一种人附睾蛋白免疫检测试剂盒及其使用方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种人附睾蛋白免疫检测试剂盒及其使用方法，属于生物材料及检测技术领域。
【背景技术】
[0002]卵巢癌是妇科常见的恶性肿瘤，也是妇科肿瘤死亡率最高的肿瘤类型。目前，卵巢癌的诊断主要依据两种检测手段。一种是经阴道超声检查(TUV)，这种成像方法可用于检查女性的生殖器官，包括子宫、卵巢、宫颈及阴道。尽管其应用较为普遍，但是这种方法并不能准确检测出肿块是良性还是恶性。此外，该方法还需要经验丰富的临床技师对检测结果进行解读。另一种常规检测方法是检测生物标志物CA125 (carbohydrate antigen 125)，这种方法被视为卵巢癌诊断的“金标准”。但是，CA125的特异性及敏感度较低，容易出现假阴性或假阳性。大约50%的卵巢癌I期患者并没有CA125水平升高的现象，也就是说有一半的卵巢癌患者可能被漏诊。某些良性卵巢疾病也会导致CA125水平升高，造成假阳性。因此，在临床诊断上亟需一种更好的诊断标志物及检测工具以尽早诊断卵巢癌。人附睾蛋白4 (HE4)是一种新的肿瘤标志物，88%的卵巢癌患者都会出现HE4升高的现象，其可用于卵巢癌的早期诊断、鉴别、治疗监测及预后评估。与CA125相比，HE4的敏感度更高、特异性更强，尤其是在疾病初期无症状阶段，疾病早期HE4诊断的敏感度是82.7%，而CA125却仅有45.9%。与CA125较低的特异性相比，HE4的特异性高达99%。这意味着，临床医生对HE4的检测结果会更具信心。
[0003]因此，如何对HE4进行快速有效的高灵敏检测成为研宄热点，目前HE4的检测方法主要为生物酶联法(参见文献:S.Wang, X.Zhao, 1.Khimji, R.Akbas, ff.Qiu,D.Edwards, D.ff.Cramer, B.Ye, U.Demirci, Lab Chip.2011, 11, 3411.)及电化学发光免疫检测(参见文献:J.J.Yang, M.Sa, M.Huang, J.J.Yang, Z.Y.Xiang,B.Liu, A.G.Tang, Clin B1chem.2013, 46，1705.)，然而这些技术或多或少都存在着缺陷，譬如样品准备繁琐，检测时间长以及检测灵敏度并不高等，目前这两种方法的检测限大约在 10 pg.πιΓ1 水平(参见文献:F.Plotti, S.Caprigl1ne, C.Terranova, R.Montera, A.Aloisi, P.Damiani, L.Muzii, G.Scaletta, P.Benedett1-Panici, R.Ang1li, Tumor B1logy.2012, 33，2117.)，而疾病早期时 HE4 浓度极低，这就对 HE4抗原的高灵敏准确检测提出了挑战。表面增强拉曼光谱(SERS)是一种具有极高灵敏度的检测表面物种信息的光谱技术，其在贵金属Au、Ag、Cu上的增强可达16倍以上。自1974年Fleischmann在粗糙银电极上获得了吡啶吸附的高质量拉曼光谱以来(参见文献:S Μ.Fleischmann, P.J.Hendra, A.J.McQuillan, Chem.Phys.Lett.1974, 26, 163.),ERS在表面科学中迅速崛起，目前在生物医学、食品卫生、催化等各领域都得到了广泛的应用。同时，金包覆的铁氧化物功能性核壳纳米粒子(铁氧化物@Au)兼具内核铁氧化物的强顺磁性和外层Au的高SERS活性，已成为理想的SERS基底材料，利用其有效的磁富集作用进行现场极低浓度物质的检测具有极大的潜力。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是针对现有人附睾蛋白检测存在的灵敏度较低的不足，提供一种基于表面增强拉曼光谱及磁性能的复合磁性材料实现人附睾蛋白的高灵敏检测的试剂盒及其使用方法。通过SERS技术使检测限达到飞克级水平，并实现了磁性免疫复合纳米粒子的循环使用。
[0005]为达到上述发明目的，本发明采用的技术方案是:一种人附睾蛋白免疫检测试剂盒，它的有效成分包括按体积比为1:1的标记免疫金纳米粒子试剂和Fe3O4OAu免疫纳米粒子试剂；
所述的标记免疫金纳米粒子的制备方法为:制备质量体积比为0.6%?1%的粒径为35?50 nm的金纳米粒子分散液，取浓度为lmmol/1的4-巯基苯甲酸标记分子2 μ I加入到I ml的金纳米粒子分散液中，离心分散后，按摩尔比2?5:1，依次加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，进行表面羧基活化处理后，注入人附睾蛋白抗体，孵育2?3 h，再进行离心分散，加入牛血清白蛋白封闭剩下的活性位，得到标记免疫金纳米粒子试剂；
所述的核壳结构Fe3O4OAu免疫纳米粒子的制备方法为:制备质量体积比为15?20%的Fe3O4分散液，取浓度为lmmol/1的氨丙基三甲基硅烷90?100 μ I加入到I ml的Fe 304分散液中，得到表面氨基化修饰的？6304;按质量比5?10:1，将粒径为2?5nm的金纳米粒子加入到表面氨基化修饰的Fe3O4分散液中混合，得到Fe3O4- Au纳米复合物；利用种子生长法制备得到Fe3O4OAu核壳纳米粒子；注入浓度为5mg/ml的人附睾蛋白抗体8?10 μ 1，得到核壳结构Fe3O4OAu免疫纳米粒子试剂。
[0006]本发明提供的人附睾蛋白免疫检测试剂盒的使用方法，包括如下步骤:
1、将标记免疫金纳米粒子试剂、Fe3O4OAu免疫纳米粒子试剂与待测抗原混合，组装形成“标记免疫金纳米粒子-抗原-Fe3O4OAu免疫纳米粒子”磁性复合夹心结构；
2、将磁性复合夹心结构通过钕铁硼磁铁富集后转移至载玻片，用于进行表面增强拉曼光谱检测。
[0007]本发明提供的试剂盒的使用，还可以酸化甲醇溶液为解离剂，解离磁性复合夹心结构，实现免疫磁性纳米粒子的循环使用。所述的酸化甲醇溶液，甲醇的质量浓度为25%，用HCl调节甲醇溶液的pH为2?3。
[0008]由于上述技术方案的采用，与现有技术相比，本发明具有如下优点:
1、采用EDC和NHS进行活化，可有效增加金纳米粒子及磁性Fe3O4OAu纳米粒子与抗体蛋白的结合能力，从而提高待测物质的检测有效性。
[0009]2、本发明将磁性纳米粒子与表面增强拉曼光谱有效结合，能快速有效富集待测抗原，磁性富集可极大增加SERS的热点，可实现比其他方法更低的检测限，在卵巢癌疾病早期的超痕量检测方面具有实际应用价值。
[0010]3、通过酸化甲醇解离复合三明治结构，使免疫磁性纳米粒子实现循环使用，为本发明的低成本打下了基础。
[0011]4、本发明的实施条件温和，采用便携式拉曼光谱仪，无需任何大型仪器设备，有利于推广应用。
【附图说明】
[0012]图1为本发明实施例制备的Fe3O4OAu纳米粒子的TEM谱图；
图2为本发明实施例制备的磁性Fe3O4OAu纳米粒子在无外加磁场(A)和有外加磁场(B)作用下的对比图像；
图3为“标记免疫金纳米粒子-抗原HE4-免疫磁性Fe3O4OAu纳米粒子”三明治夹心结构的TEM形貌图；
图4为本发明实施例提供的免疫金溶胶与磁性核壳免疫纳米粒子为试剂盒有效成分对HE4抗原检测的原理示意图；
图5为本发明实施例中不同浓度的抗原HE4富集后得到的磁性复合结构的SERS光谱对比图；
图6为在图5基础上，以4-MBA的1578CHT1苯环振动谱峰强度与HE4抗原浓度作剂量反应的曲线图；
图7为本发明实施例中的三明治结构进行解离后，将得到的免疫磁性Fe3O4OAu纳米粒子循环利用，每次完成组装后的上层清液中抗原HE4的SERS检测对比谱图。
【具体实施方式】
[0013]下面结合附图和实施例对本发明作进一步描述。
[0014]实施例1
一、基底的制备
1、免疫金纳米粒子的制备:先制备35nm粒径的金纳米，取I mL 0.01 g/mL的HAuCl4(1%)配制成100 mL l.0XlO—4 g/mL HAuCl4 (0.01%)，剧烈搅拌下加热煮沸后迅速加入ImL 1.0Χ1(Γ2 g/mL的朽1檬酸钠水溶液，保持沸腾15 min后，搅拌下冷却至室温。加入2 μ L 4-ΜΒΑ标记分子，离心分散后依次加入1- (3- 二甲氨基丙基)_3_乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC.HCl)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS) (EDC和NHS的体积比为2:1)溶液活化，再将ΗΕ4抗体注入，孵育2?3 h，再次离心后分散加入10 μ L 5% (质量体积比)BSA封闭剩下的活性位。
[0015]2、Fe3O4纳米粒子的合成:将0.65 g FeCl 3.6Η20和0.2