一种心肌肌钙蛋白i核酸适配子及其应用、试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明涉及生物【技术领域】，特别涉及一种心肌肌钙蛋白I核酸适配子及其应用、试剂盒。该心肌肌钙蛋白I核酸适配子的核苷酸序列如SEQ?ID?NO：1所示。本发明提供的心肌肌钙蛋白I核酸适配子经过改造后，其与心肌肌钙蛋白I的结合能力很强，且序列短，易于合成，合成成功率高，生产时间短，降低了合成成本，同时能够更有效的了解反应区域。
【专利说明】-种心肌肌钙蛋白I核酸适配子及其应用、试剂盒
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物【技术领域】，特别涉及一种心肌肌钙蛋白I核酸适配子及其应用、 试剂盒。
【背景技术】
[0002] 心血管疾病是当今社会影响人类健康的重要疾病之一，而在心血管疾病中，急性 心肌梗死是造成病人死亡的主要原因。在世界卫生组织建议的急性心肌梗死诊断标准中， 心肌坏死的血清心肌标志物浓度的动态改变是一个非常关键的判断依据，所以现阶段有不 少用于早期心肌损伤血清标志物的诊断试剂。肌钙蛋白是心肌与骨骼肌的收缩调节蛋白， 心肌肌钙蛋白是由心肌肌钙蛋白I (cTnl)、心肌肌钙蛋白C (cTnC)、心肌肌钙蛋白T (cTnT) 三个亚单位组成，而cTnl具有高度的心肌特异性，其对微小心肌损伤检测有特殊临床价 值，可以诊断心肌梗死和心肌细胞损伤，是目前诊断急性心肌梗死的新的"金标准"。现有的 cTnl检测产品大多基于免疫技术，利用抗原抗体反应，但是基于抗体的产品存在较多的局 限性，主要在于抗体本身的稳定均一性、保存环境、生产周期等方面。
[0003] 核酸适配子（适配子/适体，aptamer)，是指通过指数富集的配基系统进化技术 (SELEX)筛选分离得到的一条DNA或者RNA分子，它可以与其靶物质（氨基酸、蛋白质、金属 离子、甚至整个细胞）进行高亲和力、专一性结合。因此，它在生化分析、环境监测、基础医 学、新药的合成及筛选等方面展现出广阔的应用前景。
[0004] 目前，现有的cTnl的核酸适配子即是由SELEX技术筛选得到，主要 包括2条cTnl核酸适配子，其中一个cTnl核酸适配子的序列为：GCTTAATCGA GGGTATCGTGGGGCAGTTGGGAGGG，另一个 cTnl 核酸适配子的序列为：GCCGTCAACATGTCCTAGTAG GGGTCTCAGGGGTG〇
[0005] 然而，在现有的SELEX技术中，由于受制于方法和筛选环境的影响，有的筛选得到 的核酸适配子并不是与靶物质产生作用的最简序列，或者说是关键序列，如果涉及到实际 应用，这样的适配子将会产生一些不必要的合成等方面的浪费，而且也不利于关键结合序 列的分析。因此，提供一种序列短、高亲和力的cTnl核酸适配子具有重要的现实意义。
【发明内容】
[0006] 有鉴于此，本发明提供了一种心肌肌钙蛋白I核酸适配子及其应用、试剂盒。该心 肌肌钙蛋白I核酸适配子经过改造后，其与心肌肌钙蛋白I的结合能力很强，且序列短，易 于合成，合成成功率高，生产时间短，降低了合成成本，同时能够更有效的了解反应区域。
[0007] 为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
[0008] 本发明提供了一种心肌肌钙蛋白I核酸适配子，其核苷酸序列如SEQ ID N0 :1所 /_J、1 〇
[0009] 在本发明中，对现有序列进行简化，去除无关序列，同时为了进一步分析其关键序 列的位置，通过大量的试验和筛选获得简化后的核苷酸序列，其具有固定碱基的位置是结 合心肌肌钙蛋白I的关键位置。获得的简化核苷酸序列和心肌肌钙蛋白I的结合能力与简 化前的结合能力相当，且更易于合成，其序列更短，合成成功率更高，生产时间更短，降低了 合成成本，能更有效的了解反应区域。
[0010] 作为优选，心肌肌钙蛋白I核酸适配子的核苷酸序列如SEQ ID N0 :2所示。
[0011] 作为优选，心肌肌钙蛋白I核酸适配子的核苷酸序列如SEQ ID N0 :3所示。
[0012] 本发明还提供了核苷酸序列如SEQ ID N0 :1所示心肌肌钙蛋白I核酸适配子在非 诊断目的检测肌钙蛋白I中的应用。
[0013] 本发明还提供了核苷酸序列如SEQ ID N0 :2所示心肌肌钙蛋白I核酸适配子在非 诊断目的检测肌钙蛋白I中的应用。
[0014] 本发明还提供了核苷酸序列如SEQ ID N0 :3所示心肌肌钙蛋白I核酸适配子在非 诊断目的检测肌钙蛋白I中的应用。
[0015] 本发明还提供了核苷酸序列如SEQ ID N0 :1所示在肌钙蛋白I纯化中的应用。
[0016] 本发明还提供了核苷酸序列如SEQ ID N0 :2所示在肌钙蛋白I纯化中的应用。
[0017] 本发明还提供了核苷酸序列如SEQ ID N0 :3所示在肌钙蛋白I纯化中的应用。
[0018] 本发明还提供了一种试剂盒，包括如核苷酸序列如SEQ ID N0 :1、核苷酸序列如 SEQ ID N0 :2或核苷酸序列如SEQ ID N0 :3的心肌肌钙蛋白I核酸适配子。
[0019] 本发明提供了一种心肌肌钙蛋白I核酸适配子及其应用、试剂盒。该心肌肌钙蛋 白I核酸适配子的核苷酸序列如SEQ ID N0 :1所示。通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳试 验，结果显示本发明提供的cTnl核酸适配子与cTnl有明显结合现象，但与干扰蛋白无结合 现象；通过抗体夹心法考察本发明提供的cTnl核酸适配子与cTnl蛋白的结合情况，结果显 示本发明提供的cTnl核酸适配子与不同浓度cTnl的孵育产物，吸光度显示出了较大的梯 度，证明本发明提供的cTnl核酸适配子与cTnl有较好的结合，与HSA的结合很少；由表面 等离子体共振法检测cTnl核酸适配子与cTnl的结合常数为8. 32nM?10. 39nM之间，说明 本发明提供的cTnl核酸适配子与目标蛋白cTnl有较高的亲和力，均已经达到nM级别。
[0020] 另外，本发明提供的cTnl核酸适配子还具有如下优势：
[0021] 本发明提供的cTnl核酸适配子序短，易于合成，合成成功率更高；
[0022] 生产时间短，降低了合成成本；
[0023] 更有效的了解反应区域。
【专利附图】
【附图说明】
[0024] 图1实施例3中SEQ ID NO :2、SEQ ID N0 :3所示cTnl核酸适配子与cTnl蛋白结 合情况的电泳图；其中，泳道1示空白对照组泳道，只有cTnl蛋白；泳道2、3示阴性对照组 泳道，泳道2的处理为0· 5 μ g cTnI+100pmol阴性对照，泳道3的处理为1 μ g cTnI+100pmol 阴性对照；泳道4?7示试验组泳道，泳道4的处理为0. 5 μ g cTnI+100pmol SEQ ID NO :2 所示cTnl核酸适配子，泳道5的处理为1 μ g cTnl+lOOpmol SEQ ID NO :2所示cTnl核酸 适配子，泳道6的处理为0. 5 μ gcTnl+lOOpmol SEQ ID NO :3所示cTnl核酸适配子，泳道7 的处理为1 μ g cTnl+lOOpmol SEQ ID NO :3所示cTnl核酸适配子；
[0025] 图2实施例3中第一阳性对照、第二阳性对照与cTnl蛋白结合情况的电泳图；其 中，泳道1示空白对照组泳道，只有cTnl蛋白；泳道2、3示阴性对照组泳道，泳道2的处理 为0. 5 μ g cTnl+lOOpmol阴性对照，泳道3的处理为1 μ g cTnl+lOOpmol阴性对照；泳道 4?7示阳性对照组泳道，泳道4的处理为0. 5 μ g cTnI+ μ g第一阳性对照，泳道5的处理 为1 μ g cTnl+lOOpmol第一阳性对照，泳道6的处理为0. 5 μ g cTnl+lOOpmol第二阳性对 照，泳道7的处理为1 μ g cTnl+lOOpmol第二阳性对照；
[0026] 图3示实施例4中SEQ ID N0 :2所示cTnl核酸适配子与胸腺组蛋白、HSA、IgG、 血红蛋白等干扰蛋白结合情况的电泳图；其中，泳道1的处理为胸腺组蛋白，泳道2的处理 为胸腺组蛋白+SEQ ID N0 :2所示cTnl核酸适配子；泳道3的处理为HSA，泳道4的处理为 HSA+SEQ ID N0 :2所示cTnl核酸适配子；泳道5的处理为IgG，泳道6的处理为IgG+SEQ ID NO :2所示cTnl核酸适配子；泳道7的处理为血红蛋白，泳道8的处理为血红蛋白+SEQ ID NO :2所示cTnl核酸适配子；
[0027] 图4示实施例4中第一阳性对照与胸腺组蛋白、HSA、IgG、血红蛋白等干扰蛋白结 合情况的电泳图；其中，泳道1的处理为胸腺组蛋白，泳道2的处理为胸腺组蛋白+第一阳 性对照；泳道3的处理为HSA，泳道4的处理为HSA+第一阳性对照；泳道5的处理为IgG， 泳道6的处理为IgG+第一阳性对照；泳道7的处理为血红蛋白，泳道8的处理为血红蛋白 +第一阳性对照；
[0028] 图5示实施例1合成的cTnl核酸适配子与cTnl结合的拟合曲线；
[0029] 图6示实施例2合成的cTnl核酸适配子与cTnl结合的拟合曲线。
【具体实施方式】
[0030] 本发明公开了一种心肌肌钙蛋白I核酸适配子及其应用、试剂盒，本领域技术人 员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动 对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用 已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
【发明内容】
、精神和范围内对 本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0031] 本发明提供的心肌肌钙蛋白I核酸适配子及其应用、试剂盒中所用试剂和仪器均 可由市场购得。其中，本发明中所有单链DNA由上海生工合成；cTnl抗原可由原核表达纯 化获得，也可从市场上购得（Hytest);试验中所用试剂均购自sigma公司。
[0032] 下面结合实施例，进一步阐述本发明：
[0033] 实施例1 cTnl核酸适配子的合成
[0034] 由上海生工合成序列如SEQ ID N0 :2所示的cTnl核酸适配子。
[0035] 实施例2 cTnl核酸适配子的合成
[0036] 由上海生工合成序列如SEQ ID N0 :3所示的cTnl核酸适配子。
[0037] 实施例3电泳检测cTnl核酸适配子与cTnl的结合情况
[0038] 取实施例1、2合成的cTnl核酸适配子进行与cTnl的结合试验，考察实施例1、2 合成的cTnl核酸适配子与cTnl的结合能力。
[0039] 1、实验设计
[0040] 试验分为试验组和对照组。
[0041] 试验组为：0· 5μ g cTnI+100pmol SEQ ID N0 :2 所示 cTnl 核酸适配子、1μ g cTnI+100pmolSEQIDN0:2所示cTnI核酸适配子、0·5μgcTnI+100pmolSEQIDN0 :3所 示cTnl核酸适配子、lug cTnl+lOOpmol SEQ ID腸：3所示〇1']11核酸适配子。
[0042] 对照组分为空白对照组、阴性对照组和阳性对照组：
[0043] a、空白对照组不加任何核苷酸序列，只有cTnl蛋白；
[0044] b、阴性对照组为：0· 5μ g cTnI+100pmol 阴性对照、1 μ g cTnI+100pmol 阴性对照。 其中阴性对照的核苷酸序列如SEQ ID NO :4所示，其不会与cTnl结合；
[0045] c、阳性对照组为：0· 5 μ g cTnI+100pmol 第一阳性对照、1 μ g cTnI+100pmol 第一 阳性对照、〇. 5μ g cTnI+100pmol第二阳性对照、1 μ g cTnI+100pmol第二阳性对照。其中， 第一阳性对照、第二阳性对照为现有的2个cTnl核酸适配子，第一阳性对照的序列如SEQ ID N0 :5所示，第二阳性对照的序列如SEQ ID N0 :6所示，第一阳性对照、第二阳性对照与 cTnl的结合能力强。
[0046] 2、具体操作
[0047] 分别取实施例1、2合成的cTnl核酸适配子、阴性对照、第一阳性对照、第二阳性对 照，95°C变性10分钟，然后迅速插入冰中10分钟，加入结合缓冲液。按照上述实验设计分 别加入0. 5、1 μ g的cTnl，37°C孵育10分钟。上样到非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染观 察结果。非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳配制方法：15mL体系，30% Acr-bis 6mL，5倍TB缓冲 液3mL，超纯水5.85mL，10%过硫酸铵0.15mL，TEMED15μL。电泳缓冲液（lL) :Tris-base3 克，甘氨酸14. 4克，调至pH8. 3。
[0048] 3、结果分析
[0049] 电泳结果见图1、图2。由图1、图2可知，实施例1、2合成的cTnl核酸适配子、第 一阳性对照、第二阳性对照与cTnl均有明显结合现象。而将单独的cTnl蛋白，以及与阴性 对照序列孵育的cTnl蛋白进行电泳，其泳道内未出现阻滞现象，即无结合反应发生。
[0050] 实施例4电泳检测cTnl核酸适配子与干扰蛋白的结合情况
[0051] 取实施例1合成的cTnl核酸适配子、实施例3中第一阳性对照（序列如SEQID N0 : 5所示），分别进行与胸腺组蛋白、HSA、IgG、血红蛋白等干扰蛋白的结合试验，考察实施例 1合成的cTnl核酸适配子、实施例3中第一阳性对照与干扰蛋白的结合能力。具体操作如 下：
[0052] 取实施例1合成的cTnl核酸适配子分别与胸腺组蛋白、HSA、IgG、血红蛋白进行孵 育，37°C孵育10分钟，将孵育产物上样到非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，考马斯亮蓝染色观 察结果。同时设置胸腺组蛋白、HSA、IgG、血红蛋白做为对照。电泳结果见图3。
[0053] 取实施例3中第一阳性对照分别与胸腺组蛋白、HSA、IgG、血红蛋白进行孵育， 37°C孵育10分钟，将孵育产物上样到非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，考马斯亮蓝染色观察结 果。同时设置胸腺组蛋白、HSA、IgG、血红蛋白做为对照。电泳结果见图4。
[0054] 由图3、4可以看出，实施例1合成的cTnl核酸适配子、实施例3中第一阳性对照 与胸腺组蛋白、HSA、IgG、血红蛋白等干扰蛋白的孵育产物，与单纯的胸腺组蛋白、HSA、IgG、 血红蛋白相比，其电泳结果并无差异，可见这两序列与干扰蛋白并无结合反应。
[0055] 取实施例2合成的cTnl核酸适配子，进行与胸腺组蛋白、HSA、IgG、血红蛋白等干 扰蛋白的结合试验，考察实施例2合成的cTnl核酸适配子与干扰蛋白的结合能力。结果与 实施例1合成的cTnl核酸适配子的电泳结果相似，同样与干扰蛋白无结合反应。
[0056] 实施例5抗体夹心法检测cTnl核酸适配子与cTnl的结合情况
[0057] 试验设计：取实施例1、2合成的cTnl核酸适配子，和实施例3中第一阳性对照、第 二阳性对照、阴性对照，采用抗体夹心法考察这些序列与cTnl蛋白的结合情况，具体试验 操作如下：
[0058] 取实施例1合成的cTnl核酸适配子，经在3 '端标记生物素、连接10个T碱 基，得到生物素化的cTnl核酸适配子。在酶标板上包被一层亲和素，然后将生物素化的 cTnl核酸适配子与包被的亲和素孵育，洗涤后将不同浓度梯度（1μ g/mUlXKTb g/mL、 1 X 10 2 μ g/mL、1 X 10 3 μ g/mL、1 X 10 4 μ g/mL、1 X 10 5 μ g/mL、1 X 10 6 μ g/mL、0 μ g/mL)的 cTnl加入进行反应，洗涤后加入cTnl的单克隆抗体，洗涤后再加入标记了辣根过氧化物酶 的二抗，最后TMB系统显色，检测吸光度。
[0059] 作为对照，采用上述相同的方法，考察了第一阳性对照、第二阳性对照、阴性对照 序列与cTnl蛋白的结合情况。
[0060] 结果如表1所示。
[0061] 表1序列与cTnl蛋白的结合情况
[0062]
【权利要求】
1. 一种心肌肌钙蛋白I核酸适配子，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示。
2. 根据权利要求1所述的心肌肌钙蛋白I核酸适配子，其特征在于，其核苷酸序列如 SEQ ID NO :2 所示。
3. 根据权利要求1所述的心肌肌钙蛋白I核酸适配子，其特征在于，其核苷酸序列如 SEQ ID NO :3 所示。
4. 如权利要求1至3中任一项所述的心肌肌钙蛋白I核酸适配子在非诊断目的检测肌 钙蛋白I中的应用。
5. 如权利要求1至3中任一项所述的心肌肌钙蛋白I核酸适配子在肌钙蛋白I纯化中 的应用。
6. -种试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1至3中任一项所述的心肌肌钙蛋白I核 酸适配子。
【文档编号】G01N33/68GK104195141SQ201410468490
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2014年9月15日 优先权日:2014年9月15日
【发明者】刘振华 申请人:三诺生物传感股份有限公司