沉淀，滤液用于连接蛋白。
[0040] 取IOOmg卵清蛋白溶解于IOmL的PBS缓冲液，在磁力搅拌下，将上述活性酯ImL 逐滴加入到蛋白溶液中，4°C反应2 Ih。
[0041] 将反应液装入透析袋中，于PBS缓冲液中透析3天，每6h更换一次透析液。最后 冻干保存。
[0042] 实施例2芯片参数的选择
[0043] 1)不同基片的比较：分别在多聚赖氨酸玻片，正电荷玻片，晶芯高分子基片G、醛 基基片、琼脂糖修饰玻片上点〇. 5 μ g/mL Cy3-0VA，用InnoScan 700A扫描仪扫描并储存数 据，结果见附图2。从图2-1可以明显看到晶芯高分子基片G的相对荧光信号强度最高，表 明晶芯高分子基片G对样品的吸附性最好；从图2-2可以看出其背景值低于醛基的背景值。 综合考虑吸附性和背景值两方面因素本实验选择商业化的晶芯高分子基片G作为基片。
[0044] 2)不同点样顺序的选择：分别按照以下四种方式：B为从右至左，从下向上；C为 从左至右，从上向下；D为从左到右，从上向下，先点完第一排反应区域，再点第二排反应区 域；E为从右到左，从下向上，先点完第二排反应区域，再点第一排反应区域，各点样方式的 示意图见附图3，A为最终点样效果。结果显示：相对于其他方式，方式C的相对荧光信号值 基本处于稳定状态，变异系数最小（7.96% )，说明该方式点出的点均一性较好，所以选用 方式C作为最优芯片的点样方式。
[0045] 3)点样稀释液的选择：分别选用pH7. 4磷酸盐缓冲液（PBS)、pH9. 6碳酸盐 缓冲溶液（CBS)、pH7. 4Tris-HCl缓冲盐溶液（TBS)、含10 % (重量百分比，下同）甘 油的 pH7. 4PBS (PBS+10 % G)、含 10 % 甘油的 pH9. 6CBS (CBS+10 % G)、含 10 % 甘油的 pH7. 4TBS(TBS+10% G)分别作为点样液配制10 μ g/mL磺胺类包被原溶液进行点样，制备芯 片，结果见附图4-1，可以看出用CBS+10%甘油、CBS作为点样液的相对荧光信号强度明显 高于其它点样液，所以初步选用CBS为晶芯高分子基片G的点样溶液；对CBS的pH进行了 优化，结果如附图4-2所示，可以显示随着CBS pH值的增大，荧光信号强度呈现降低趋势， 说明用PH9. 16的CBS作为点样液比较好；考察了不同表面活性剂对固定效