肌钙蛋白i竞争比浊法检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种心肌肌钙蛋白I竞争免疫比浊法测定试剂盒，属于医学领域。
【背景技术】
[0002] 心肌肌钙蛋白I(cTnl)是心肌损伤敏感及特异性最强的标志物之一，在急性心 肌损伤及心肌炎中作为判断心肌细胞损伤的金标准，也作为冠动脉综合征危险分层及预 后的关键生化标志物。肌钙蛋白属于调节蛋白，分子呈球形，由肌钙蛋白T(TnT)、肌钙蛋 白I(Tnl)、肌钙蛋白C(TnC)三条肽段组成，其中肌钙蛋白I(cTnl)属于一种碱性蛋白， 共210个氨基酸，在血清中游离形式只占4. 1 %，大部分与肌钙蛋白T及C亚单位结合在 一起，以复合体形式存在（Ward DG, Cornes MP, Trayer IP. Structural consequences of cardiac troponin I phosphorylation. J Biol Chem, 2002, 277 (44): 41795.，此外还有可 能以氧化型、还原型、磷酸化、去磷酸化及蛋白降解形式释放（Ward DG, Ashton PR, Trayer HR, et al. Additional PKA phosphorylation sites in human cardiac troponin I. Eur J Biochem, 2001，268 (1) : 179.)，属于心肌损伤高敏感指标性物质，在"微型心肌损伤"中肌隹$ 蛋白I即可出现阳性结果，因此是临床上作为心肌细胞损伤的标志性生化检测项目之一。
[0003] 由于肌钙蛋白I (cTnl)在血清中存在的形式多样，而且衰减周期短，因此对识别肌 钙蛋白I(cTnl)的抗体有很高要求，且不同方法制备的抗体在测定肌钙蛋白I(cTnl)含量 时，所得结果也完全不同，使得临床上对肌钙蛋白I(cTnl)含量测定无法标准化（Katrukha A,Bereznikova A, Filatov V, et al. Biochemical factos influencing measurement of cardiac troponin I in serum. Clin ChemLab-Med, 1999, 37(11/12):1091.)〇
[0004] 临床上对肌钙蛋白I (cTnl)的检测灵敏度及特异性要求很高，虽然测定肌钙蛋白 I(cTnl)的方法很多，但是定量测定受到许多因素的影响，从而导致各种检测结果之间相差 很大。其中最主要原因是在患者血清中肌钙蛋白I(cTnl)会有不同程度的降解、游离、复合 物形式及不同的清除率，形成肌钙蛋白I(cTnl)在血清中的不同半衰期，因此各种检测方 法中分别使用针对上述不同抗原决定簇的抗体，其免疫反应必然有很大差异。
[0005] 目前关于比浊测定法测定肌钙蛋白I(cTnl)的试剂有很多厂家，但是不管是试剂 灵敏度，还是特异性都很难满足临床检测要求，这是因为肌钙蛋白I(cTnl)在正常人血清 中含量极低，在〇.〇8ng/ml以下，而大多比浊法检测极限在lng/ml，而且在此检测极限情况 下，影响测定结果的因素也被成倍放大。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是为了解决以上现有技术测定肌钙蛋白I(cTnl)的试剂中存在灵 敏度，还是特异性都很难满足临床检测要求的问题，使得临床上对肌钙蛋白I(cTnl)含量 测定标准化；本发明是将待测样本与免疫聚苯乙烯微球混合，待测样本中的肌钙蛋白I与 微球上抗体发生免疫复合反应，由于抗体作用位点单一，避免形成具有浊度的大颗粒复合 物，当加入2号试剂时，载体蛋白上的肌钙蛋白I微型肽段与抗体发生免疫复合反应，计算 浊度强度得出游离抗体浓度则可推算出待测物中心肌肌钙蛋白I的浓度。
[0007] 本发明的技术方案
[0008] 1. 一种肌钙蛋白I竞争比浊法检测试剂盒，该检测试剂盒包括：根据肌钙蛋白I 全氨基酸序列合成相应抗体作用位点的微型肽段（10-30个氨基酸），将合成肽段共价标记 于惰性载体蛋白并制备成反应试剂；同时采用肽段作用的抗体包被于聚苯乙烯微球上制备 成免疫乳胶试剂和纯化人心肌肌钙蛋白I(cTnl)制备而成的标准品。
[0009] 2.该试剂盒中的免疫胶乳试剂是按以下方法制备的：
[0010] (1)据肌钙蛋白I(cTnl)氨基酸序列，分别选取氨基端（序列2)，羧基端（序列4) 和中心区（序列3)氨基酸序列，获得其相应肽段（序列5或8, 7或10和6或9)，一般氨基 残基数在5-30个。采用多肽合成仪进行合成，反相高效液相色谱法进行分离纯化；
[0011] (2)选用惰性蛋白作为载体，采用碳化二亚胺将获取肽段与载体蛋白共价偶联； 并将上述肽段混合后与载体蛋白进行标记，或分别与载体蛋白进行标记，标记完成后，对混 合体系进行分离纯化，获得标记量均一的肽段-载体蛋白标记物；
[0012] (3)采用碳化二亚胺活化微球羧基，分别将上述作用位点的cTnl多隆抗体与活化 的羧基胶乳微球混合反应，制备成免疫胶乳微球。
[0013] 3?该试剂盒中：
[0014] 试剂1 (免疫胶乳试剂）的配方是：缓冲液20mmol/L、促凝剂30g/L、氯化钠9g/L、 cTnl单克隆抗体标记微球cTnIAb-PS lg/L加纯水至1000ml。
[0015] 试剂2(反应试剂）的配方是：缓冲液20mmol/L、肽段-蛋白标记物cTnl-BSA 0? 01g/L 加纯水至 1000ml;
[0016] 标准品：纯化人心肌肌妈蛋白I (cTnl) 5ng/ml、pH = 5. 8的PBS缓冲液。
【具体实施方式】
[0017] 本发明是采用人工合成获得所需人心肌肌钙蛋白I(cTnl)的三条肽段，将获得的 肽段分别与惰性载体蛋白制备成肽段-载体蛋白标记物。同时利用三条肽段作为配体，聚 丙烯酰胺为配基制备的亲和层析柱，将获得的高效价血清进行免疫亲和层析，从而获得针 对该肽段特异性识别的多克隆抗体。该抗体优点是亲和力高于相应单克隆抗体，特异性与 相应单克隆抗体相当，且制备成本低，相对于单克隆抗体制备流程简单。
[0018] 将上述方法筛选获得的抗体分别与羧基聚苯乙烯胶乳微球进行化学固定，将获得 的免疫聚苯乙烯微球与缓冲液制备成试剂1 (免疫乳胶试剂），将肽段-载体蛋白标记物制 备成试剂2 (反应试剂）。
[0019] 具体操作步骤如下：
[0020] 1.肌钙蛋白I(cTnl)不同肽段抗体的制备：
[0021] (1)按常规方法（D.R.马歇克J.T.门永R.R.布格斯等著，朱厚础译.蛋白质纯化 与鉴定实验指南.科技出版社，2000版。）提取自人血清中的肌钙蛋白I(cTnl)肽链，并进 行氨基酸序列测序，所得氨基酸序列（序列1):
[0022] Met Ala Asp gly Ser Ser Asp Ala Ala Arg Glu Pro Arg Pro Ala Pro Ala Pro lie Arg Arg Arg Ser Ser Asn Tyr Arg Ala Tyr Ala Thr Glu Pro His Ala Lys Lys Lys Ser Lys lie Ser Ala Ser Arg Lys Leu Gin Leu Lys Thr Leu Leu Leu Gin lie Ala Lys Gin Glu Leu Glu Arg Glu Ala Glu Glu Arg Arg Gly Glu Lys Gly Arg Ala Leu Ser Thr Arg Cys Gin Pro Leu Glu Leu Ala Gly Leu Gly Phe Ala Glu Leu Gin Asp Leu Cys Arg Gin Leu His Ala Arg Val Asp Lys Val Asp Glu Glu Arg Tyr Asp lie Glu Ala Lys Val Thr Lys Asn lie Thr Glu 工le Ala Asp Leu Thr Gin Lys lie Phe Asp Leu Arg Gly Lys Phe Lys Arg Pro Thr Leu Arg Arg Val Arg lie Ser Ala Asp Ala Met Met Gin Ala Leu Leu Gly Ala Arg Ala Lys Glu Ser Leu Asp Leu Arg Ala His Leu Lys Gin Val Lys Lys Glu Asp Thr Glu Lys Glu Asn Arg Glu Val Gly Asp Trp Arg Lys Asn 工le Asp Ala Leu Ser Gly Met Glu Gly Arg Lys Lys Lys Phe Glu Ser
[0023] (2)利用蛋白水解酶定点水解肌钙蛋白I(cTnl)肽链，采用凝胶排阻色谱法和反 相高效液相色谱法进行肽段分布测定和纯化，收集需要的肽段。
[0024] 1)氨基端肽段：长度为70个氨基酸残基，氨基酸序列在氨基端1~70残基之内 (序列2)
[0025] Met Ala Asp gly Ser Ser Asp Ala Ala Arg Glu Pro Arg Pro Ala Pro
[0026] Ala Pro lie Arg Arg Arg Ser Ser Asn Tyr Arg Ala Tyr Ala Thr Glu Pro His Ala Lys Lys Lys Ser Lys lie Ser Ala Ser Arg Lys Leu Gin Leu Lys Thr Leu Leu Leu Gin lie Ala Lys Gin Glu Leu Glu Arg Glu Ala Glu Glu Arg Arg Gl